1、瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 唐琳CONTENTS原理原理步驟步驟注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)原理電泳電泳 帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相反的帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)，稱(chēng)為電極移動(dòng)，稱(chēng)為電泳電泳(electrophoresis, EP)。利用。利用帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱(chēng)為稱(chēng)為電泳技術(shù)電泳技術(shù)。原理瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 用用瓊脂糖瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳技術(shù)。作支持介質(zhì)的一種電泳技術(shù)。瓊脂糖瓊脂糖 一種線性多聚物。在水中一般加熱到一種線性多聚物。在水中一般加熱到90以以上溶解，溫度下降到上溶解，溫度下降

2、到35-40時(shí)形成良好的半固體時(shí)形成良好的半固體狀的凝膠，這是它具有多種用途的主要特征和基礎(chǔ)。狀的凝膠，這是它具有多種用途的主要特征和基礎(chǔ)。原理 瓊脂糖凝膠具有瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。原理物質(zhì)物質(zhì)：小于孔徑的物質(zhì)可以快速通過(guò)，而大于孔徑：小于孔徑的物質(zhì)可以快速通過(guò)，而大于孔徑的物質(zhì)則會(huì)受到阻力。其結(jié)果是可以區(qū)分的物質(zhì)則會(huì)受到阻力。其結(jié)果是可以區(qū)分不不同大小同大小的分子。的分子。濃度濃度：凝膠的：凝膠的濃度濃度不同，形成的孔徑大小也就不同。不同，形成的孔徑大小也就不同。 濃度越大，孔徑越小。濃度越大，孔徑越小。 瓊脂糖凝膠電泳現(xiàn)主要應(yīng)用于瓊脂糖凝膠電泳現(xiàn)主要應(yīng)用于核酸核酸研究中。研究

3、中?！胺肿雍Y效應(yīng)分子篩效應(yīng)”原理核酸核酸 由許多由許多核苷酸核苷酸聚合成的生物大分子化合物，一聚合成的生物大分子化合物，一個(gè)核苷酸分子是由一分子含氮的個(gè)核苷酸分子是由一分子含氮的堿基堿基、一分子、一分子五碳五碳糖糖和一分子和一分子磷酸磷酸組成的。組成的。原理核酸的兩性解離核酸的兩性解離 核酸既含有呈酸性的磷酸基團(tuán)，又含有呈弱堿核酸既含有呈酸性的磷酸基團(tuán)，又含有呈弱堿性的堿基，故為性的堿基，故為兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì)，可發(fā)生兩性解離。，可發(fā)生兩性解離。 其解離狀態(tài)隨溶液的其解離狀態(tài)隨溶液的pH而改變。當(dāng)核酸分子而改變。當(dāng)核酸分子的酸性解離和堿性解離程度相等，所帶的正電荷與的酸性解離和堿性解離程度相

4、等，所帶的正電荷與負(fù)電荷相等，此時(shí)核酸溶液的負(fù)電荷相等，此時(shí)核酸溶液的pH就稱(chēng)為就稱(chēng)為等電點(diǎn)等電點(diǎn)（isoelectric point, 簡(jiǎn)稱(chēng)簡(jiǎn)稱(chēng)pI）。）。OCH2HHOHHOHHONNONH2POOHOCMPpKa2=4.5-OCH2HHOHHOHHONNONH2POOOCMPpKa3=6.4-pI =CMPpKa1+pKa22=0.8+4.52= 2.65OCH2HHOHHOHHONNONH2POOHOCMPpKa1=0.80H+-OCH2HHOHHOHHONNONH2POOHHOCMP+H+原理胞嘧啶核苷酸胞嘧啶核苷酸(CMP)(CMP)的解離的解離 原理根據(jù)核酸的解離性質(zhì)，用根據(jù)核酸

