1、課程設(shè)計(jì)報(bào)告課程名稱： 生物工藝原理 題 目： 假絲酵母恒化培養(yǎng)生物反應(yīng)器設(shè)計(jì) 學(xué) 院： 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 專業(yè)班級(jí)： 生物工程101班 學(xué) 號(hào)： 5602210032 學(xué)生姓名： 辛 鑫 指導(dǎo)教師： 段學(xué)輝 2012年12月24日目錄一、任務(wù)要求41.1設(shè)計(jì)目的41.2設(shè)計(jì)任務(wù)41.3設(shè)計(jì)要求4二、設(shè)計(jì)原理52.1恒化培養(yǎng)生物反應(yīng)器的概念及原理52.2恒化培養(yǎng)的優(yōu)越性52.3恒化培養(yǎng)反應(yīng)器的應(yīng)用5三、具體設(shè)計(jì)63.1基本要求63.3設(shè)備組成73.4具體操作73.5主要工藝參數(shù)9四、總結(jié)104.1設(shè)備總結(jié)104.2心得體會(huì)10五、參考資料11一、任務(wù)要求1.1設(shè)計(jì)目的假絲酵母(Candi

2、da) 細(xì)胞圓形、卵形或長(zhǎng)形。多邊出芽繁殖。能形成假菌絲。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上菌落為乳白色，平滑，有光澤，邊緣整齊或菌絲狀。液體培養(yǎng)的能形成浮膜。能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、棉子糖。不能發(fā)酵麥芽糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖。不分解脂肪。能同化硝酸鹽。假絲酵母的蛋白質(zhì)和維生素B含量都比啤酒酵母高。它能以尿素和硝酸鹽作氮源，在培養(yǎng)基中不加其它因子即可生長(zhǎng)。它能利用造紙工業(yè)中的亞硫酸廢液，也能利用糖蜜、馬鈴薯淀粉和木材水解液等。因此能利用假絲酵母來處理工業(yè)和農(nóng)副產(chǎn)品加工業(yè)的廢棄物，生產(chǎn)可食用的蛋白質(zhì)，在綜合利用中很有價(jià)值。此屬中有的菌能轉(zhuǎn)化50的糖成為甘油。 假絲酵母也是脂肪酶的生產(chǎn)菌種，在工業(yè)上可用于絹紡原料

3、的脫脂單細(xì)胞蛋白（SCP）是從酵母或細(xì)菌等微生物菌體中獲取的蛋白質(zhì)。微生物細(xì)胞中含有豐富的蛋白質(zhì)，例如酵母菌蛋白質(zhì)含量占細(xì)胞干物質(zhì)的45%55%；細(xì)菌蛋白質(zhì)占干物質(zhì)的60%80%；霉菌絲體蛋白質(zhì)占干物質(zhì)的30%50%；單細(xì)胞藻類如小球藻等蛋白質(zhì)占干物質(zhì)的55%60%，而作物中含蛋白質(zhì)最高的是大豆，其蛋白質(zhì)含量也不過是35%40%。單細(xì)胞蛋白的氨基酸組成不亞于動(dòng)物蛋白質(zhì)，如酵母菌體蛋白，其營(yíng)養(yǎng)十分豐富，人體必需的8種氨基酸，除蛋氨酸外，它具備7 種，故有“人造肉”之稱。一般成人每天吃干酵母1015g，蛋白質(zhì)的需要量就足夠了。微生物細(xì)胞中除含有蛋白質(zhì)外，還含有豐富的碳水化合物以及脂類、維生素、礦物

4、質(zhì)，因此單細(xì)胞蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高。1.2設(shè)計(jì)任務(wù)自主設(shè)計(jì)一個(gè)假絲酵母恒化培養(yǎng)生物反應(yīng)器。根據(jù)實(shí)際情況和經(jīng)濟(jì)方面的考慮，最終選擇了假絲酵母作為我們生產(chǎn)菌種，玉米淀粉渣作為菌種發(fā)酵所用的材料。1.3設(shè)計(jì)要求自主設(shè)計(jì)，說明恒化器的加料系統(tǒng)，放料系統(tǒng)，發(fā)酵罐體積等。在設(shè)計(jì)中了解連續(xù)培養(yǎng)在實(shí)際生產(chǎn)中的重要性，發(fā)現(xiàn)恒化器培養(yǎng)的優(yōu)越性，并理解恒化器的概念，掌握恒化器的工作原理。通過設(shè)計(jì)恒化培養(yǎng)生物反應(yīng)器了解培養(yǎng)過程中微生物的生長(zhǎng)繁殖過程，利用實(shí)驗(yàn)中學(xué)到的知識(shí)，培養(yǎng)理論與實(shí)際結(jié)合的能力。二、設(shè)計(jì)原理2.1恒化培養(yǎng)生物反應(yīng)器的概念及原理生物反應(yīng)器是利用酶或生物體（如微生物）所具有的生物功能，在體外進(jìn)行生化反應(yīng)的裝

