1、羅格列酮對糖尿病大鼠腎臟病理的影響及其機制探討【摘要】 目的 探討過氧化物酶體增殖物激活受體 PPAR激動劑羅格列酮對2 型糖尿病大鼠腎臟病理影響及其機制。方法 正常飲食的大鼠 10 只作為正常對照組，35 只高脂高糖飲食加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素 35 mg/kg 制備 2 型糖尿病大鼠模型，將成型的大鼠隨機分為羅格列酮干預(yù)組 10 只，糖尿病非干預(yù)組 9 只。羅格列酮(3mg/kg 灌胃)干預(yù) 12 周后處死大鼠，取血、尿、腎臟標(biāo)本，檢測空腹血糖、空腹胰島素、血脂及胰島素敏感指數(shù)。光學(xué)顯微鏡觀察腎小球形態(tài)及測定腎小球截面積、腎小球基質(zhì)面積、系膜增生評分 。結(jié)果 與正常組比較，羅格列酮干預(yù)組

2、血糖、血脂、腎小球截面積、腎小球基質(zhì)面積、胰島素敏感性差異無統(tǒng)計學(xué)意義;糖尿病非干預(yù)組血糖、血脂、腎小球截面積、腎小球基質(zhì)面積明顯增高(P0.05)，胰島素敏感性明顯降低(P16.5mmol/L 作為糖尿病成型標(biāo)準(zhǔn)。糖尿病大鼠成型共 19 只,再將其隨機分為兩組：B 組(糖尿病+RGZ 干預(yù) 3mg/kg 灌胃，10 只)，C 組(糖尿病非干預(yù)組，9 只)。1.2 標(biāo)本收集干預(yù) 12 周終止實驗，處死前一天收集尿液，次日，用 3%的戊巴比妥腹腔注射麻醉，剖腹，心內(nèi)采血，取雙側(cè)腎臟標(biāo)本，鹽水洗滌，稱重。部分組織以10%中性福爾馬林液固定用于病理切片。1.3 觀察指標(biāo)1.3.1 生化指標(biāo)：血糖(B

3、G)、血脂用全自動生化分析儀測定;空腹胰島素(INS)采用放射免疫法測定;胰島素敏感指數(shù)(ISI)=1/(INSBG)。1.3.2 組織病理學(xué)觀察：10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，制成 4m厚切片，行 HE、PAS 染色，光鏡下觀察腎臟病理改變。PAS 結(jié)果評估標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核呈藍(lán)色，基底膜呈紅色，腎小球基質(zhì)呈紅色。圖像分析均采用 Image-ProPlus5.0 醫(yī)學(xué)生物軟件分析。1)將 PAS 染色的腎組織切片置于光鏡下，放大 40 倍，每張切片隨機選取20 個完整腎小球(包括尿極及血管極)，測量腎小球截面積、腎小球基質(zhì)面積、腎小球基質(zhì)面積/腎小球截面積(腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的相對面積)，計算

4、 20 個腎小球面積、腎小球基質(zhì)面積、腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的相對面積，均值作為該片的參數(shù)值，最后以每組的均值進(jìn)行比較。2)腎小球系膜增生分級計分：每張片子隨機選取 20 個腎小球，每個腎小球按標(biāo)準(zhǔn)計分，然后取 20 個記分的均值作為該片腎小球系膜增生分級數(shù)。0 級：正常腎小球(記 0 分);I 級：增生的系膜組織對腎小球毛細(xì)血管袢無明顯影響，系膜增生寬度小于毛細(xì)血管直徑，呈節(jié)段性分布(記 2 分);II 級：增生的系膜組織對腎小球毛細(xì)血管袢有一定的壓迫和破壞作用，系膜增生寬度大于毛細(xì)血管直徑，呈彌漫性分布(記 4 分);III 級：增生的系膜組織對腎小球毛細(xì)血管袢有一定的壓迫和破壞作用，系膜增生呈

5、結(jié)節(jié)或團(tuán)塊狀的實性區(qū)，彌漫分布階段性加重，伴有球囊黏連(記 6 分)。1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用 SPSS11.5 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。計量資料均以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組資料比較采用 t 檢驗，以 P0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 各組大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素敏感性比較 (表 1)與對照組 A 組相比，C 組血糖增高顯著(P0.01),且胰島素敏感性下降明顯(P0.01),而 B 組血糖、胰島素敏感性與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表 1 各組空腹血糖、胰島素、ISI 的改變(略)與 A 組比較*P0.012.2 各組大鼠血脂的比較(表 2)與對照組 A 組相比，B 組、C 組

