1、 底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?1 1 了解底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響。了解底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響。 2 2 學(xué)習(xí)測定米氏常數(shù)的原理和方法。學(xué)習(xí)測定米氏常數(shù)的原理和方法。 實驗原理實驗原理19131913年，年，MichaelisMichaelis和和MentenMenten提出了酶促反應(yīng)速度和底物濃提出了酶促反應(yīng)速度和底物濃度的關(guān)系式，即米氏方程。度的關(guān)系式，即米氏方程。V VS / ( Km+S )S / ( Km+S )式中：式中： 為反應(yīng)初速度為反應(yīng)初速度 V V為最大反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度 SS為底物濃度為底物濃度 KmKm為米氏

2、常數(shù)為米氏常數(shù) KmKm值是酶的一個特征性常數(shù)，可近似表示酶與底物的親和值是酶的一個特征性常數(shù)，可近似表示酶與底物的親和力。力。 Lineweaver-BurkLineweaver-Burk作圖法是用實驗方法測定作圖法是用實驗方法測定KmKm值的最常用的值的最常用的方法。方法。1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v1/Vmax斜率斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常數(shù)米氏常數(shù)KmKm的的測定測定n 實驗時選擇不同的實驗時選擇不同的SS，測定相對應(yīng)的，測定相對應(yīng)的。求。求出兩者的倒數(shù)，以出

3、兩者的倒數(shù)，以1/1/對對1/S1/S作圖，則得到一作圖，則得到一個斜率為個斜率為K Km m/V/V的直線。將直線外推與橫軸相交，的直線。將直線外推與橫軸相交，其橫軸截矩為：其橫軸截矩為：1/S1/S1/ K1/ Km m，由此求出，由此求出K Km m值。值。該法比較簡便。該法比較簡便。n 本實驗以胰蛋白酶消化酪蛋白為例，采用本實驗以胰蛋白酶消化酪蛋白為例，采用Lineweaver-BurkLineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測定雙倒數(shù)作圖法測定K Km m值。值。n 胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)中堿性氨基酸（胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)中堿性氨基酸（L L精精氨酸和氨酸和L L賴氨酸）的羧基所形成

4、的肽鍵水解。賴氨酸）的羧基所形成的肽鍵水解。水解時生成自由氨基酸，故可用甲醛滴定法判斷水解時生成自由氨基酸，故可用甲醛滴定法判斷自由氨基增加的數(shù)量來追蹤反應(yīng)。自由氨基增加的數(shù)量來追蹤反應(yīng)。n甲醛滴定法甲醛滴定法 由于氨基酸分子在溶液中主要是兩性離子，故不能用酸、堿滴定其含由于氨基酸分子在溶液中主要是兩性離子，故不能用酸、堿滴定其含量。但氨基酸的氨基可與甲醛反應(yīng)生成羥甲基和二羥甲基氨基酸，使上述平衡向右移量。但氨基酸的氨基可與甲醛反應(yīng)生成羥甲基和二羥甲基氨基酸，使上述平衡向右移動，促使氨基酸分子上的一動，促使氨基酸分子上的一NH3NH3十基解離釋放出十基解離釋放出 H+H+，從而使溶液酸性增加，

5、就可以酚，從而使溶液酸性增加，就可以酚酞作指示劑用酞作指示劑用 NaOHNaOH來滴定。來滴定。n小知識點：小知識點：n酚酞是堿性指示劑（變色范圍是堿性），酸滴酚酞是堿性指示劑（變色范圍是堿性），酸滴堿時用堿性指示劑；反之堿滴酸時用酸性指示堿時用堿性指示劑；反之堿滴酸時用酸性指示劑比如甲基橙甲基紅。劑比如甲基橙甲基紅。 n三、器材三、器材 n 錐形瓶錐形瓶 滴定管滴定管 移液管移液管 水浴水浴鍋鍋 量筒等量筒等n四、試劑與材料四、試劑與材料n 1. 1. 酪蛋白酪蛋白n 2. 2. 胰蛋白酶胰蛋白酶n 3. 3. 甲醛甲醛n 4. 4. 酚酞酚酞n 5. 5. 氫氧化鈉氫氧化鈉 五、操作五、操

