1、免疫學(xué)技術(shù)在科研免疫學(xué)技術(shù)在科研中的應(yīng)用中的應(yīng)用 概概 述述免疫學(xué)技術(shù)發(fā)展進程的主要階段免疫學(xué)技術(shù)發(fā)展進程的主要階段自然自然的肉眼觀察的抗原抗體反應(yīng)（沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)）的肉眼觀察的抗原抗體反應(yīng)（沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)）加速加速的肉眼觀察的抗原抗體反應(yīng)（電泳技術(shù)、分離技術(shù)）的肉眼觀察的抗原抗體反應(yīng)（電泳技術(shù)、分離技術(shù)）標(biāo)記性標(biāo)記性免疫技術(shù)提高抗原抗體反應(yīng)的特異性、敏感性免疫技術(shù)提高抗原抗體反應(yīng)的特異性、敏感性半自動、自動半自動、自動化檢驗儀器與免疫反應(yīng)原理結(jié)合，加快了化檢驗儀器與免疫反應(yīng)原理結(jié)合，加快了反應(yīng)過程反應(yīng)過程標(biāo)記技術(shù)、單克隆技術(shù)、高智能自動化技術(shù)的標(biāo)記技術(shù)、單克隆技術(shù)、高智能自動化技術(shù)的

2、最佳組合最佳組合免疫細胞相關(guān)實驗技術(shù)：免疫細胞相關(guān)實驗技術(shù)：單核巨噬細胞、樹突狀細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞、NKNK細胞、細胞、T T細胞、細胞、B B細胞，細胞，以及這些細胞亞群；以及這些細胞亞群；免疫分子相關(guān)實驗技術(shù)：免疫分子相關(guān)實驗技術(shù)：抗原（包括抗原肽）、抗體（包括單抗、多抗、基因工抗原（包括抗原肽）、抗體（包括單抗、多抗、基因工程抗體）、補體、細胞因子及其受體、程抗體）、補體、細胞因子及其受體、HLAHLA、TLRTLR等；等；免疫學(xué)相關(guān)標(biāo)記技術(shù)：免疫學(xué)相關(guān)標(biāo)記技術(shù)：熒光、酶、放射、磁珠標(biāo)記技術(shù)和發(fā)光分析原理；熒光、酶、放射、磁珠標(biāo)記技術(shù)和發(fā)光分析原理；免疫學(xué)相關(guān)蛋白質(zhì)技術(shù)：免疫

3、學(xué)相關(guān)蛋白質(zhì)技術(shù)：蛋白質(zhì)電泳、印跡技術(shù)（如蛋白質(zhì)電泳、印跡技術(shù)（如 SDS-PAGESDS-PAGE、雙向電泳、雙向電泳、Western Western 印跡和斑點印跡）、免疫共沉淀技術(shù)等；印跡和斑點印跡）、免疫共沉淀技術(shù)等；免疫學(xué)相關(guān)檢測技術(shù)：免疫學(xué)相關(guān)檢測技術(shù)：流式細胞分析和分選技術(shù)、細胞凋亡和細胞周期檢測技術(shù)、流式細胞分析和分選技術(shù)、細胞凋亡和細胞周期檢測技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究技術(shù)、激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)等；免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究技術(shù)、激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)等；免疫學(xué)實驗相關(guān)動物模型：免疫學(xué)實驗相關(guān)動物模型：自身免疫病動物模型（如自身免疫性腦脊髓

4、炎、自身自身免疫病動物模型（如自身免疫性腦脊髓炎、自身免疫性甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等）、感染性疾病動物模型（如利什曼原蟲、免疫性甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等）、感染性疾病動物模型（如利什曼原蟲、弓形蟲、巨細胞病毒、李斯特菌等）、腫瘤動物模型、器官移植動物模型等；弓形蟲、巨細胞病毒、李斯特菌等）、腫瘤動物模型、器官移植動物模型等；免疫學(xué)技術(shù)主要相關(guān)內(nèi)容免疫學(xué)技術(shù)主要相關(guān)內(nèi)容5免疫的類型免疫的類型固有免疫固有免疫 innate immunity innate immunity 適應(yīng)性免疫適應(yīng)性免疫 adaptive immunity adaptive immunityOverview of Imm