6、膽固醇、低密度脂蛋白無顯著改變;C 組甘油三酯升高明顯(P0.05),C 組高密度脂蛋白降低顯著(P0.01)。表 2 各組血脂的改變(略)與 A 組比較* P0.05，*P0.012.3 各組大鼠腎臟形態(tài)學(xué)變化的比較(圖 1，見封 3)與對照組 A 組相比，C 組腎臟病理改變具有以下特點：1) 腎小球病變：腎小球體積增大，結(jié)節(jié)性、彌漫性腎小球硬化，腎小球系膜區(qū)部分、彌漫性增寬，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚普遍、彌漫性存在，但系膜細(xì)胞增生不明顯，可見 Kimmelstiel-Wilson 結(jié)節(jié)(K-W 結(jié)節(jié))。2) 腎小囊病變：腎小球毛細(xì)血管袢與腎小囊壁層黏連融合，腎小囊內(nèi)有蛋白物質(zhì)沉積。3) 腎

7、小管病變：腎小管上皮細(xì)胞腫脹，管腔增大，嚴(yán)重者細(xì)胞崩解上皮細(xì)胞脫落至管腔;上皮細(xì)胞細(xì)胞核消失，胞漿淺淡遍布微小空泡或有邊界清晰的巨大空泡;在遠(yuǎn)曲小管和集合管可見大量蛋白管型。4) 腎間質(zhì)病變不明顯，未見間質(zhì)纖維化。5)腎血管病變不明顯，未見小動脈管壁增厚。B 組與 C 組比較，各種病理改變較輕。2.4 各組大鼠腎臟切片 PAS 染色圖象定量分析結(jié)果(表 3)與 A 組比較，C 組的腎小球截面積、腎小球基質(zhì)面積、基質(zhì)面積比(腎小球細(xì)胞外基質(zhì) ECM 的相對面積)明顯增高(P0.01);B 組的腎小球截面積、腎小球基質(zhì)面積、基質(zhì)面積比(腎小球細(xì)胞外基質(zhì) ECM 的相對面積)與正常組差異無統(tǒng)計學(xué)意義

8、。說明 RGZ 干預(yù)能減少腎小球系膜基質(zhì)增生，改善腎臟病理損害。表 3 各組大鼠腎臟病理切片 PAS 染色圖象定量分析(略)與 A 組比較*P0.012.4.2 腎小球系膜增生分級積分比較圖 2 腎小球系膜增生分級積分(略)3 討論糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是最常見的全身微血管并發(fā)癥，其發(fā)病機制尚未闡明。DN 的發(fā)生與糖代謝紊亂、腎臟血液動力學(xué)改變、多種細(xì)胞因子以及遺傳因素有密切關(guān)系，并與 DN 病理呈正相關(guān)。DN 損害腎臟的所有結(jié)構(gòu)，從腎小球、腎血管、腎小管及間質(zhì),但其中只有腎小球硬化癥為糖尿病特征性病變。腎組織早期的病理改變?yōu)槟I小球肥大、ECM 集聚、基底

9、膜增厚，晚期出現(xiàn)彌漫性腎小球硬化，導(dǎo)致腎功能衰竭。本實驗證明早期 DN 腎小球、腎小管病理改變較明顯，出現(xiàn)結(jié)節(jié)性、彌漫性腎小球硬化，腎小球系膜區(qū)部分、彌漫性增寬，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚普遍、彌漫性存在，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性、大量蛋白管型。但早期 DN 間質(zhì)及血管病理改變不明顯。北美糖尿病控制與并發(fā)癥試驗(DCCT)和英國糖尿病前瞻性研究(UKPDS)證明了長期高血糖是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生的重要因素，通過強化治療使血糖正?；蚪咏？捎行Х乐够蜓泳?1、2 型糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。而高血糖的根本原因是 IR，RGZ 針對 2 型糖尿病的病理生理基礎(chǔ) IR，稱之為真正意義上的胰

