1、第一章 基因克隆基因工程的基本技術(shù)有哪些？答：對(duì)核算分子的分離、純化、回收、分析和檢測、切割、連接和修飾，以及序列測定、誘變、擴(kuò)增和轉(zhuǎn)移等基因操作技術(shù)。構(gòu)建基因文庫一般使用什么作為載體？答：一般使用大腸桿菌作為載體克隆與亞克??？答：克隆在一等程度上等同于基因的分離。亞克隆是將目的基因所對(duì)應(yīng)的小段的DNA片段找出來。PCR對(duì)基因克隆有什么作用？答：現(xiàn)在基因克隆可以不用通過構(gòu)建基因文庫來實(shí)現(xiàn)，可以通過理性設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增獲得大多數(shù)所需要的基因。但是盡管如此，在不知道基因序列的情況下，如相互作用的基因，表達(dá)調(diào)控因子，新基因等，還需要構(gòu)建基因文庫來進(jìn)行基因克隆。第二章 分子克隆工具酶限制與修飾系統(tǒng)？答

2、：限制系統(tǒng)可以排除外來DNA。限制的作用實(shí)際就是降解外源DNA，維護(hù)宿主穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。甲基化是常見的修飾作用，宿主通過甲基化來達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的作用。并且能夠保證自身的DNA不被降解。使用最廣泛的限制酶？答：EcoR I是應(yīng)用最廣泛的限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶的命名？答：宿主屬名第一字母、種名頭兩個(gè)字母、菌株號(hào)+序列號(hào)。如： H in d III限制與修飾系統(tǒng)分類？答：至少可分為3類。II類所占比例最大，其酶分子為內(nèi)切酶與甲基化分子不在一起，識(shí)別位點(diǎn)為4-6bp的回文序列，切割位點(diǎn)為識(shí)別位點(diǎn)中或者靠近識(shí)別位點(diǎn)。其限制反應(yīng)與甲基化反應(yīng)是分開的反應(yīng)。不需要ATP的參與。限制酶識(shí)別

3、的序列長度？結(jié)構(gòu)？答：一般為4-6個(gè)bp，即每256和每4096個(gè)堿基中存在一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)?；匚男蛄?，不對(duì)稱序列，多種不同序列，間斷對(duì)稱序列限制酶產(chǎn)生的末端？答：1、黏末端2、平末端3、非對(duì)稱突出末端什么是同裂酶？分類？答：識(shí)別相同序列的限制酶稱為同裂酶。但他們的切割位點(diǎn)有可能不同。分為：1、同位同切酶2、同位異切酶3、同工多位酶4、其他限制性內(nèi)切酶的作用是什么？它的反酶是什么？答：什么是同尾酶？答：許多不同的限制酶切割DNA產(chǎn)生的末端是相通的，切實(shí)對(duì)稱的，即他們可產(chǎn)生相同的黏性突出末端。酶切的緩沖液中一般含有什么？作用是？答：調(diào)控pH的緩沖劑：穩(wěn)定溶液的pHMg2+：穩(wěn)定酶的作用，提高酶的活性

4、，提高酶的特異性DDT（二硫蘇糖醇）：防止DNA二聚化，影響酶切結(jié)果BSA（小牛血清蛋白）：防止了酶的貼壁效應(yīng)（可使酶變形），同時(shí)減少非特異性吸附，對(duì)酶有穩(wěn)定和促進(jìn)的作用。酶切的反應(yīng)溫度？反應(yīng)時(shí)間？中止酶切的方法?答：反應(yīng)溫度大多為37，時(shí)間一般為2-3h。中止的方法是在65下反應(yīng)20min。什么星星活性？抑制其發(fā)生的辦法？答：在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能夠切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特性稱為星星活性。抑制星星活性的措施有很多，如減少酶的用量（可避免過分酶切）、減少甘油濃度、保證反應(yīng)體系中唔有機(jī)溶劑或乙醇、提高離子強(qiáng)度到100-150mmol/L（如果不會(huì)抑制酶活性的話）和降低反應(yīng)pH