5、unity病原微生物病原微生物固有（固有（innate)/innate)/天然天然(natural)(natural)非特異性（非特異性（non-specific)non-specific)免疫免疫（immunityimmunity） * * 種群在長期進化過程中逐漸形種群在長期進化過程中逐漸形成的防御功能，乃經(jīng)遺傳而獲得，成的防御功能，乃經(jīng)遺傳而獲得，并非針對特定抗原。并非針對特定抗原。固有免疫固有免疫 innate immunity innate immunity機體接受病原體等抗原（決定基）異物刺激后所產(chǎn)生、僅針對相應(yīng)病原體等抗原機體接受病原體等抗原（決定基）異物刺激后所產(chǎn)生、僅針對相應(yīng)

6、病原體等抗原異物發(fā)揮效應(yīng)、使之從體內(nèi)被清除的防御功能。異物發(fā)揮效應(yīng)、使之從體內(nèi)被清除的防御功能。* * 個體接觸特定抗原（決定基）而產(chǎn)生。個體接觸特定抗原（決定基）而產(chǎn)生。* * 僅針對該特定抗原（決定基）而發(fā)生反應(yīng)。僅針對該特定抗原（決定基）而發(fā)生反應(yīng)。* * 后天獲得；有特異性；有記憶性；作用慢而強。后天獲得；有特異性；有記憶性；作用慢而強。 抗原抗原刺激機體刺激機體適應(yīng)性免疫適應(yīng)性免疫可刺激機體產(chǎn)生特異性免疫可刺激機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)應(yīng)答的物質(zhì)抗原決定簇抗原決定簇產(chǎn)生抗體產(chǎn)生抗體致敏淋巴致敏淋巴細胞細胞適應(yīng)性免疫（適應(yīng)性免疫（adaptive immunityadaptive i

7、mmunity）8 固有免疫固有免疫 適應(yīng)性免疫適應(yīng)性免疫細胞組成細胞組成 粘膜和上皮細胞、粘膜和上皮細胞、 T T淋巴細胞、淋巴細胞、B B淋巴細胞、淋巴細胞、 吞噬細胞、吞噬細胞、 NK NK細胞、細胞、 抗原提呈細胞抗原提呈細胞 NK1.1 NK1.1+ +T T細胞、細胞、TT細胞細胞 B-1 B-1細胞細胞產(chǎn)生產(chǎn)生 先天具有先天具有 后天經(jīng)抗原刺激而獲得后天經(jīng)抗原刺激而獲得作用時效作用時效 即刻即刻9696小時內(nèi)小時內(nèi) 96 96小時后小時后作用特點作用特點 非特異性非特異性 特異性特異性 無增殖分化，作用迅速無增殖分化，作用迅速 特異性細胞克隆增殖、分化特異性細胞克隆增殖、分化 無

8、免疫記憶無免疫記憶 有免疫記憶有免疫記憶作用時間作用時間 作用時間短作用時間短 作用時間長作用時間長固有免疫與適應(yīng)性免疫的特點固有免疫與適應(yīng)性免疫的特點OutlinePart I Part I 抗原或抗體的檢測抗原或抗體的檢測Part II Part II 免疫細胞的檢測免疫細胞的檢測Part III Part III 自身免疫病及實驗研究舉例自身免疫病及實驗研究舉例PartI PartI 抗原或抗體的檢測抗原或抗體的檢測抗原抗體反應(yīng)的特點抗原抗體反應(yīng)的特點抗原抗體反應(yīng)的影響因素抗原抗體反應(yīng)的影響因素常用的抗原抗體反應(yīng)常用的抗原抗體反應(yīng)11抗原抗體反應(yīng)的特點抗原抗體反應(yīng)的特點高度的特異性高度的

9、特異性可逆性可逆性 抗原抗體結(jié)合除了空間構(gòu)象互補外，主要以氫鍵、靜抗原抗體結(jié)合除了空間構(gòu)象互補外，主要以氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水鍵等分子表面的化學(xué)基團之電引力、范德華力和疏水鍵等分子表面的化學(xué)基團之間的非共價方式結(jié)合。這種非共價鍵不如共價鍵結(jié)合間的非共價方式結(jié)合。這種非共價鍵不如共價鍵結(jié)合穩(wěn)定，極易受溫度、酸堿度和離子強度的影響而解離。穩(wěn)定，極易受溫度、酸堿度和離子強度的影響而解離。抗原抗體比例影響免疫復(fù)合物的大小抗原抗體比例影響免疫復(fù)合物的大小抗原抗體反應(yīng)的兩個階段抗原抗體反應(yīng)的兩個階段12抗原抗體反應(yīng)的影響因素抗原抗體反應(yīng)的影響因素抗原抗體濃度與比例抗原抗體濃度與比例電解質(zhì)電解質(zhì) *

