1、第二節(jié) 基因工程的步驟1、基因工程的基本工具（1）“分子手術(shù)刀”- 。來(lái)源：主要是從 生物中分離純化出來(lái)的功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種 的 序列，并且切割特定的兩個(gè)脫氧核苷酸之間的 斷裂，形成黏性末端。2、“分子縫合針”- 。功能：縫合兩個(gè)脫氧核苷酸之間的 。與DNA聚合酶作用的異同： 。3、“分子運(yùn)輸車(chē)”- 。最常用的載體是： 。必須具備的條件：4、目的基因的獲取方法： 。復(fù)習(xí)回顧如圖為DNA分子的切割和連接過(guò)程：（1）EcoRl是一種 酶，其識(shí)別序列是 ，切割點(diǎn)是 與 之間的 鍵。切割結(jié)果產(chǎn)生的DNA片段末端形式為 。（2）不同來(lái)源DNA片段結(jié)合，在這里需要的酶應(yīng)是 連接酶，此酶是通

2、過(guò)在 與 之間形成 鍵，而起“縫合”作用的。限制酶限制酶 GAATTC 鳥(niǎo)嘌呤脫鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸氧核苷酸 腺嘌吟脫氧核苷酸腺嘌吟脫氧核苷酸 磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵 黏性末端黏性末端 DNA 鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸酸 腺嘌吟脫氧核苷酸腺嘌吟脫氧核苷酸 磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵 通過(guò)DNA重組技術(shù)使原有基因得以改造的動(dòng)物稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。運(yùn)用這一技術(shù)使羊奶中含有人體蛋白質(zhì)，下圖表示了這一技術(shù)的基本過(guò)程，在該工程中所用的基因“剪刀”能識(shí)別的序列和切點(diǎn)是一GGATCC一，請(qǐng)回答：（1）從羊染色體中“剪下羊蛋白質(zhì)基因的酶是 。人體蛋白質(zhì)基因“插入”后連接在羊體細(xì)胞染色體中時(shí)需要的酶是 。（2）請(qǐng)畫(huà)出質(zhì)粒

3、被切割形成黏性末端的過(guò)程圖。（3）人體蛋白質(zhì)基因之所以能“插入”到羊的染色體內(nèi)，原因是 ，“插入”時(shí)常用的工具是 。 限制性?xún)?nèi)切酶限制性?xún)?nèi)切酶 DNA連接酶連接酶 用限制酶切割C CTAGGG GATCCCCTAG G有互補(bǔ)的堿基序列有互補(bǔ)的堿基序列 細(xì)菌質(zhì)?；虿《炯?xì)菌質(zhì)?；虿《净蚬こ痰囊话愠绦蚧蚬こ痰囊话愠绦蛞?、目的基因的獲得一、目的基因的獲得二、重組載體的構(gòu)建二、重組載體的構(gòu)建三、重組載體的導(dǎo)入和篩選三、重組載體的導(dǎo)入和篩選四、目的基因的表達(dá)與鑒定四、目的基因的表達(dá)與鑒定一、目的基因的獲得一、目的基因的獲得 直接分離法直接分離法（最常用的方法（最常用的方法鳥(niǎo)槍法）鳥(niǎo)槍法）人工合成法人工

4、合成法化學(xué)合成法化學(xué)合成法反轉(zhuǎn)錄法法反轉(zhuǎn)錄法法外源外源DNADNADNADNA片段片段目的基因目的基因多個(gè)目的基因多個(gè)目的基因信使信使RNARNADNADNA單鏈單鏈雙鏈雙鏈DNADNA多個(gè)目的基因多個(gè)目的基因多個(gè)目的基因多個(gè)目的基因蛋白質(zhì)氨基酸序列蛋白質(zhì)氨基酸序列目的基因核苷酸序列目的基因核苷酸序列目的基因目的基因二、重組載體的構(gòu)建二、重組載體的構(gòu)建b b、目的基因、目的基因a a、啟動(dòng)子、啟動(dòng)子c c、終止子、終止子d d、標(biāo)記基因、標(biāo)記基因e e、復(fù)制原點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)提醒提醒 與載體相比較與載體相比較,增加啟動(dòng)子、目的基增加啟動(dòng)子、目的基因和終止子三個(gè)基因片段因和終止子三個(gè)基因片段,其功能

5、各不相同。其功能各不相同。 啟動(dòng)子啟動(dòng)子(DNA片段片段)起始密碼子起始密碼子(RNA);終終止子止子(DNA片段片段)終止密碼子終止密碼子(RNA)。1 1、19971997年，科學(xué)家將動(dòng)物體內(nèi)的年，科學(xué)家將動(dòng)物體內(nèi)的能夠合成胰島素的基因與大腸桿能夠合成胰島素的基因與大腸桿菌的菌的DNADNA分子重組，并且在大腸桿分子重組，并且在大腸桿菌中表達(dá)成功。請(qǐng)據(jù)右下圖回答菌中表達(dá)成功。請(qǐng)據(jù)右下圖回答問(wèn)題。問(wèn)題。(1)(1)此圖表示的是采取此圖表示的是采取_合成基因的方法獲取合成基因的方法獲取_基因的過(guò)程?；虻倪^(guò)程。(2) (2) 圖中圖中DNADNA是以為是以為_(kāi) _ 模板，形成單鏈模板，形成單鏈