5、置系統(tǒng)，它是一種生物功能模擬機(jī)，如發(fā)酵罐、固定化酶或固定化細(xì)胞反應(yīng)器等。在酒類、醫(yī)藥生產(chǎn)、有機(jī)污染物降解方面有重要應(yīng)用。恒化培養(yǎng)反應(yīng)器通過控制某一營(yíng)養(yǎng)物濃度（如碳源、氮源、生長(zhǎng)因子等），使其始終成為生長(zhǎng)限制因子，而達(dá)到控制培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長(zhǎng)速率條件下進(jìn)行連續(xù)生長(zhǎng)繁殖。當(dāng)多種微生物在同一反應(yīng)器中混合連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，各種微生物競(jìng)爭(zhēng)利用限制性基質(zhì)，從而具有優(yōu)勢(shì)的微生物得以保留不具優(yōu)勢(shì)的微生物則被淘汰。當(dāng)某一種微生物在連續(xù)培養(yǎng)是發(fā)生變異，則原出發(fā)菌與變異菌之間發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)。2.2恒化培養(yǎng)的優(yōu)越性分批培養(yǎng)所培養(yǎng)的細(xì)胞，通常是經(jīng)過停止期、對(duì)數(shù)期、靜止期的生長(zhǎng)過程。在培養(yǎng)過程中，常有

6、因培養(yǎng)基成分、細(xì)胞密度等發(fā)生變化，使細(xì)胞環(huán)境不能保持一定的欠缺，但所使用裝置和方法均較連續(xù)培養(yǎng)法簡(jiǎn)便，所以被廣泛使用。 恒化器培養(yǎng)微生物不經(jīng)過“四個(gè)階段”，菌群基本是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期旺盛生長(zhǎng)，產(chǎn)量很大。大部分培育菌體基本使用發(fā)酵罐分級(jí)發(fā)酵，從種子罐到生產(chǎn)罐，逐級(jí)擴(kuò)大，這種方法存在占用設(shè)備量大，每一級(jí)都要經(jīng)過接種、培養(yǎng)和放罐的過程，操作復(fù)雜，易感染雜菌、老化菌多，變異性達(dá)等問題，這個(gè)設(shè)備能夠連續(xù)培養(yǎng)微生物，且設(shè)備占用少，操作不復(fù)雜。2.3恒化培養(yǎng)反應(yīng)器的應(yīng)用微生物的連續(xù)培養(yǎng)是相對(duì)于分批培養(yǎng)而言的。連續(xù)培養(yǎng)是指在深入研究分批培養(yǎng)中生長(zhǎng)曲線形成的內(nèi)在機(jī)制的基礎(chǔ)上，開放培養(yǎng)系統(tǒng)，不斷補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液、解除抑制因

7、子、優(yōu)化生長(zhǎng)代謝環(huán)境的培養(yǎng)方式。由于培養(yǎng)系統(tǒng)的相對(duì)開放性，因此，連續(xù)培養(yǎng)也稱為開放培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)的顯著特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)是，它可以根據(jù)研究者的目的，在一定程度上，人為控制典型生長(zhǎng)曲線中的某個(gè)時(shí)期，使之縮短或延長(zhǎng)時(shí)間，使某個(gè)時(shí)期的細(xì)胞加速或降低代謝速率，從而大大提高培養(yǎng)過程的人為可控性和效率。連續(xù)培養(yǎng)模式應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)則稱之為連續(xù)發(fā)酵。恒化連續(xù)培養(yǎng)往往控制微生物在低于最高生長(zhǎng)速率的條件下生長(zhǎng)繁殖。恒化連續(xù)培養(yǎng)在研究微生物利用某種底物進(jìn)行代謝的規(guī)律方面被廣泛采用。因此，它是微生物營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)、繁殖、代謝和基表達(dá)與調(diào)控等基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究的重要技術(shù)手段。三、具體設(shè)計(jì)這次設(shè)計(jì)通過結(jié)合以前學(xué)過的發(fā)酵，連續(xù)培養(yǎng)，恒