10、 * 抗原抗體特異性結(jié)合后，親水性降低，易受電解抗原抗體特異性結(jié)合后，親水性降低，易受電解 質(zhì)的影響而使表面失去較多的負(fù)電荷。質(zhì)的影響而使表面失去較多的負(fù)電荷。溫度溫度 * * 適當(dāng)?shù)臏囟瓤稍黾涌乖c抗體分子的碰撞機會，適當(dāng)?shù)臏囟瓤稍黾涌乖c抗體分子的碰撞機會， 加速抗原抗體復(fù)合物的形成。加速抗原抗體復(fù)合物的形成。酸堿度酸堿度 * * 抗原抗體反應(yīng)的最適抗原抗體反應(yīng)的最適pHpH在在6868之間，之間，pHpH過高或過過高或過 低，即過堿或過酸，均可影響抗原、抗體的理化低，即過堿或過酸，均可影響抗原、抗體的理化 性質(zhì)。性質(zhì)。13常用的抗原抗體反應(yīng)常用的抗原抗體反應(yīng)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)免疫標(biāo)記技術(shù)一

11、、凝集反應(yīng)一、凝集反應(yīng) 細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒抗原，在適當(dāng)電解細菌、螺旋體和紅細胞等顆?？乖谶m當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集，稱為凝集反質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集，稱為凝集反應(yīng)（應(yīng)（agglutinationagglutination）是最經(jīng)典的免疫學(xué)檢測技術(shù)。）是最經(jīng)典的免疫學(xué)檢測技術(shù)。 直接凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)間接凝集抑制試驗間接凝集抑制試驗微粒捕獲酶免疫分析技術(shù)微粒捕獲酶免疫分析技術(shù)間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng) 將可溶性抗原或抗體吸附在與免疫無關(guān)的顆將可溶性抗原或抗體吸附在與免疫無關(guān)的顆粒載體上，形成致敏顆粒，再與相應(yīng)抗體或抗原粒載體上，

12、形成致敏顆粒，再與相應(yīng)抗體或抗原進行反應(yīng)產(chǎn)生的凝集反應(yīng)，稱為間接凝集反應(yīng)。進行反應(yīng)產(chǎn)生的凝集反應(yīng)，稱為間接凝集反應(yīng)。 顆粒載體有紅細胞、聚苯乙烯乳膠顆粒、活顆粒載體有紅細胞、聚苯乙烯乳膠顆粒、活性炭顆粒，而相應(yīng)的凝集現(xiàn)象分別稱為間接血球性炭顆粒，而相應(yīng)的凝集現(xiàn)象分別稱為間接血球凝集、間接乳膠凝集、間接炭粒凝集反應(yīng)。凝集、間接乳膠凝集、間接炭粒凝集反應(yīng)。 將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素素親和素親和素酶放大系統(tǒng)相結(jié)合，最后酶作用于酶放大系統(tǒng)相結(jié)合，最后酶作用于熒光底物，使之發(fā)熒光，通過檢測熒光強度判斷熒光底物，使之發(fā)熒光，通過檢測熒光強度判斷待測抗原的含

13、量。待測抗原的含量。 檢測腫瘤標(biāo)記物檢測腫瘤標(biāo)記物CAl99CAl99、CEACEA、CAl25CAl25、AFPAFP、性激素、甲狀腺素性激素、甲狀腺素T3T4T3T4、葉酸、葉酸、HIVHIV抗體、抗體、HCGHCG等等微量可溶性抗原。微量可溶性抗原。微粒捕獲酶免疫分析技術(shù)微粒捕獲酶免疫分析技術(shù)二、沉淀反應(yīng)二、沉淀反應(yīng)免疫沉淀反應(yīng)免疫沉淀反應(yīng): (precipitation): (precipitation) 可溶性抗原與相應(yīng)抗體，在適宜條件下發(fā)生結(jié)合，出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。免疫沉淀液體內(nèi)沉淀反應(yīng)凝膠內(nèi)沉淀反應(yīng)免疫電泳技術(shù)免疫濁度技術(shù)絮狀沉淀試驗環(huán)狀沉淀試驗單向擴散試驗雙向擴散試驗免疫電泳對流免

14、疫電泳火箭免疫電泳免疫固定電泳透射免疫比濁 turbidimetermeasure 散射免疫比濁 nephelomitermeasure 20沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)速率散射比濁法免疫比濁法速率散射比濁法免疫比濁法瓊脂擴散法瓊脂擴散法 單向瓊脂擴散單向瓊脂擴散 雙向瓊脂擴散雙向瓊脂擴散 火箭電泳火箭電泳 對流免疫電泳對流免疫電泳 免疫印跡技術(shù)免疫印跡技術(shù)速率散射比濁法免疫比濁法速率散射比濁法免疫比濁法將已知抗體與相應(yīng)抗原在液相中按一定比例混合形成可溶性免疫復(fù)合物，這些復(fù)合物微小粒子對一定波長的光照射發(fā)生散射，可通過光路系統(tǒng)測定光散射(OD)值。抗體含量固定并處于抗體過剩時，免疫復(fù)合物的多少直接取決于抗