5、至pH7.0以及保證使用Mg2+作為2價(jià)陽離子。影響酶活性的因素有？答：可分為內(nèi)因和外因外因是可預(yù)見的，可控的：反應(yīng)條件、底物的純度（是否有雜質(zhì)、是否有鹽離子和苯酚的污染）、何時(shí)加酶、操作是否恰當(dāng)、反應(yīng)提及的選擇以及反應(yīng)時(shí)間的長短等。內(nèi)因有：星星活性、底物甲基化和底物構(gòu)象（線性還是超螺旋）原核細(xì)胞有幾種DNA聚合酶？其特點(diǎn)是什么？答：DNA聚合酶I是單鏈多肽，可催化單鏈或者雙鏈DNA的延長；DNA聚合酶II則與低分子脫氧核苷酸鏈的延長有關(guān)；DNA聚合酶III在細(xì)胞中存在的數(shù)目不多，是促進(jìn)DNA鏈延長的主要酶。DNA聚合酶I的三種活性?答：4、置換反應(yīng)，若體系中只含有一種dNTP，那么會(huì)一直重復(fù)

6、3過程，直至漏出與該dNTP互補(bǔ)的堿基?？傊跊]有dNTP的情況下，外切酶活性占主導(dǎo)地位，而當(dāng)存在足夠的dNTP時(shí)，外切活性和合成活性將處在平衡狀態(tài)中，結(jié)果使得雙鏈DNA稱為平末端。切口平移法是什么？答：切口平移法是作為DNA聚合酶I 的一個(gè)應(yīng)用，Klenow DNA 聚合酶是什么？有什么特征？有什么應(yīng)用？答：Klenow DNA聚合酶是DNA聚合酶I去掉了5-3外切酶活性的一種聚合酶。但其3-5端的外切酶活性保留。因此應(yīng)用更為廣泛：T4噬菌體DNA聚合酶是怎么得到的？有什么活性？應(yīng)用？答：來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌。其活性與KlenowDNA聚合酶相似，但是其3-5端外切核酸酶活性要強(qiáng)2

7、00倍。且不從單鏈模板上置換引物，應(yīng)用：耐熱DNA聚合酶有那些？特征是？作用？答：耐熱DNA聚合酶是指在高溫下具有活性的DNA聚合酶，來自噬高溫的細(xì)菌，主要用于PCR反應(yīng)。有TaqDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等等。DNA連接酶和DNA聚合酶作用方法相同嗎？應(yīng)用相同嗎？答：作用方法都是催化磷酸二酯鍵的形成，但DNA連接酶是連接兩個(gè)DNA片段，可以是環(huán)狀DNA可以是單鏈DNA，而DNA聚合酶是作用一個(gè)一個(gè)的核苷酸，在復(fù)制中發(fā)揮作用。反轉(zhuǎn)錄酶的來源和活性？答：來源于AMV（禽成髓細(xì)胞瘤病毒），含有兩條多肽鏈，具有5-3DNA聚合酶活性和很強(qiáng)的RNase H活性。后者的活性可以用于反轉(zhuǎn)錄后降解掉

8、原RNA。末端轉(zhuǎn)移酶來源？活性？答：來源于小牛胸腺，是一種不尋常的DNA聚合酶，是一種不依賴于模板的DNA聚合酶。在2價(jià)陽離子存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加于DNA分子的3羥基端，改變DNA分子的末端序列。連接酶有哪些？T4連接酶的作用過程？答：有T4 DNA連接酶、大腸桿菌連接酶、Taq連接酶、T4 RNA連接酶T4連接酶的作用過程：催化DNA 5磷酸基與3羥基之間形成磷酸二酯鍵。反應(yīng)物為黏末端、切口、平末端的RNA（效率低）或DNA。低濃度的PEG和單價(jià)陽離子可以提高平末端連接速度。T4多核苷酸激酶是什么？有什么活性？T4多核苷酸激酶是一種磷酸化酶，可將ATP上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA分子