6、作 分別向分別向6 6個小錐形瓶中加入個小錐形瓶中加入5 mL5 mL甲醛溶液和甲醛溶液和1 1滴滴酚酞，并滴加酚酞，并滴加0.1 mol/L0.1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液，直至標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液，直至混合物呈微粉紅色。注意：每個錐形瓶中的顏色應(yīng)混合物呈微粉紅色。注意：每個錐形瓶中的顏色應(yīng)一致。一致。 取取100 mL100 mL酪蛋白溶液，加入另一錐形瓶中，在酪蛋白溶液，加入另一錐形瓶中，在3737水浴中保溫水浴中保溫1010分鐘。將胰蛋白酶也在分鐘。將胰蛋白酶也在37 37 水水浴中保溫浴中保溫1010分鐘。然后精確量取分鐘。然后精確量取10 mL10 mL酶液加到酪酶液加到酪蛋白溶液中

7、（同時計時）。蛋白溶液中（同時計時）。 充分混合后，隨即取出充分混合后，隨即取出10 mL10 mL反應(yīng)混合物反應(yīng)混合物（作為零時的樣品）吹至一含甲醛的錐形瓶中。（作為零時的樣品）吹至一含甲醛的錐形瓶中。用用0.1 mol/LNaOH0.1 mol/LNaOH溶液滴定，溶液滴定，直至混合物呈微粉直至混合物呈微粉紅色，紅色，記下所用記下所用0.1 mol/LNaOH0.1 mol/LNaOH溶液的溶液的mLmL數(shù)。數(shù)。 在在2 2、4 4、6 6、8 8和和1010分鐘時，分別取出分鐘時，分別取出10 mL10 mL消化消化樣品，準(zhǔn)確照上法操作。注意：在每個樣品中滴定終樣品，準(zhǔn)確照上法操作。注意

8、：在每個樣品中滴定終點的顏色應(yīng)當(dāng)一致。用增加的滴定度對時間作圖，測點的顏色應(yīng)當(dāng)一致。用增加的滴定度對時間作圖，測定初速度。定初速度。 配制不同濃度的酪蛋白溶液（、配制不同濃度的酪蛋白溶液（、1010、1515、2020、30 30 g/Lg/L）測定不同底物濃度時的活力。）測定不同底物濃度時的活力。 用實驗測得的結(jié)果，以以用實驗測得的結(jié)果，以以1/1/對對1/S1/S作圖，求作圖，求出出V V和和KmKm的數(shù)值。的數(shù)值。 n【注意事項】【注意事項】n1 1實驗表明，反應(yīng)速度只在最初一段時間內(nèi)保持恒定，實驗表明，反應(yīng)速度只在最初一段時間內(nèi)保持恒定，隨著反應(yīng)時間的延長，酶促反應(yīng)速度逐漸下降。原因隨

9、著反應(yīng)時間的延長，酶促反應(yīng)速度逐漸下降。原因有多種，如底物濃度降低，產(chǎn)物濃度增加而對酶產(chǎn)生有多種，如底物濃度降低，產(chǎn)物濃度增加而對酶產(chǎn)生抑制作用并加速逆反應(yīng)的進(jìn)行，酶在一定抑制作用并加速逆反應(yīng)的進(jìn)行，酶在一定pHpH及溫度下及溫度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反應(yīng)的初速部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反應(yīng)的初速度為準(zhǔn)。度為準(zhǔn)。n2 2本實驗是一個定量測定方法，為獲得準(zhǔn)確的實驗結(jié)本實驗是一個定量測定方法，為獲得準(zhǔn)確的實驗結(jié)果，應(yīng)盡量減少實驗操作中帶來的誤差。因此配制各果，應(yīng)盡量減少實驗操作中帶來的誤差。因此配制各種底物溶液時應(yīng)用同一母液進(jìn)行稀釋，保證底物濃度種底物溶液時應(yīng)用同一母液進(jìn)行稀釋，保證底物濃度的準(zhǔn)確性。各種試劑的加量也應(yīng)準(zhǔn)確，并嚴(yán)格控制準(zhǔn)的準(zhǔn)確性。各種試劑的加量也應(yīng)準(zhǔn)確，并嚴(yán)格控制準(zhǔn)確的酶促反應(yīng)時間。確的酶促反應(yīng)時間。n【實驗結(jié)果】【實驗結(jié)果】n1 1測定并計算酶促反應(yīng)速度。測定并計算酶促反應(yīng)速度。n2 2用實驗所得的反應(yīng)速度，對相應(yīng)的底物濃用實驗所得的反應(yīng)速度，對相應(yīng)的底物濃度作圖。度作圖。n【實驗報告】【實驗報告】n總結(jié)實驗結(jié)果，并回答如下問題：總結(jié)實驗結(jié)果