1、Page 1LOGOE. Molina Grima, A. Robles Medina*, A. Gimnez Gimnez & M. J. Ibnez Gonzlez濕態(tài)三角褐指藻濕態(tài)三角褐指藻UTEX 640中大規(guī)模中大規(guī)模提取十二碳五烯酸提取十二碳五烯酸(EPA)的研究的研究組長：葛鵬鵬組長：葛鵬鵬文獻(xiàn)：帖航文獻(xiàn)：帖航翻譯：張軒昂，劉巖，張強(qiáng)利翻譯：張軒昂，劉巖，張強(qiáng)利PPT：賈冬冬：賈冬冬2EPA即全順式即全順式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸是一種多不飽和脂二十碳五烯酸是一種多不飽和脂肪酸，屬于肪酸，屬于-3族多烯長鏈脂肪酸，無色，無味，常溫下以液態(tài)形族多烯長鏈脂肪酸

2、，無色，無味，常溫下以液態(tài)形式存在，易溶于有機(jī)溶劑。具有重要的生物學(xué)功能，在預(yù)防和治式存在，易溶于有機(jī)溶劑。具有重要的生物學(xué)功能，在預(yù)防和治療人類的心腦血管疾病、抗腫瘤、抑制肥胖、抗炎癥等方面具有療人類的心腦血管疾病、抗腫瘤、抑制肥胖、抗炎癥等方面具有重要的作用。重要的作用。三角褐指藻常見的形態(tài)有卵形，梭形和三出放射形，這三種形態(tài)三角褐指藻常見的形態(tài)有卵形，梭形和三出放射形，這三種形態(tài)在不同的生長環(huán)境下可以相互轉(zhuǎn)變。三角褐指藻的生長條件：在不同的生長環(huán)境下可以相互轉(zhuǎn)變。三角褐指藻的生長條件：（1）三角褐指藻對鹽度的適應(yīng)范圍很廣）三角褐指藻對鹽度的適應(yīng)范圍很廣0.9-9.2%，最適鹽度為，最適鹽

3、度為2.5-3.2%。（。（2）最適溫度為）最適溫度為10-20。（。（3）適應(yīng)的光照強(qiáng)度為）適應(yīng)的光照強(qiáng)度為1000-8000lx。（。（4）在）在pH值值7-10的環(huán)境下均能繁殖生長。的環(huán)境下均能繁殖生長。 3采用下列三個(gè)步驟從三角褐指藻中提取多不飽和脂肪酸（采用下列三個(gè)步驟從三角褐指藻中提取多不飽和脂肪酸（EPA,20：5n-3）：從濕態(tài)藻泥中直接皂化并提取脂肪酸，多不飽和脂肪酸（）：從濕態(tài)藻泥中直接皂化并提取脂肪酸，多不飽和脂肪酸（PUFA）的濃縮，高效液相色譜分離的濃縮，高效液相色譜分離EPA。濕態(tài)藻泥的直接皂化使用。濕態(tài)藻泥的直接皂化使用KOH乙醇乙醇（96%，v:v）溶液（）溶液

4、（1h，60），可以提取純度為），可以提取純度為91%的的EPA。多不。多不飽和脂肪酸使用尿素飽和脂肪酸使用尿素甲醇溶液進(jìn)行包埋，尿素與脂肪酸的比例為甲醇溶液進(jìn)行包埋，尿素與脂肪酸的比例為4:1，28結(jié)晶，濃縮率可達(dá)到結(jié)晶，濃縮率可達(dá)到1.5（55.2/36.3），），EPA的回收率為的回收率為79%。通。通過液相色譜純化的過液相色譜純化的EPA純度可達(dá)到純度可達(dá)到95.8%，使用反相色譜柱（，使用反相色譜柱（C18，內(nèi)，內(nèi)徑徑4.7cm x 30cm），流動(dòng)相為甲醇），流動(dòng)相為甲醇水（水（1%，AcH）80:20w/w，高，高效液相色譜可回收上樣液中效液相色譜可回收上樣液中97%的的EPA。