8、化器，培養(yǎng)基的配置原則等理論知識(shí)，結(jié)合生物實(shí)驗(yàn)中學(xué)到的操作等，參考一定的書籍以及查詢網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)出來的。3.1基本要求（1）保證系統(tǒng)內(nèi)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)物不受污染；（2）新的培養(yǎng)基以可調(diào)控的速度逐滴加入培養(yǎng)罐，同時(shí)有相應(yīng)數(shù)量的老培養(yǎng)液排出，保持培養(yǎng)物總量恒定；（3）培養(yǎng)罐內(nèi)培養(yǎng)物應(yīng)充分?jǐn)嚢?，保持均一，使流入的新培養(yǎng)基在瞬間即可均勻的分布到整個(gè)培養(yǎng)物中；（4）以某一營(yíng)養(yǎng)成分為生長(zhǎng)限制底物的液體培養(yǎng)基；（5）根據(jù)需要對(duì)溫度、通氣程度、培養(yǎng)物PH的監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)設(shè)相應(yīng)的附加裝置。3.2設(shè)備圖3.3設(shè)備組成（1）主體結(jié)構(gòu)：發(fā)酵罐主要由內(nèi)外兩層罐體構(gòu)成。其中，外筒工作時(shí)加入水，下接有加熱管和熱電偶，可以把水加熱并保

9、持到預(yù)期的溫度；內(nèi)筒工作時(shí)從上加入培養(yǎng)基和菌種。利用內(nèi)層筒體進(jìn)行傳熱雖然會(huì)降低熱效率，但這樣既可以防止培養(yǎng)基因達(dá)到沸點(diǎn)而沸騰起來，又可防止加熱管直接加熱到菌絲而造成菌體死亡。（2）補(bǔ)料系統(tǒng)：補(bǔ)料儲(chǔ)液罐，蠕動(dòng)泵（3）出料及取樣系統(tǒng)：封口堿液罐，廢液池，止動(dòng)閥，玻璃三通（4）酸堿調(diào)控系統(tǒng)：酸堿儲(chǔ)液罐，PH調(diào)控裝置，玻璃三通（5）進(jìn)氣導(dǎo)入管，橡皮塞，導(dǎo)管等3.4具體操作A口三通中一個(gè)連接口與酸堿PH 調(diào)控系統(tǒng)的酸堿儲(chǔ)蓄罐相通，由酸堿PH 調(diào)控系統(tǒng)的PH反饋蠕動(dòng)泵和PH調(diào)控裝置在線調(diào)控，另一個(gè)連接口與補(bǔ)料系統(tǒng)的補(bǔ)料儲(chǔ)液瓶連接，由補(bǔ)料系統(tǒng)設(shè)置的蠕動(dòng)泵控制，B孔中的兩個(gè)連接口分別與出料及取樣系統(tǒng)設(shè)置的廢棄

10、池和封口堿液罐相通。補(bǔ)料系統(tǒng)：補(bǔ)料系統(tǒng)設(shè)置的蠕動(dòng)泵與A孔三通中的一個(gè)連接口連接，并與補(bǔ)料儲(chǔ)液瓶相通。出料系統(tǒng)：出料及取樣系統(tǒng)包括取樣管，該取樣管連接B孔三通上，前后口由止動(dòng)閥夾住。培養(yǎng)液A加料至反應(yīng)池中，然后將培養(yǎng)好的2%-10%接種量的第二代種子液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)池，裝液量100-250L，30-40間接發(fā)酵6-10h至對(duì)數(shù)期后，開始由補(bǔ)料系統(tǒng)中的蠕動(dòng)泵以0.010.5L/h流加補(bǔ)料新鮮培養(yǎng)基B，同時(shí)二氧化碳?xì)怏w以0.11.0L/min由進(jìn)氣系統(tǒng)進(jìn)入反應(yīng)池底部，發(fā)酵液經(jīng)反應(yīng)池中液位控制管在氣體壓力下自動(dòng)壓出進(jìn)入廢液池。裝液量在100250L之間，氣體經(jīng)進(jìn)氣管至反應(yīng)液底部能帶動(dòng)反應(yīng)液的翻滾，從而減少