10、島素增敏劑1。近年的研究對 TZD 改善 IR 機制已有了較深入的認(rèn)識：(1)增強胰島素信號的傳導(dǎo)、降低血糖及胰島素水平。TZD 使 PPAR活化可增加葡萄糖轉(zhuǎn)運子(GLUT-4)、磷脂酰肌醇 3-激酶(PI-3k)的表達(dá)，增強了胰島素在細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)更多的 GLUT-4 向細(xì)胞表面移動，增強組織對葡萄糖的攝取，從而降低血糖、胰島素水平2。(2)促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化，調(diào)解脂質(zhì)代謝,改變脂肪的分布。前脂肪細(xì)胞表面僅有少量胰島素受體，而分裂期后的脂肪細(xì)胞含有大量的胰島素受體。TZD 使 PPAR活化可促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞的分化，使小脂肪細(xì)胞的數(shù)量增加，大脂肪細(xì)胞的數(shù)量減少，增加小脂肪細(xì)胞/大脂肪

11、細(xì)胞，小脂肪細(xì)胞對胰島素的反應(yīng)性較強，有助于增加葡萄糖的攝取;TZD 使 PPAR活化后可誘導(dǎo)乙酰 CoA 合成酶、脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白酶脂蛋白脂酶和脂肪酸結(jié)合蛋白的表達(dá)增加，使轉(zhuǎn)運致肌肉和肝臟的脂肪酸減少，最終導(dǎo)致甘油三脂在外周組織的分解，增加其在脂肪組織的合成，增強胰島素的敏感性;另外，還可改變脂肪的分布，使內(nèi)臟、骨骼肌的脂肪流向皮下，這些變化均能改善 IR3-4。(3)脂肪細(xì)胞中 PPAR活化對內(nèi)分泌有調(diào)節(jié)作用?；罨?PPAR使脂肪細(xì)胞分泌的兩個起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(TNF)和瘦素(Leptin)水平下降5-6，減少IR;還增加脂肪細(xì)胞線粒體解偶聯(lián)蛋白 UCP1、UCP27(全身能

12、量利用的重要調(diào)節(jié)因子)的表達(dá)而促進(jìn)能量消耗，降低血脂 、血糖水平。(4)促進(jìn)骨骼肌代謝。TZD 激活 PPAR可促進(jìn) L6 肌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運8，直接促進(jìn)骨骼肌對葡萄糖的利用。(5)可明顯增加 db/db 鼠的胰島面積、數(shù)量和胰島素含量，阻止胰島細(xì)胞衰退9。通過 3 個月 RGZ 的干預(yù)治療，本實驗結(jié)果顯示，干預(yù)組血糖、甘油三酯顯著下降,高密度脂蛋白及胰島素敏感指數(shù)明顯升高，腎臟病理結(jié)構(gòu)得到改善，而與正常組對照差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明 RGZ 羅格列酮能降低血糖、調(diào)解血脂、改善胰島素抵抗，從而延緩 2 型糖尿病微血管并發(fā)癥糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。目前 RGZ 對腎臟作用研究僅限于體外實驗及動物模型,

13、在人體研究、臨床科研方面,累積資料尚少,有待于進(jìn)一步探索?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 吳靜,雷閩湘.胰島素抵抗與 2 型糖尿病關(guān)系的新思考J. Medicineand Philosophy,2004,25(2):4-5.2 Rieusset J，Chambrier C，Bouzakri K，et al.The expression ofthe p85 alphaSubunit of phosphatidylinositol3-kinase is induced byactivation of the peroxisome proliferator activated receptor gamma inhu

14、min adipocytesJ.Diabetologia,2001,44:544.3 高燁.PPAR激動劑的病理生理及臨床應(yīng)用J.陜西醫(yī)學(xué)雜志,2004,33(6):493.4 Kageyama H，Hirano T，et al.Lipopr0tein lipase mRNA in whiteadipose tissue but not in skeletal muscle in increased bypioglitazone through PPAR-gammaJ.Biochem Res Commun,2003,305:22-27.5 Kumar S，Moreno V，Gioia-patr

15、icola，Guino E，et al. Evidencefor Enhanced Adipogenesis in the Orbits of Patients with GravesOphthalmopathyJ. Clin Endocrinol Metab，2004,89：930 - 935.6 Hong G，Davis B，Khatoon N Baker S F，Brown J. PPAR gamma-dependent anti-inflammatory action of rosiglitazone in humanmonocytes：suppression of TNF alpha secretion is not mediated by PTENregulationJ.Biochem Biophys Res Commun，2003,303(3):782-787.7 Xiao XO，Grove Kl,Grayson BE，et al. Inhibition of UncouplingProtein Expression during Lactation：Role ofLep