15、原的濃度，抗原的終濃度通過標(biāo)準(zhǔn)品繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出。提高了靈敏度，通過自動化，可同時檢測多個樣品并進行精確的定量分析。檢測前白蛋白、酸性蛋白酶、巨球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、尿微量蛋白及IgG、IgM、IgA及補體，藥物含量分析。22免疫比濁技術(shù)原理免疫比濁技術(shù)原理 當(dāng)當(dāng)可溶性抗原可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適比例合適時，時，在在特殊的緩沖液特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合抗原抗體復(fù)合物物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度濁度。利用現(xiàn)代。利用現(xiàn)代光學(xué)測量儀器光學(xué)測量儀器對濁度對濁度進行測定從而檢測抗原含量。進行測定從而檢測抗原

16、含量。 檢測器檢測器光源光源 透鏡透鏡 濾光片濾光片散射光散射光透射光透射光23原原 理理 將一定量的抗將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，體混入瓊脂凝膠中，使待測抗原在凝膠使待測抗原在凝膠中自由擴散，與相中自由擴散，與相應(yīng)抗體結(jié)合形成沉應(yīng)抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)大小淀環(huán)，沉淀環(huán)大小與抗原濃度呈正相與抗原濃度呈正相關(guān)。關(guān)。1.1.測定沉淀環(huán)直徑測定沉淀環(huán)直徑2.2.在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相應(yīng)抗原濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相應(yīng)抗原濃度單向瓊脂擴散實驗單向瓊脂擴散實驗 （single immunodiffusion） 雙向瓊脂擴散實驗（雙向瓊脂擴散實驗（ double immunodiffusion ）原原 理理

17、 將可溶性抗將可溶性抗原和抗體置于瓊原和抗體置于瓊脂凝膠板的對應(yīng)脂凝膠板的對應(yīng)孔中，兩者各自孔中，兩者各自在凝膠中向四周在凝膠中向四周自由擴散，當(dāng)抗自由擴散，當(dāng)抗原與抗體相遇，原與抗體相遇，在比例合適時形在比例合適時形成沉淀線。成沉淀線?；鸺庖唠娪净鸺庖唠娪荆╮ocket immunoelectrophoresis）原原 理理 是將單向擴散與電泳是將單向擴散與電泳技術(shù)相結(jié)合的一種方法。技術(shù)相結(jié)合的一種方法。將含有已知抗體的瓊脂制將含有已知抗體的瓊脂制成瓊脂板。待檢樣品加入成瓊脂板。待檢樣品加入陰極側(cè)進行電泳?？乖瓗ш帢O側(cè)進行電泳。抗原帶負(fù)電荷向陽極移動，并與負(fù)電荷向陽極移動，并與抗體結(jié)合。

18、在抗原、抗體抗體結(jié)合。在抗原、抗體比例適當(dāng)部位形成錐形沉比例適當(dāng)部位形成錐形沉淀峰，該峰的高度與抗原淀峰，該峰的高度與抗原量成正比?？煽焖贉y出標(biāo)量成正比?？煽焖贉y出標(biāo)本中抗原的含量。本中抗原的含量。對流免疫電泳對流免疫電泳（counter immunoelectrophoresis）原原 理理 是將雙向擴散與是將雙向擴散與電泳技術(shù)相結(jié)合的一電泳技術(shù)相結(jié)合的一種方法。將抗原和抗種方法。將抗原和抗體在瓊脂凝膠孔中電體在瓊脂凝膠孔中電泳，帶負(fù)電荷的抗原泳，帶負(fù)電荷的抗原向正極運動，帶正電向正極運動，帶正電荷的抗體向負(fù)極運動，荷的抗體向負(fù)極運動，二者在瓊脂凝膠中相二者在瓊脂凝膠中相互作用而形成沉淀線。