9、5上。具有兩種活性：1、正反應(yīng)：使本來沒有磷酸基團(tuán)的DNA5磷酸化。2、交換反應(yīng)：使DNA分子5的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到ADP上，再讓ATP上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到該DNA分子的5上，發(fā)生交換反應(yīng)。將ATP上的磷酸基團(tuán)標(biāo)記，應(yīng)用廣泛。此酶在高ATP濃度是發(fā)揮最佳，NH4+是其強(qiáng)烈抑制劑。堿性磷酸酶的用途？答：他們均能催化除去DNA或RNA5的磷酸的反應(yīng)，通過去除5磷酸基團(tuán)，可以防止DNA片段發(fā)生自連，或標(biāo)記（5）前除去DNA或RNA5磷酸。核糖核酸酶A的作用？作用方式?答：廣泛用來除去DNA樣品中的RNA。除去DNA：RNA中未雜交的RNA區(qū)，可用來確定DNA或RNA中單堿基突變的位置。核糖核酸酶H 的作用

10、？答：特異性水解與DNA雜交的RNA上的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生帶有3羥基和5磷酸末端的產(chǎn)物。主要用于cDNA克隆合成第二鏈之前，除去RNA。脫氧核糖核苷酸酶I的作用？應(yīng)用？答：DNase I 來源于牛胰，是內(nèi)切核苷酸酶，優(yōu)先從嘧啶核苷酸的位置水解雙鏈或者單鏈DNA。在Mg2+作用下，獨(dú)立作用于每條DNA鏈，其切割位點(diǎn)隨機(jī)。有Mg2+切割ds DNA同一位置，產(chǎn)生平末端或者12個(gè)核苷酸突出的DNA片段。其用途廣泛：切口平移標(biāo)記時(shí)在ds DNA上隨機(jī)產(chǎn)生切口；在閉環(huán)DNA上引入單切口，將分子截短；除去RNA樣品中的DNA。第三章 分子克隆載體什么是載體？應(yīng)具備有什么特征？答：將外源DNA或基因片段攜帶入

11、宿主細(xì)胞的工具稱為載體。應(yīng)具備以下特征：1、在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制（具備復(fù)制原點(diǎn)）2、必須具備合適的酶切位點(diǎn)，供外源DNA片段插入，同時(shí)不影響其復(fù)制3、有一定的標(biāo)記基因，用于篩選4、最好有較高的拷貝數(shù)，便于載體的制備?；蚩寺≈甘裁?？基因文庫是怎樣得到的？答：利用重組DNA技術(shù)分離目的基因的過程，稱為基因克隆。由大量的含有基因組DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的所克隆構(gòu)成的特殊群體，稱之為基因文庫。大腸桿菌載體的復(fù)制與什么有關(guān)？答：其載體上一般帶有Pmb1質(zhì)粒與ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。其RNAII的和成，與RNase H的作用有利于RNAII形成三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu)，

12、從而引導(dǎo)質(zhì)粒的復(fù)制。而RNAI的合成能夠阻斷RNAII的二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，ROP能夠增強(qiáng)RNAI的作用。因此削弱RNAI 與RNAII之間的作用有利于增加復(fù)制子的拷貝數(shù)嚴(yán)謹(jǐn)性質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒表示什么？答：嚴(yán)謹(jǐn)性質(zhì)粒在每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)有限，大約1幾個(gè)，而松弛型的拷貝數(shù)較多，可達(dá)幾百。氯霉素可以提高質(zhì)?？截悢?shù)的原理？答：氯霉素或者壯觀霉素能夠抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制，而質(zhì)粒能夠繼續(xù)復(fù)制，最終每個(gè)細(xì)胞中可以積聚2000-3000個(gè)質(zhì)粒。從而提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)質(zhì)粒的不相容性和不相容群的定義？答：質(zhì)粒的不相容性指的是，兩個(gè)質(zhì)粒不能夠同時(shí)在同一個(gè)宿主中共存的現(xiàn)象。它是指在第二個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入后，在不涉及