5、通過這三個(gè)下游過程可回收三。通過這三個(gè)下游過程可回收三角褐指藻中角褐指藻中70%的的EPA。最后，對。最后，對EPA的投產(chǎn)進(jìn)行了投資預(yù)算，一次高的投產(chǎn)進(jìn)行了投資預(yù)算，一次高效液相色譜上樣效液相色譜上樣635mg的多不飽和脂肪酸可以純化出的多不飽和脂肪酸可以純化出326mg高度純化高度純化的的EPA（2.46gd-1）。）。4 -3家族的多不飽和脂肪酸家族的多不飽和脂肪酸EPA（20:5n-3）具有重要的生物學(xué)功能，在預(yù)防和治療人）具有重要的生物學(xué)功能，在預(yù)防和治療人類的心腦血管疾病、抗腫瘤、抑制肥胖、抗炎癥等方面具有重要的作用，因此類的心腦血管疾病、抗腫瘤、抑制肥胖、抗炎癥等方面具有重要的作用

6、，因此EPA越來越越來越受到人們的關(guān)注。受到人們的關(guān)注。 制藥和臨床應(yīng)用需要大量的高純度多不飽和脂肪酸，但是目前，生產(chǎn)的高純度的營養(yǎng)制藥和臨床應(yīng)用需要大量的高純度多不飽和脂肪酸，但是目前，生產(chǎn)的高純度的營養(yǎng)價(jià)值高不飽和脂肪酸還不能滿足臨床應(yīng)用，這嚴(yán)重阻礙了價(jià)值高不飽和脂肪酸還不能滿足臨床應(yīng)用，這嚴(yán)重阻礙了-3系類的多不飽和脂肪酸在預(yù)系類的多不飽和脂肪酸在預(yù)防和治療疾病中實(shí)驗(yàn)考查。因此，快速可靠的不飽和脂肪酸提純方法被迫切的需求。防和治療疾病中實(shí)驗(yàn)考查。因此，快速可靠的不飽和脂肪酸提純方法被迫切的需求。 許多的微澡中富含多種多不飽和脂肪酸。他們商業(yè)化生產(chǎn)脂肪酸與魚甘油做脂肪酸的許多的微澡中富含多

7、種多不飽和脂肪酸。他們商業(yè)化生產(chǎn)脂肪酸與魚甘油做脂肪酸的來源相比的優(yōu)勢在于，藻類可以利用一個(gè)低價(jià)值的可控的生產(chǎn)過程來提高細(xì)胞內(nèi)具有生物來源相比的優(yōu)勢在于，藻類可以利用一個(gè)低價(jià)值的可控的生產(chǎn)過程來提高細(xì)胞內(nèi)具有生物活性脂肪酸的含量。三角褐指藻因?yàn)樗L迅速，所以它是活性脂肪酸的含量。三角褐指藻因?yàn)樗L迅速，所以它是EPA的理想來源。戶外管道式的理想來源。戶外管道式光合反應(yīng)器每天可生產(chǎn)光合反應(yīng)器每天可生產(chǎn)EPA47.8 mgd- lL- l。還有一個(gè)額外的優(yōu)勢是。還有一個(gè)額外的優(yōu)勢是 二十二碳六烯酸和花二十二碳六烯酸和花生四烯酸含量少，甚至可以忽略不計(jì)，這個(gè)重要的優(yōu)勢可以簡化生四烯酸含量少，甚至

8、可以忽略不計(jì)，這個(gè)重要的優(yōu)勢可以簡化EPA回收的過程。回收的過程。 有關(guān)于從微澡中提取有關(guān)于從微澡中提取EPA的研究，發(fā)表的很少。的研究，發(fā)表的很少。Cohen和和Cohen (1991)從紫球藻中獲取從紫球藻中獲取EPA的用了五個(gè)步驟：脂質(zhì)提取；糖脂與磷脂的分離，糖脂類部分的甲酯化；尿素包埋法的用了五個(gè)步驟：脂質(zhì)提?。惶侵c磷脂的分離，糖脂類部分的甲酯化；尿素包埋法吸附甲基酯脂肪酸；常壓反相色譜法分離。吸附甲基酯脂肪酸；常壓反相色譜法分離。Cohen等人用其相似的一種辦法從藍(lán)綠螺旋藻等人用其相似的一種辦法從藍(lán)綠螺旋藻中提取出了純度為中提取出了純度為90%-亞麻酸。亞麻酸。 本文作者以前開發(fā)了

