1、嘌呤霉素Puromycin編碼品名規(guī)格單位北京華越洋生物GT001304-25mgGT001304-10ml嘌呤霉素（Puromycin）嘌呤霉素（Puromycin）25mg10ml瓶瓶嘌呤霉素Puromycin作用機(jī)制：嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑鏈霉菌（Streptomyces alboniger）發(fā)酵代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，嘌呤霉素Puromycin通過(guò)抑制蛋白質(zhì)合成而殺死革蘭氏陽(yáng)性菌，各種動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞。嘌呤霉素Puromycin某種特殊情況下有效作用大腸桿菌。嘌呤霉素Puromycin作為氨酰-tRNA分子3末端的類似物，能夠與核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈

2、中。但是嘌呤霉素同A位點(diǎn)結(jié)合后，不會(huì)參與隨后的任何反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。 嘌呤霉素Puromycin抗性基因： 對(duì)嘌呤霉素的抗性取決于編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAC)的 Pac基因，遺傳工程研究使用的Pac基因分離自嘌呤霉素產(chǎn)生菌Streptomyces alboniger。 嘌呤霉素Puromycin最普遍應(yīng)用：1）嘌呤霉素如今普遍應(yīng)用于篩選和維持培養(yǎng)含Pac基因的哺乳動(dòng)物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。嘌呤霉素在細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選中的普遍應(yīng)用與慢病毒載體的特性有關(guān)，現(xiàn)在商業(yè)化的慢病毒載體多數(shù)都攜帶pac基因。2）在某些特定情況下，嘌呤霉素亦可以用來(lái)篩選轉(zhuǎn)

3、化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。 化學(xué)特性：化學(xué)名稱：3 (a -Amino-p-methoxyhydro cinnamamido)- 3deoxy- N,Ndimethyladenosine·2HClCAS No.：58-58.2， 分子式：C22 H29 N7 O5 .2HCl， 分子量：544.43 g/mol純度：98%（HPLC）,易溶于水5-50mg/mL，-20度保存。嘌呤霉素Puromycin應(yīng)用濃度：哺乳動(dòng)物細(xì)胞的推薦使用濃度為1-10 g/mL，最佳濃度需要?dú)缜€來(lái)確定。LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125g/mL。使用嘌呤霉素篩

4、選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié)，而且受宿主細(xì)胞本身的影響。嘌呤霉素Puromycin使用步驟：（哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選）嘌呤霉素殺滅曲線的確定（shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，僅作參考）嘌呤霉素Puromycin為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)待研究shRNA的細(xì)胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的最低濃度嘌呤霉素至關(guān)重要。所以初次做實(shí)驗(yàn)的客戶一定要建立適合自己體系的殺死曲線（kill curve） 。（1）24孔板內(nèi)以58 x 104 cells/孔的密度鋪板，鋪?zhàn)銐蛄康目滓赃M(jìn)行后續(xù)的梯度實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞孵育過(guò)夜；（2）準(zhǔn)備篩選培養(yǎng)基-含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基（如0-15g/mL，至少5個(gè)梯度）；（3）細(xì)胞孵育過(guò)夜

5、后加入篩選培養(yǎng)基，孵育細(xì)胞；（4）約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基；（5）每日監(jiān)測(cè)細(xì)胞觀察存活細(xì)胞比例。嘌呤霉素的最佳作用時(shí)間一般在1-4天之間。（6）最小的抗生素使用濃度就是指從抗生素篩選開(kāi)始1-4天內(nèi)殺死所用細(xì)胞的最低篩選濃度。嘌呤霉素Puromycin篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞（1）day 0：24孔板內(nèi)以58 x 104 cells/孔的密度鋪板，孵育過(guò)夜；（2）制備篩選培養(yǎng)基：含有最佳篩選濃度嘌呤霉素（由殺滅曲線確定）的新鮮培養(yǎng)基；（3）day 1：篩選第一天，去除舊的培養(yǎng)基，加入一定量MOI的病毒顆粒；（加入無(wú)血清培養(yǎng)基的總量必須充分覆蓋住細(xì)胞。）（4）病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后約6-8h，再添加1ml完全培

6、養(yǎng)基（血清和雙抗，如果已經(jīng)使用雙抗。）到細(xì)胞內(nèi)，然后孵育過(guò)夜；（5）病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后48h，使用嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基替換舊的完全培養(yǎng)基。孵育。（6）約每2-3天替換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基；（7）每天檢測(cè)細(xì)胞并觀察活細(xì)胞生長(zhǎng)比例，以及turboGFP表達(dá)的水平及所占比例。在某一個(gè)時(shí)間點(diǎn)幾乎所用存活細(xì)胞都可以表達(dá)TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用時(shí)間在3-10天之間。注：病毒的MOI越高，每個(gè)細(xì)胞含有的shRNA拷貝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素篩選時(shí)，需記住越高M(jìn)OI,含越多pac拷貝的細(xì)胞能耐受更高的嘌呤霉素濃度。調(diào)整嘌呤霉素的濃度去篩選預(yù)定量的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，但是嘌呤霉素的量不能低于殺死曲線建立的最

7、低濃度。嘌呤霉素Puromycin儲(chǔ)存方法和穩(wěn)定性：嘌呤霉素穩(wěn)定性高，可以常溫運(yùn)輸，收到產(chǎn)品后4存放；嘌呤霉素在室溫條件下可存放3個(gè)月，4條件下保質(zhì)期一年。為了達(dá)到最理想的穩(wěn)定狀態(tài)和最長(zhǎng)的保質(zhì)期，最好存放于-20°C，保質(zhì)期為2年。嘌呤霉素Puromycin應(yīng)用文獻(xiàn)： 1.為了說(shuō)明Parp1基因和ADP核糖多聚體位于Dnmt1啟動(dòng)子上和說(shuō)明Parp1能夠保護(hù)自己的非甲基化狀態(tài)，向培養(yǎng)基中加入2g/mL的嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株，質(zhì)粒為 pBabe-puro（Addgene公司）；2.為了研究生化信號(hào)通路能夠在嘈雜的分子環(huán)境下傳遞信息，采用6ug/mL的puromycin進(jìn)行細(xì)胞篩選。3.為

8、了研究IRP2（離子調(diào)控蛋白2）特定的73個(gè)氨基酸插入與該蛋白致瘤特性的關(guān)系，采用2µg/ml 的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人H1299肺癌細(xì)胞系。4.為了證實(shí)在p53缺失的細(xì)胞中，被O-GlcNAc修飾的IKK的催化活性有所增強(qiáng)，使用了1g/ml的嘌呤霉素來(lái)篩選感染腺病毒（載體為pBabe HA-IKK wild type）的細(xì)胞。5.為研究跨膜交互作用在KAI1/CD82介導(dǎo)的對(duì)癌癥侵入和轉(zhuǎn)移的抑制作用中所發(fā)揮的角色，使用2g/ml的嘌呤霉素用于篩選穩(wěn)定的Du145-sh2和-sh3轉(zhuǎn)導(dǎo)子，并用1g/ml的嘌呤霉素維持培養(yǎng) （pSIREN-RetroQ 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染）。 6.為了研究Per1在調(diào)節(jié)肝臟對(duì)四氯二苯并-p-二惡英反應(yīng)中的作用，使用了4g/ml的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染腺病毒的 Hepa1c1c7細(xì)胞，腺病毒載體為 pSilencer 5.1-U6 Retro Vector (Applied Biosystems/Ambion)。