19、互作用而形成沉淀線。免疫印跡技術(shù)免疫印跡技術(shù) 蛋白免疫印跡雜交（蛋白免疫印跡雜交（Western BlotWestern Blot，WB WB ）是將蛋白樣）是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)移到雜交本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)移到雜交膜上，然后通過一抗膜上，然后通過一抗/ /二抗復(fù)合物對靶蛋白進行特異性定性二抗復(fù)合物對靶蛋白進行特異性定性及定量檢測的方法。其鑒定蛋白質(zhì)的敏感性為及定量檢測的方法。其鑒定蛋白質(zhì)的敏感性為15ng15ng。 WB WB是進行蛋白質(zhì)分析時最常用技術(shù)之一。是進行蛋白質(zhì)分析時最常用技術(shù)之一。 檢測可溶性抗原、細胞成分的鑒定與分析，檢測與自

20、檢測可溶性抗原、細胞成分的鑒定與分析，檢測與自身變性細胞核成分結(jié)合的抗體身變性細胞核成分結(jié)合的抗體( (抗核抗體抗核抗體) )，HIVHIV的明確診斷。的明確診斷。28WBWB電泳、轉(zhuǎn)膜裝置電泳、轉(zhuǎn)膜裝置流流程程圖圖常見問題及解決方案常見問題及解決方案注意事項注意事項:1. 1. 免疫印跡雜交的敏感與檢測系統(tǒng)有關(guān). 因此, 凝膠電泳時的蛋白上樣量應(yīng)該保證被檢測抗原量不至于太低, 如果過低應(yīng)該重新純化和濃縮使用,或者建議做一次梯度稀釋, 上樣電泳后, 直接考馬斯亮藍染色選擇最佳上樣量.2. 2. 形成凝膠的試劑要有足夠的純度, 激活劑的濃度適當(dāng),不僅可以決定凝膠聚合的速度, 也將影響凝膠的質(zhì)量,

21、聚膠時的溫度也將影響凝膠聚合的速度. 因此,建議要根據(jù)不同溫度下適量增減激活劑的用量以保證分離膠從加入激活劑起至開始出現(xiàn)凝膠凝聚的時間為15-20分鐘最佳, 對于濃縮膠最佳聚合時間為8-10分鐘開始可見聚合.灌完分離膠加水封閉分離膠與外界氧氣的結(jié)合.3. 3. 未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性,操作時應(yīng)該戴手套口罩防護.梳子插入濃縮膠時,應(yīng)確保沒有氣泡,可將梳子稍微傾斜插入以減少氣泡的產(chǎn)生,梳子拔出來時應(yīng)該小心,不要破壞加樣孔,如有加樣孔上的凝膠歪斜可用針頭插入加樣孔中糾正但要避免針頭刺入膠內(nèi).4. 4. 電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺,同時建議低電壓短時間的預(yù)

22、電泳,清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì),疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通(恒壓10-20V, 20-30min)5. 5. 加樣前樣品應(yīng)先離心,尤其是長時間放置的樣品,以減少蛋白質(zhì)帶的拖尾現(xiàn)象6. 6. 為避免邊緣效應(yīng),可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液7. 7. 樣品緩沖液中煮沸的樣品可在-20存放數(shù)月,但是反復(fù)凍融會使蛋白質(zhì)降解. 8. 8. 為減少蛋白質(zhì)條帶的擴散,上樣后應(yīng)盡快進行電泳,電泳結(jié)束后也應(yīng)盡快轉(zhuǎn)印.9. 9. 上樣時,小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔 .10. 10. 取出凝膠后應(yīng)注意分清上下,可用刀片切去凝膠的一角作為標(biāo)記(如左上角)轉(zhuǎn)膜時也應(yīng)用同樣的方法對PDVF膜做上標(biāo)記(如

23、左上角)以分清正反面和上下關(guān)系.11. 11. 轉(zhuǎn)膜時應(yīng)依次放好PDVF膜與凝膠所對應(yīng)的電極,即凝膠對應(yīng)負(fù)極, PDVF膜對應(yīng)正極.免疫共沉淀免疫共沉淀 （Co-Immunoprecipitation） 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 其原理是：當(dāng)細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)a a的抗體免疫沉淀a a，那么與a a在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)b b也能沉淀下來。這種

24、方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。原原 理理Co-IPCo-IP工作示意圖工作示意圖bindingwashelutionbaYYYYYabaabb41利用western blot 確定捕獲蛋白收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min, 細胞裂解液于40C 10,000 rpm 離心10 min后取上清；取少量裂解液以備 western blot分析，剩余裂解液加1g相應(yīng)的抗體加入到細胞裂解液，40C緩慢搖晃孵育過夜；取10l protein A瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗 3 次，每次3,000 rpm 離心3