13、DNA限制系統(tǒng)時(shí)出現(xiàn)的現(xiàn)象。不相容質(zhì)粒一般都利用同一復(fù)制機(jī)制，從而導(dǎo)致不能共存于同一宿主中。不相容群指那些由不相容質(zhì)粒組成的一個(gè)群體，一般有相同的復(fù)制子。那么質(zhì)粒的拷貝數(shù)和質(zhì)粒的不相容性相互矛盾嗎？答：復(fù)制機(jī)制一樣可理解為復(fù)制量受到的調(diào)控是一樣的，但由于質(zhì)粒長短和結(jié)構(gòu)不一樣，復(fù)制速率是不同的，所以在達(dá)到質(zhì)粒復(fù)制量飽和時(shí)，復(fù)制快的必定占有更多比例，細(xì)胞分裂分配后，復(fù)制快的質(zhì)粒就多一點(diǎn)。細(xì)胞繁殖幾代后，復(fù)制速率慢的質(zhì)粒就接近于消失，這就是不相容原理。1. 如果兩種復(fù)制機(jī)制（復(fù)制起點(diǎn)附近區(qū)域序列）一樣的質(zhì)粒，復(fù)制速率也完全一樣，那么它們是能一直共存的（但是要平分拷貝數(shù)，比如拷貝數(shù)是60，那么各自只有

14、30）2. 復(fù)制機(jī)制不一樣，也就是他們的質(zhì)粒復(fù)制飽和量受不同因子調(diào)控，那么各自達(dá)到飽和量后再分配，互不影響，可以共存（不平分拷貝數(shù)，比如一個(gè)是60一個(gè)是20，那么總共有80）什么是質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性？答：質(zhì)粒具有轉(zhuǎn)移性。在自然條件下，很多質(zhì)粒可以通過稱為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主細(xì)胞內(nèi)。標(biāo)記基因分為哪幾類？答：按用途可分為、選擇標(biāo)記基因2、篩選標(biāo)記基因選擇標(biāo)記基因用于鑒別目的DNA（載體）的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來：抗生素抗性基因是目前使用最廣泛的標(biāo)記基因，有：1、氨芐青霉素抗性基因2、四環(huán)素抗性基因3、氯霉素抗性基因篩選標(biāo)記基因可以用于攜帶了外源DNA片段的的重組子挑選出來。有：1、互

15、補(bǔ)（藍(lán)白板篩選）2、插入失活藍(lán)白板篩選（互補(bǔ)）的原理是？答：質(zhì)粒載體的種類有？作用？答：1、克隆載體：擴(kuò)增DNA片段，保存DNA片段。PUC18和PUC19是最常用的質(zhì)粒載體，只有2686bp，結(jié)構(gòu)組成緊湊，幾乎不含多余的DNA片段。PBR322.目前是使用廣泛的許多質(zhì)粒載體幾乎都是由此發(fā)展而來的2、表達(dá)載體：在克隆載體的基礎(chǔ)上衍生而來，主要添加了強(qiáng)啟動(dòng)子，以及有利于表達(dá)產(chǎn)物分泌、分離或純化的原件。噬菌體的溶原周期？答：感染敏感細(xì)菌后不增殖，不引起宿主菌裂解，而是噬菌體的基因整合于細(xì)菌染色體中，這樣的噬菌體稱為溫和噬菌體。此過程稱為溶原周期。噬菌體的裂解周期？答：烈性噬菌體（virulent

16、phage）感染宿主細(xì)胞后就進(jìn)入裂解反應(yīng)，使宿主細(xì)胞裂解。整個(gè)過程包括：吸附、侵入、脫殼、生物合成、裝配和釋放。這個(gè)過程稱為裂解周期。噬菌體基因組的大小的范圍是多殺，上下限是？答：當(dāng)基因組DNA長度為野生型噬菌體基因組DNA的78%105%時(shí)，不會(huì)影響其存活能力。野生噬菌體的基因組DNA為48kb，若使用的外源DNA片段能夠完全替換可取代區(qū)域，外源DNA片段的大小將在923kb范圍內(nèi)。第五章 表達(dá)載體表達(dá)載體的組成？答：表達(dá)載體是在克隆載體的基礎(chǔ)上增加了表達(dá)元件，就構(gòu)成了表達(dá)載體。各種表達(dá)載體的不同就在于表達(dá)元件的不用。表達(dá)原件包括什么？答：1、啟動(dòng)子2、終止子3、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）表