9、一種從海洋等鞭金藻和三角褐藻中三步分離高純度提取本文作者以前開發(fā)了一種從海洋等鞭金藻和三角褐藻中三步分離高純度提取EPA的方法。的方法。三步分別是（三步分別是（1）從直接皂化的凍干生物質(zhì)中提取脂肪酸；（）從直接皂化的凍干生物質(zhì)中提取脂肪酸；（2）尿素包埋法分離多不飽和）尿素包埋法分離多不飽和脂肪酸；（脂肪酸；（3）通過高效液相色譜法半制備分離多不飽和脂肪酸。這文研究的是用三步分離）通過高效液相色譜法半制備分離多不飽和脂肪酸。這文研究的是用三步分離法從三角褐指藻中提取法從三角褐指藻中提取EPA，另外，本文試圖研究了擴(kuò)大利用高效液相色譜法制備，另外，本文試圖研究了擴(kuò)大利用高效液相色譜法制備EPA的

10、的產(chǎn)量。產(chǎn)量。5使用戶外管道式光合反應(yīng)器使用戶外管道式光合反應(yīng)器(200L）培養(yǎng)三角褐指藻（稀釋率為）培養(yǎng)三角褐指藻（稀釋率為0.04h-1），），收獲時(shí)收獲時(shí)4000rmp，-18離心。藻泥中含有離心。藻泥中含有20.91.3的干藻粉，平均總脂的干藻粉，平均總脂肪酸含量為肪酸含量為9.4。6480g藻泥（藻泥（100g干藻粉）干藻粉）+160gKOH+96乙醇（乙醇：干藻粉乙醇（乙醇：干藻粉=1495mlg-1）氮?dú)獗Ｗo(hù)氮?dú)獗Ｗo(hù) 60攪拌浸提攪拌浸提1h以破碎細(xì)胞以破碎細(xì)胞 過濾，濾渣用過濾，濾渣用2L乙醇乙醇（96%）洗滌兩次）洗滌兩次 上清上清+2L水，用水，用4L正己烷分五次萃正己烷分

11、五次萃取去除不可皂化物質(zhì)（有機(jī)相）取去除不可皂化物質(zhì)（有機(jī)相）加加2L正己烷分八次萃取回正己烷分八次萃取回收游離脂肪酸收游離脂肪酸 HCl（1:1）將水相）將水相pH調(diào)至調(diào)至1.0 Ethanol/dry和Ethanol/wet換算參照Bligh 和Dyers 實(shí)驗(yàn)方案7 將將25g游離脂肪酸加到熱的脲素甲醇溶液（游離脂肪酸加到熱的脲素甲醇溶液（ 65-70 ，100g脲素，脲素，267mL甲醇）中，在甲醇）中，在65-70下攪拌溶解直至清澈，所得溶液下攪拌溶解直至清澈，所得溶液28過夜結(jié)晶，過夜結(jié)晶，過濾除去結(jié)晶。過濾除去結(jié)晶。8色譜柱：色譜柱：半制備：半制備：Beckman Ultrasp

12、here RP色譜柱（填料色譜柱（填料C18，5m，孔徑，孔徑 8nm，柱內(nèi)徑，柱內(nèi)徑1 cm x 25 cm） 制備級：制備級：Waters Bondapak RP色譜柱（填料色譜柱（填料C18，37-55m，孔徑，孔徑 12.5nm，柱內(nèi)徑，柱內(nèi)徑4.7 cm x 30 cm） 儀器：儀器：Waters HPLC 3000液相色譜儀液相色譜儀 （Milton Roy 3000光電二級管陣列檢測器光電二級管陣列檢測器 ）洗脫液：等度洗脫，甲醇洗脫液：等度洗脫，甲醇水（水（1%AcH）80:20w/w 。所有試劑均為色譜級，水用所有試劑均為色譜級，水用 Millin-Q系統(tǒng)純化，其他溶劑用系統(tǒng)