25、min；將預(yù)處理過的10l protein A瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中40C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；免疫沉淀反應(yīng)后，在40C以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗 610次；最后加入15l的2SDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；SDS-PAGE, Western blotting或質(zhì)譜儀分析。實實 驗驗 步步 驟驟注意事項注意事項: :（1）細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton x-100)。每

26、種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗確定。不能用高濃度的變性劑（SDS)，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的Cocktailer。（2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用（3）使用對照抗體： 單克隆抗體-正常小鼠的IgG或另一類單抗; 兔多克隆抗體-正常兔IgG(4) 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；(5) 要確?？贵w的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀；(6) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的，這需要進行蛋白質(zhì)的定位來確定。44實驗的關(guān)鍵實驗的關(guān)鍵實驗最

27、需要注意點就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也實驗最需要注意點就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，免疫染色能結(jié)合未必能用在不同，免疫染色能結(jié)合未必能用在IPIP反應(yīng)。建議仔細檢查反應(yīng)。建議仔細檢查抗體抗體的的說明書。特別是多克隆抗體的特異性問題。說明書。特別是多克隆抗體的特異性問題。為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進行實驗。劑，低溫下進行實驗。考慮抗體考慮抗體/ /緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在能沉降在beadsbea

28、ds上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。多則抗原被稀釋。優(yōu)點優(yōu)點: :相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響；的影響；可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物?？梢苑蛛x得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點缺點: :可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用；用；兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者兩種

29、蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；在中間起橋梁作用；如用如用western blotwestern blot檢驗，必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是檢驗，必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，若預(yù)測不正確，實驗就什么，以選擇最后檢測的抗體，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果。得不到結(jié)果。 免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)= =抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記示蹤物標(biāo)記靈敏性靈敏性特異性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+ +標(biāo)記技術(shù)酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)金免疫技術(shù)金

30、免疫技術(shù)生物素生物素- -親和素免疫放大術(shù)親和素免疫放大術(shù)分類分類常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)類別類別 標(biāo)記物標(biāo)記物 用途用途熒光素 FITC、RB200、TRITC 免疫組化 鑭系元素螯合物 免疫分析測定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫組化 免疫分析測定化學(xué)發(fā)光物 Luminol、lucigenin 免疫分析測定金屬顆粒 膠體金、鐵蛋白 免疫組化 免疫分析測定 51酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù) 基本原理 利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)的檢測敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。 基本特點基本特點 標(biāo)記后保

31、留酶和抗原(抗體)的活性； 酶促反應(yīng)專一性，保證特異性； 底物反應(yīng)放大作用，提高敏感性。 酶標(biāo)試劑保存穩(wěn)定； 操作簡便、安全易行。一、酶免疫技術(shù)的分類一、酶免疫技術(shù)的分類 酶免疫組化 用于檢測組織切片或細胞涂片中用于檢測組織切片或細胞涂片中酶免疫技術(shù) 的抗原或抗體檢測的抗原或抗體檢測 均相酶免疫測定 酶免疫測定 固相酶免疫測定 異相酶免疫測定 （ELISAELISA） 液相酶免疫測定二、酶免疫實驗的技術(shù)要點二、酶免疫實驗的技術(shù)要點 （一）固相載體 基本要求 結(jié)合容量高，結(jié)合穩(wěn)定；可與抗原抗體復(fù)合物等大分子蛋白結(jié)合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法簡便易行、快捷經(jīng)濟。種類與選擇1.塑料制品2

32、.微顆粒3.膜載體56（二）酶與酶作用底物（二）酶與酶作用底物1.用于標(biāo)記酶的要求：酶活性高標(biāo)記后酶活性穩(wěn)定，且不影響標(biāo)記抗原與抗體的免疫反應(yīng)性酶催化底物后信號易判定或測定酶活性不受樣品中其他成分的影響酶、輔助因子及底物理化性質(zhì)穩(wěn)定，安全無害，價廉2. 常用酶及其底物（1）辣根過氧化物酶 （horseradish peroxidasehorseradish peroxidase ，HRP） 常用底物：常用底物：鄰苯二胺（OPD）：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性。四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：反應(yīng)后呈藍色，無需避光，無致癌性，但水溶性差。（2 2） 堿性磷酸酶堿性磷酸酶（Alkaline phospha