5、的解離性質(zhì)，用中性或偏堿性中性或偏堿性的緩沖液的緩沖液使核酸解離成使核酸解離成陰離子陰離子，置于電場(chǎng)中便向陽(yáng)極移動(dòng)。，置于電場(chǎng)中便向陽(yáng)極移動(dòng)。DNA屬于屬于堿穩(wěn)定性堿穩(wěn)定性物質(zhì)物質(zhì) 核酸都帶核酸都帶負(fù)電負(fù)電，在電場(chǎng)中沿同一方向，在電場(chǎng)中沿同一方向移動(dòng)，再利用移動(dòng)，再利用“分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)”，就可用，就可用電泳的方法將不同大小的核酸分離開(kāi)來(lái)。電泳的方法將不同大小的核酸分離開(kāi)來(lái)。CONTENTS原理原理步驟步驟注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)步驟1.電泳緩沖液電泳緩沖液常見(jiàn)的核酸電泳緩沖液有：常見(jiàn)的核酸電泳緩沖液有：TAE、TBE、TPE等。一等。一般選取般選取TAE，配為，配為50 x濃度，用前需稀釋為濃度

6、，用前需稀釋為1x。作用：作用：緩沖液在電泳過(guò)程中的一個(gè)作用是緩沖液在電泳過(guò)程中的一個(gè)作用是維持合適的維持合適的pH。電泳緩沖液的另一個(gè)作用是使溶液具有一定的電泳緩沖液的另一個(gè)作用是使溶液具有一定的導(dǎo)電導(dǎo)電性性，以利于核酸分子的遷移。，以利于核酸分子的遷移。電泳緩沖液還有一個(gè)組分是電泳緩沖液還有一個(gè)組分是EDTA，目的是螯合，目的是螯合Mg2+ 等離子，防止電泳時(shí)激活等離子，防止電泳時(shí)激活DNA酶，此外還可防酶，此外還可防 止鎂離子與核酸生成沉淀。止鎂離子與核酸生成沉淀。步驟2.瓊脂糖凝膠的制作瓊脂糖凝膠的制作 分離不同大小的分離不同大小的DNA片段所用的片段所用的最適凝膠濃度最適凝膠濃度是不

7、是不同的，數(shù)據(jù)見(jiàn)下表。同的，數(shù)據(jù)見(jiàn)下表。 凝膠濃度（%）線性DNA長(zhǎng)度（bp）0.51000300000.7800120001.0500100001.240070001.520030002.0502000步驟DNA樣品為200-2000bp。用作配膠的溶液應(yīng)與電泳緩沖液完全一致。注意：制膠過(guò)程中應(yīng)加入注意：制膠過(guò)程中應(yīng)加入EB（溴化乙錠）（溴化乙錠），是一種，是一種高度靈敏的熒光染色劑，用于觀察瓊脂糖和聚丙烯酰高度靈敏的熒光染色劑，用于觀察瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的胺凝膠中的DNA。溴化乙錠可以嵌入堿基分子中溴化乙錠可以嵌入堿基分子中,導(dǎo)導(dǎo)致錯(cuò)配，可能具有高致癌性。注意做好防護(hù)措施。致錯(cuò)配，可

8、能具有高致癌性。注意做好防護(hù)措施。步驟步驟3.電泳電泳步驟（1）點(diǎn)樣）點(diǎn)樣 樣品已制備，加入點(diǎn)樣孔中。如有氣泡，應(yīng)樣品已制備，加入點(diǎn)樣孔中。如有氣泡，應(yīng)輕輕趕出。輕輕趕出。（2）電泳）電泳 確定正負(fù)極，接通電源開(kāi)始電泳。樣品中已加確定正負(fù)極，接通電源開(kāi)始電泳。樣品中已加入入loading buffer，可以指示樣品的位置。，可以指示樣品的位置。4.照膠、結(jié)果分析照膠、結(jié)果分析步驟 溴化乙錠用標(biāo)準(zhǔn)溴化乙錠用標(biāo)準(zhǔn)302nm 紫外光紫外光透射儀激發(fā)并透射儀激發(fā)并放射出橙紅色信號(hào)，可用放射出橙紅色信號(hào)，可用Polaroid 底片或帶底片或帶CCD 成像頭的凝膠成像處理系統(tǒng)拍攝。成像頭的凝膠成像處理系統(tǒng)拍攝。步驟CONTENTS原理原理步驟步驟注意