13、純化，其他溶劑用0.2m微孔濾膜過濾，使用前進(jìn)行除氣微孔濾膜過濾，使用前進(jìn)行除氣 。流速：半制備流速：半制備30ml/min 制備級制備級60ml/min其他：甲醇其他：甲醇水溶液分配比先于脂肪酸在真空蒸發(fā)室中進(jìn)行分析，洗脫出的組分與水溶液分配比先于脂肪酸在真空蒸發(fā)室中進(jìn)行分析，洗脫出的組分與 Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紫外光譜對照，以防止由于降解產(chǎn)生的共軛雙鍵。公司的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紫外光譜對照，以防止由于降解產(chǎn)生的共軛雙鍵。9分別對藻種、皂化萃取出的液體、尿素包埋的結(jié)晶和高分別對藻種、皂化萃取出的液體、尿素包埋的結(jié)晶和高效液相色譜得到的餾分進(jìn)行氣相色譜分析，確定脂肪酸效液相色譜得到的餾分進(jìn)行氣相

14、色譜分析，確定脂肪酸的純度和產(chǎn)率。進(jìn)行氣相色譜分析前，先將脂肪酸甲酯的純度和產(chǎn)率。進(jìn)行氣相色譜分析前，先將脂肪酸甲酯化。下列的脂肪酸需要被考慮到脂肪酸產(chǎn)率的計(jì)算中：化。下列的脂肪酸需要被考慮到脂肪酸產(chǎn)率的計(jì)算中：14:0，16:0，16:1n-7，16:2n-4，16:3n-4，16:4n-1，18:0，18:1n-7，18:1n-9，18:2n-6，18:3n-3，18:4n-3，22:0，20:4n-6，20:4n-3，20:5n-3，24:0 和和22:6n-3。1011半制備高效液相色譜半制備高效液相色譜的餾分分析的餾分分析1213制備高效液相色譜的餾制備高效液相色譜的餾分分析分分析1

15、4純化出的純化出的EPA與與EPA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紫外光譜標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紫外光譜對照，檢測是否發(fā)生對照，檢測是否發(fā)生降解降解 EPA Sigma patternEPA fraction151617 本文的目標(biāo)之一是提供一種從三角褐指藻中分離高本文的目標(biāo)之一是提供一種從三角褐指藻中分離高純度純度EPA的下游技術(shù)，來試圖擴(kuò)大商業(yè)化生產(chǎn)的下游技術(shù)，來試圖擴(kuò)大商業(yè)化生產(chǎn)EPA的產(chǎn)的產(chǎn)量。目前，本文的數(shù)據(jù)足以證明本研究方案可以用于如量。目前，本文的數(shù)據(jù)足以證明本研究方案可以用于如此復(fù)雜的生產(chǎn)系統(tǒng)中。如果使用相同的設(shè)設(shè)備，每天的此復(fù)雜的生產(chǎn)系統(tǒng)中。如果使用相同的設(shè)設(shè)備，每天的EPA產(chǎn)量可達(dá)到產(chǎn)量可達(dá)到2.46克。以表克。以表6的數(shù)據(jù)為依據(jù)，從三角的數(shù)據(jù)為依據(jù)，從三角褐指藻中每提取褐指藻中每提取1克克EPA，每天的花費(fèi)預(yù)算為，每天的花費(fèi)預(yù)算為188美金，美金，比從魚肝油中提取比從魚肝油中提取EPA便宜兩倍，即使魚甘油的價(jià)格已便宜兩倍，即使魚甘油的價(jià)格已經(jīng)很便宜。需要指出的是，如果生產(chǎn)的規(guī)模超出了實(shí)驗(yàn)經(jīng)很便宜。需要指出的是，如果生產(chǎn)的規(guī)模超出了實(shí)驗(yàn)中設(shè)定的生產(chǎn)規(guī)