33、taseAlkaline phosphatase，APAP） 常用底物為對硝基苯磷酸酯（常用底物為對硝基苯磷酸酯（p-NPPp-NPP），產(chǎn)物為黃色。），產(chǎn)物為黃色。 * * APAP穩(wěn)定性及靈敏性高于穩(wěn)定性及靈敏性高于HRPHRP，但不易獲得純品，酶標(biāo)記物，但不易獲得純品，酶標(biāo)記物 回收率低，且價高，故應(yīng)用不如回收率低，且價高，故應(yīng)用不如HRPHRP普及。普及。59（三）酶標(biāo)記抗體或抗原（三）酶標(biāo)記抗體或抗原 基本要求： 酶標(biāo)記抗原純度要高，抗原性完整；抗體的特異性好，效價高，親和力強，比活性高以及易于批量生產(chǎn)和分離純化。酶標(biāo)記方法 1.交聯(lián)法 以雙功能交聯(lián)劑為“橋”，分別與酶和抗體（抗原）

34、連接形成結(jié)合物。如戊二醛交聯(lián)法。2.直接法 用過碘酸鈉活化酶蛋白分子后，再與抗體（抗原）結(jié)合。僅適用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）標(biāo)記物制備。（四）標(biāo)記抗體鑒定（四）標(biāo)記抗體鑒定（五）免疫吸附劑（五）免疫吸附劑（六）試劑最佳工作濃度的選擇（六）試劑最佳工作濃度的選擇62三、酶聯(lián)免疫吸附試驗三、酶聯(lián)免疫吸附試驗 ( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)(一)基本原理：v使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性持其免疫活性（固相抗原抗體的形成）（固相抗原抗體的形成） v在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的

35、抗體或抗在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)體表面的抗原或抗體起反應(yīng)（抗原抗體反應(yīng)）（抗原抗體反應(yīng)）v用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。（酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物的分離）（酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物的分離） v加入底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)加入底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)

36、本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。 （顯色反應(yīng)）（顯色反應(yīng)）（二）（二）ELISAELISA技術(shù)類型：技術(shù)類型： ELISAELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有這種測定方法中有3 3種必要的試劑：種必要的試劑：v固相的抗原或抗體固相的抗原或抗體v酶標(biāo)記的抗原或抗體酶標(biāo)記的抗原或抗體v酶作用的底物酶作用的底物 酶 聯(lián) 試 劑 陽 性 對 照 酶 標(biāo) 記 物 顯 色 液 A 終 止 液 反 應(yīng) 板 顯 色 液 B 濃 縮 洗

37、滌 液 加 樣 槍 與 吸 頭 陰 性 對 照 1 1雙抗體夾心法雙抗體夾心法特點：特點：v非競爭結(jié)合反應(yīng)非競爭結(jié)合反應(yīng)v常用于抗原的檢測常用于抗原的檢測（Cytokines DeterminationCytokines Determination）v適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測而不能用于小分子半抗原的檢測v所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子的不同抗原決所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子的不同抗原決定簇定簇 2 2間接法間接法3.3.競爭法競爭法原原特點：特點：v用于抗原和半抗原的定量測定，也可對抗體進

38、行測定。用于抗原和半抗原的定量測定，也可對抗體進行測定。v酶標(biāo)酶標(biāo)AgAg（AbAb）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的非標(biāo)記）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的非標(biāo)記AgAg（AbAb）具有）具有相同的與固相相同的與固相Ab(Ag)Ab(Ag)結(jié)合的能力。結(jié)合的能力。v反應(yīng)體系中，固相反應(yīng)體系中，固相AbAb（AgAg）和酶標(biāo)）和酶標(biāo)AgAg（AbAb）是固定限量）是固定限量的，且前者的結(jié)合位點少于酶標(biāo)記與非標(biāo)記的，且前者的結(jié)合位點少于酶標(biāo)記與非標(biāo)記AgAg（AbAb）的）的分子數(shù)量和。分子數(shù)量和。v反應(yīng)后，結(jié)合與固相載體上復(fù)合物中被測定的酶標(biāo)反應(yīng)后，結(jié)合與固相載體上復(fù)合物中被測定的酶標(biāo) Ag Ag（AbAb）的量（酶活性

39、）與樣品中非標(biāo)記）的量（酶活性）與樣品中非標(biāo)記AgAg（AbAb）的濃度）的濃度成反比。成反比。注意事項：注意事項：加樣加樣 應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。保溫保溫 1、一般均采用水浴箱，使溫度迅速平衡。 2、為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔。洗滌： 決定著實驗的成敗決定著實驗的成敗! ! 目的：目的：洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。 洗滌的方式：洗滌的方式：除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種。比色：比色：比色前應(yīng)先

40、用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。用特定的波長測將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。用特定的波長測讀吸光值。讀吸光值。比色結(jié)果的表達以往通用光密度（比色結(jié)果的表達以往通用光密度（optical densityoptical density，ODOD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbenceabsorbence，A A），兩者含），兩者含義相同。義相同。 通常的表示方法是，將吸收波長寫于通常的表示方法是，將吸收波長寫于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收波長為的吸收波長為