11、了額外的攪拌系統(tǒng)，使得整個(gè)裝置更加簡(jiǎn)單可行。培養(yǎng)液B中限制單一碳源葡萄糖的添加量，使其始終作為生長(zhǎng)限制因子，以達(dá)到控制培養(yǎng)液流速保持不變的目的，并使微生物始終在低于其最高生長(zhǎng)速率下連續(xù)生長(zhǎng)繁殖，補(bǔ)料新鮮培養(yǎng)基B中其他成分都保持過量。連續(xù)培養(yǎng)過程中，每10-15h取樣檢測(cè)發(fā)酵液的各項(xiàng)參數(shù)，并每5-14天后無菌取樣，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布到培養(yǎng)基C平板，厭氧培養(yǎng)1-5天，判斷優(yōu)良菌種。其中流加補(bǔ)料新鮮培養(yǎng)基B由反應(yīng)液體系中生長(zhǎng)限制因子的濃度和菌體生物量的變化綜合考慮，不斷調(diào)試稀釋速率的大小，直至反應(yīng)體系達(dá)到擬穩(wěn)定狀態(tài)，擬穩(wěn)定狀態(tài)定義為：每10-15h取樣檢測(cè)發(fā)酵液的各項(xiàng)參數(shù)，連續(xù)三次取樣參數(shù)基本一致時(shí)

12、認(rèn)為反應(yīng)體系達(dá)到擬穩(wěn)定狀態(tài)。為了易于判斷目的突變菌株的出現(xiàn)，生長(zhǎng)限制因子并不是讓其被完全消耗掉，而是讓其有所剩余并維持在一個(gè)較低的范圍。在擬穩(wěn)定連續(xù)培養(yǎng)中，當(dāng)生長(zhǎng)限制因子濃度下降說明菌體生長(zhǎng)速率加快，暗示目的突變菌株有可能出現(xiàn)。通過菌株生長(zhǎng)速度的快慢，菌落形態(tài)的大小，以及產(chǎn)生變色圈的大小來判斷是否為優(yōu)良菌株，挑取優(yōu)良菌株轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)液B，再培養(yǎng)檢測(cè)。監(jiān)測(cè)中的取樣，是將取樣管的管口伸入封口堿液罐的液面以下，取樣時(shí)夾住出料口管，打開取樣口管，將反應(yīng)池整體向取樣口方向傾斜一角度，則有一定發(fā)酵也被氣體壓入取樣管。由此每次取樣都是來自反應(yīng)池的及時(shí)樣液且取樣體積基本一定，取樣口不存在被堵的問題，并解決了

13、需要事先放液的麻煩進(jìn)而保證了反應(yīng)體積的恒定。長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)培養(yǎng)需要頻繁的更換補(bǔ)料瓶，常規(guī)方法是在酒精燈火焰上方有效區(qū)域中更換補(bǔ)料瓶，但是這在實(shí)際操作中并不容易且存在很大偶然性，一不小心就會(huì)染上雜菌，而此系統(tǒng)是在20%-50%的氫氧化鈉強(qiáng)堿溶液中操縱，染菌幾率大大減少。3.5主要工藝參數(shù)（1）培養(yǎng)基A豆粉40g/L,淀粉15g/,豆油5mL/L,K2HPO4g/L,MgsO4·7H2O1g/L,Tween-800.1,酵母膏5g/L，初始pH值為6.0（2）培養(yǎng)基B葡萄糖10g/L,乙酸鈉2.72g/L,NaCL 2g/L,CaCL2 0.4g/L,MgCL2 0.4g/L,Na2HPO

14、4 0.62g/L,NaH2PO43.2g/L,K2HPO4 6g/L,酵母膏，NH4HCO34.8g/L,C4H4O4Na2100，CH3COONa·3H2O80，PH7.0（3）其他裝液量100L,二代種子液接種量10%，間歇發(fā)酵10h后，流加補(bǔ)料新鮮培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基、間歇培養(yǎng)基采用培養(yǎng)基A，補(bǔ)料培養(yǎng)基采用培養(yǎng)基B，PH7.0，其中減少有機(jī)氮源酵母膏的含量直至0，同時(shí)相應(yīng)提高無機(jī)氮源NH4HCO3濃度至8g/L,充無菌純二氧化碳，流速0.5L/min，溫度30,50%NaOH在線調(diào)控PH6.8。稀釋速率稀釋率在0.01-0.223/h之間按實(shí)際情況調(diào)節(jié)，殘?zhí)菧p少且生物量OD66

15、0相應(yīng)增大則提高稀釋率，殘?zhí)窃龆嗲襉D660減少則降低稀釋率，直至達(dá)到擬穩(wěn)態(tài)平衡。平衡判斷標(biāo)準(zhǔn)：每隔15h取樣一次，當(dāng)連續(xù)三次取樣葡萄糖和OD660數(shù)值基本不變時(shí)可認(rèn)為達(dá)到擬穩(wěn)態(tài)平衡。當(dāng)培養(yǎng)基B中有機(jī)氮源酵母膏的量減少到0時(shí)主要氮源為無機(jī)氮源后，菌株仍生長(zhǎng)良好則認(rèn)為生產(chǎn)能夠利用無機(jī)氮源的突變株，每14天無菌取樣稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布培養(yǎng)，從中挑取生長(zhǎng)旺盛的接種于B培養(yǎng)基。發(fā)酵罐體積根據(jù)設(shè)計(jì)要求可知：恒化器中的SCP含水量為80%；細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率=0.45；發(fā)酵罐中的一天可生產(chǎn)的SCP濕重10kg/(1-0.8)50kg故料液的流速 F50kg/24h2.08kg/h在穩(wěn)態(tài)條件下，dX/dt0,即