6、DNADNA，在酶的作用，在酶的作用下合成雙鏈下合成雙鏈DNADNA，從而獲得了所需，從而獲得了所需要的目的基因。要的目的基因。(3) (3) 圖中圖中代表代表 ，它往往含它往往含 基因，以便對(duì)目基因，以便對(duì)目的基因的檢測(cè)。的基因的檢測(cè)。人工人工 目的目的 信使信使RNARNA 重組重組DNADNA分子分子 標(biāo)記標(biāo)記 三、重組載體的導(dǎo)入和篩選三、重組載體的導(dǎo)入和篩選細(xì)胞細(xì)胞類(lèi)型類(lèi)型常用常用方法方法受體受體細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程轉(zhuǎn)化過(guò)程植物植物細(xì)胞細(xì)胞農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化法體細(xì)胞體細(xì)胞將目的基因插入將目的基因插入TiTi質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNAT-DNA上上轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞

7、整合整合到受體細(xì)胞的到受體細(xì)胞的DNADNA上上動(dòng)物動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞顯微注顯微注射技術(shù)射技術(shù)受精卵受精卵將含有目的基因的表達(dá)載體提純將含有目的基因的表達(dá)載體提純?nèi)÷讶÷勋@得受精卵獲得受精卵顯微注射顯微注射早早期胚胎培養(yǎng)期胚胎培養(yǎng)胚胎移植胚胎移植發(fā)育成為發(fā)育成為 具有新性狀的動(dòng)物具有新性狀的動(dòng)物微生微生物細(xì)物細(xì)胞胞CaCa2+2+處處理增大理增大細(xì)胞壁細(xì)胞壁通透性通透性原核原核細(xì)胞細(xì)胞或酵或酵母菌母菌用用CaCa2+2+處理細(xì)胞處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞重組重組表達(dá)載體表達(dá)載體DNADNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合分子與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收感受態(tài)細(xì)胞吸收 提醒提醒 唯一不涉及到堿基互補(bǔ)配對(duì)的操

8、作步驟。唯一不涉及到堿基互補(bǔ)配對(duì)的操作步驟。微生物做受體細(xì)胞主要是微生物做受體細(xì)胞主要是個(gè)體微小個(gè)體微小, ,代謝旺盛代謝旺盛, ,繁殖速度快繁殖速度快, ,獲得目的基因產(chǎn)物多。獲得目的基因產(chǎn)物多。植物細(xì)胞還可用基因槍法植物細(xì)胞還可用基因槍法和花粉管通道法。和花粉管通道法?；虮磉_(dá)基因表達(dá) 基因表達(dá)指基因組中某基因在細(xì)胞中基因表達(dá)指基因組中某基因在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄為轉(zhuǎn)錄為mRNA和翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程。和翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程。 基因表達(dá)的改變預(yù)示著細(xì)胞在分子水平基因表達(dá)的改變預(yù)示著細(xì)胞在分子水平上的變化。它往往是細(xì)胞形態(tài)功能變化之上的變化。它往往是細(xì)胞形態(tài)功能變化之前的變化。前的變化。DNARNAPro

9、tein轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯四、目的基因的檢測(cè)和表達(dá)四、目的基因的檢測(cè)和表達(dá)32P標(biāo)記的DNA分子探針 雜交 放射自顯影法l DNA雜交直接鑒定檢測(cè)檢測(cè)2、下圖為利用生物技術(shù)獲得動(dòng)物乳腺反應(yīng)器和抗蟲(chóng)棉的過(guò)程，據(jù)圖回答：在基因工程中，A表示 ，如果直接從蘇云金桿菌中獲得抗蟲(chóng)基因，過(guò)程使用的酶區(qū)別于其他酶的特點(diǎn)是 ，B表示 。在研究過(guò)程中，研究人員首先從相關(guān)基因組中獲取了目的基因，并采用 技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行了擴(kuò)增，然后將目的基因與質(zhì)粒等載體組合形成了重組載體。在重組載體的構(gòu)建過(guò)程中需要的工具酶有 。 目的基因 識(shí)別特定的核苷酸序列，并且在特定的位點(diǎn)上切割DNA分子 重組DNA PCR 限制性?xún)?nèi)切酶、D

10、NA連接酶 基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心，一個(gè)完整的基因表達(dá)載體至少包括哪些部分? 。 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過(guò)程中，在過(guò)程中一般是采用 方法，在過(guò)程中一般采用 方法，受體細(xì)胞一般是 。 由于轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物存在于山羊的乳汁中，檢測(cè)其體內(nèi)是否出現(xiàn)藥用蛋白，在分子水平上的檢測(cè)方法及結(jié)果是什么? 。要確定目的的基因（抗蟲(chóng)基因）導(dǎo)入棉花細(xì)胞后，是否能穩(wěn)定遺傳并表達(dá)，需進(jìn)行檢測(cè)和鑒定工作，請(qǐng)寫(xiě)出在個(gè)體水平上的鑒定過(guò)程： 。目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等部分 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 顯微注射技術(shù) 受精卵 進(jìn)行抗原抗體雜交 如果出現(xiàn)雜交帶，表明奶牛中出現(xiàn)了抗原蛋白；不出現(xiàn)雜交帶，表明奶牛中未出現(xiàn)抗原蛋白 讓害蟲(chóng)吞食棉花葉，觀察害蟲(chóng)是否具有抗蟲(chóng)性狀 為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性?xún)?nèi)切酶作用于圖中的 處，DNA連接酶作用于 處。（填“a”或“b”）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方