41、492nm492nm，表示方法為，表示方法為AA492nm492nm 或或ODOD492nm492nm 四、固相膜免疫測定四、固相膜免疫測定 固相膜免疫測定與ELISA相類似,其特點是以微孔膜作為固相.標(biāo)記物可用酶和各種有色微粒子,如彩色乳膠、膠體金等。常用固相膜為硝酸纖維素（NC）膜。類型：類型：斑點酶免疫吸附試驗斑點酶免疫吸附試驗（dot-ELISA） 酶聯(lián)免疫斑點試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISPOT） 免疫印跡法免疫印跡法 （Western blot）酶聯(lián)免疫斑點試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzymelinked immunospot assay，ELISPOT)用已知細胞因子的抗體包被固相

42、載體，加入待檢效應(yīng)用已知細胞因子的抗體包被固相載體，加入待檢效應(yīng)細胞，溫育一定時間后洗去細胞，如待檢效應(yīng)細胞產(chǎn)細胞，溫育一定時間后洗去細胞，如待檢效應(yīng)細胞產(chǎn)生相應(yīng)細胞因子，則與已包被的抗體結(jié)合，再加入酶生相應(yīng)細胞因子，則與已包被的抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)記抗該細胞因子抗體，加底物顯色。標(biāo)記抗該細胞因子抗體，加底物顯色。一般選擇硝酸纖維素膜一般選擇硝酸纖維素膜(NC)(NC)或聚偏二氟乙烯或聚偏二氟乙烯(PVDF)(PVDF)膜膜覆蓋微量反應(yīng)板作為固相，在分泌相應(yīng)細胞因子的細覆蓋微量反應(yīng)板作為固相，在分泌相應(yīng)細胞因子的細胞所在局部呈現(xiàn)有色斑點，一個斑點表示一個分泌相胞所在局部呈現(xiàn)有色斑點，一個斑點表

43、示一個分泌相應(yīng)細胞因子的細胞，通過計數(shù)可推算出分泌某種細胞應(yīng)細胞因子的細胞，通過計數(shù)可推算出分泌某種細胞因子細胞的頻率。因子細胞的頻率。注意事項注意事項: :熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence technique) 是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。是將是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)檢測的敏感抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)檢測的敏感性和直觀性結(jié)合起來的一種方法。性和直觀性結(jié)合起來的一種方法?；驹砘驹?利用熒光素標(biāo)記抗體，使之在涂片上或組利用熒光素標(biāo)記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標(biāo)本中的待檢抗原特

44、異結(jié)合，采用織切片上與標(biāo)本中的待檢抗原特異結(jié)合，采用高發(fā)光效率的點光源，透過濾色板發(fā)出一定波高發(fā)光效率的點光源，透過濾色板發(fā)出一定波長的光，使結(jié)合在標(biāo)本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)長的光，使結(jié)合在標(biāo)本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來判斷有無待檢抗原或抗體。色形態(tài)，來判斷有無待檢抗原或抗體。一、免疫熒光顯微技術(shù)一、免疫熒光顯微技術(shù)（一）原理：（一）原理： 使熒光抗體與標(biāo)本切片中組織或細胞表面使熒光抗體與標(biāo)本切片中組織或細胞表面的抗原進行反應(yīng)，洗滌除去游離的熒光抗體后的抗原進行反應(yīng)，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，

45、在黑暗背景上可見明，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光。亮的特異熒光。（二）熒光抗體的制備（二）熒光抗體的制備（1 1）熒光抗體的標(biāo)記）熒光抗體的標(biāo)記 作為標(biāo)記的熒光素應(yīng)符合以下要求作為標(biāo)記的熒光素應(yīng)符合以下要求： 應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價健的化學(xué)基團，與應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價健的化學(xué)基團，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。物易于清除。 熒光效率高熒光效率高, ,與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率。光效率。 熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。 與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)，與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。質(zhì)，與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。 標(biāo)記方法簡單、安全無毒。標(biāo)記方法簡單、安全無毒。熒光抗體是將熒光素與特異性抗體以化學(xué)方式共價結(jié)合而成熒光抗體是將熒光素與特異性抗體以化學(xué)方式共價結(jié)合而成常用于標(biāo)記的熒光素常用于標(biāo)記的熒光素: : 異硫氰酸熒光黃異硫氰酸熒光黃（FITCFITC） 四乙基羅丹明四乙基羅丹明（RB200RB200） 四甲基異硫氰酸羅