16、uXDX由于稀釋率DF/V，那么 uX·VF2.08kg/h又因?yàn)榧?xì)胞濃度要保持在2050g/L，取細(xì)胞濃度為30g/L則 Vp·Cc2.08/0.45(其中Vp是發(fā)酵液的體積，Cc是細(xì)胞濃度)綜合以上數(shù)據(jù)求得 Vp154.1L設(shè)定發(fā)酵液只占用發(fā)酵罐的體積的3/4，則發(fā)酵罐的體積為 VVp÷0.75205.5規(guī)定發(fā)酵罐的體積為 V實(shí)際200L生產(chǎn)能力現(xiàn)每天產(chǎn)SCP 2t，假絲酵母發(fā)酵周期為54h（包括發(fā)酵罐清洗、滅菌、進(jìn)出物料等輔助操作時(shí)間），則每天需糖化液體積為V糖。每天產(chǎn)SCP 2t，每噸SCP需糖液31L，則V糖=31L。 四、總結(jié)4.1設(shè)備總結(jié)連續(xù)培養(yǎng)延長(zhǎng)

17、對(duì)數(shù)期是有限的，是相對(duì)的。如在發(fā)酵生產(chǎn)中，在細(xì)胞群體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，產(chǎn)物開始大量合成時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料，適當(dāng)增加發(fā)酵液中合成產(chǎn)物的底物量和維持細(xì)胞生存所需要的低微濃度的營(yíng)養(yǎng)物，使細(xì)胞在非生長(zhǎng)繁殖狀態(tài)下合成產(chǎn)物的持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，從而達(dá)到提高單位發(fā)酵液中產(chǎn)物總量（效價(jià)）之目的。 在這種細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖與目的產(chǎn)物合成處于階段分明的不同時(shí)期工藝技術(shù)，要大幅度地延長(zhǎng)目的產(chǎn)物合成期是難以做到的。因?yàn)椋S著對(duì)細(xì)胞自身具有一定毒害作用的產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中濃度的提高，其它對(duì)細(xì)胞生存不利的代謝產(chǎn)物在環(huán)境中的量也在同時(shí)增加，會(huì)制約細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間維持產(chǎn)物合成的高效率。通過補(bǔ)料，適當(dāng)增加營(yíng)養(yǎng)，可以延緩了細(xì)胞衰老與自溶崩潰，但是，應(yīng)該指

18、出細(xì)胞走向終止代謝與死亡的方向并沒有改變，進(jìn)程并沒有阻斷。4.2心得體會(huì)通過這次恒化器的設(shè)計(jì)，了解到連續(xù)培養(yǎng)在實(shí)際生產(chǎn)中的重要性，發(fā)現(xiàn)恒化器培養(yǎng)的優(yōu)越性，更加深刻的理解了恒化器的概念，更透徹的掌握了恒化器的工作原理，通過設(shè)計(jì)恒化器了解培養(yǎng)過程中微生物的生長(zhǎng)繁殖過程，通過設(shè)計(jì)恒化器綜合利用實(shí)驗(yàn)中學(xué)到的知識(shí)，培養(yǎng)理論與實(shí)際結(jié)合的能力。通過這次的課程設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵設(shè)備有了更具體的了解，對(duì)加料系統(tǒng)、出料系統(tǒng)有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。這次的課程設(shè)計(jì)使得我們把以前學(xué)過的發(fā)酵知識(shí)，如連續(xù)培養(yǎng)、恒化器培養(yǎng)、培養(yǎng)基的配制等理論應(yīng)用了起來。也是通過這次的實(shí)際應(yīng)用，體會(huì)到了理論知識(shí)與實(shí)際結(jié)合的困難性。它不僅需要堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)更需要全面思考問題的能力。這次恒化器的設(shè)計(jì)使我鞏固了以前學(xué)過的知識(shí)，也為以后更深入的學(xué)習(xí)奠定了基礎(chǔ)。 通過綜合利用實(shí)驗(yàn)中學(xué)到的知識(shí)，培養(yǎng)理論與實(shí)際結(jié)合的能力。通過這次的課程設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵設(shè)備有了更具體的了解，對(duì)加