17、達(dá)載體的表達(dá)形式有？答：分為兩種。1、直接轉(zhuǎn)錄并翻譯出目的基因開放閱讀框?qū)?yīng)的氨基酸序列，即表達(dá)出完整的目的蛋白。2、目的基因可以以融合蛋白的形式表達(dá)。T7噬菌體啟動(dòng)子的表達(dá)載體的表達(dá)機(jī)制？答：首先，T7啟動(dòng)子必須結(jié)合T7RNA聚合酶才能使目的基因的到表達(dá)。宿主的調(diào)控系統(tǒng)：當(dāng)沒有誘導(dǎo)物誘導(dǎo)時(shí)，lacI基因能夠表達(dá)，產(chǎn)生阻抑物質(zhì)，組織T7RNA聚合酶的產(chǎn)生，但可能有滲漏表達(dá)。、載體系統(tǒng)的調(diào)控（三級(jí)調(diào)控）：A、宿主細(xì)胞染色體上lac基因?qū)7TNA聚合酶合成的調(diào)控吧B、T7RNA聚合酶的活性受T7溶菌酶的限制C、收到在載體上裝載的lacI基因的調(diào)控。表達(dá)載體融合蛋白的分離？答：用作分離的載體蛋白被

18、稱為標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽，常用的有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）、六聚組氨酸太，蛋白質(zhì)A，和纖維素結(jié)合域(CBD)等。如圖所示，GST基因與多克隆位點(diǎn)的外源基因相連接，可以達(dá)到分離的目的。表達(dá)產(chǎn)物的純化？答：1、包含體蛋白的純化：目的基因表達(dá)后的產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)可以累積并形成顆粒狀的的包含體。通過破碎細(xì)胞，離心，洗滌可以得到目的蛋白高達(dá)90%的包含體，再通過鹽酸孤、尿素和SDS等溶解包含體，在通過一定的辦法使蛋白質(zhì)折疊。2、可溶性蛋白的純化：從細(xì)胞碎液上清液中純化的可溶性表達(dá)產(chǎn)物，一般可展現(xiàn)應(yīng)有的蛋白質(zhì)活性。也正是表達(dá)的目的蛋白。蛋白質(zhì)表達(dá)純在的問題？答：常規(guī)蛋白質(zhì)的表達(dá)大腸桿菌能夠滿足，但對(duì)于某個(gè)蛋白

19、質(zhì)的來說，是否能大量表達(dá)，表達(dá)的蛋白是否有活性，是否能高效純化，會(huì)受到很多因素的影響。蛋白質(zhì)自身的屬性會(huì)影響表達(dá)或活性？答：會(huì)影響表達(dá)和活性的因素：1、蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，越大則可溶性蛋白越少。2、目的蛋白對(duì)細(xì)胞生長是否有毒性3、蛋白質(zhì)的糖基化和二硫鍵的形成等修飾4、膜蛋白表達(dá)是一個(gè)問題。宿主與載體的關(guān)系？答：宿主與載體一般都都是配套使用的。但不排除更換了宿主能夠是目的基因得到更好的表達(dá)。什么是穿梭載體？答：穿梭載體就是能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體。如有些載體能夠在原核細(xì)胞中復(fù)制又能在真核細(xì)胞中復(fù)制。這類載體主要是質(zhì)粒載體。大腸桿菌的質(zhì)粒載體是最簡單的，所以只要涉及到大腸桿菌以

20、外的細(xì)胞，絕大多數(shù)裝有大腸桿菌質(zhì)粒載體的基本元件，他們都可以看作是穿梭載體。因此，穿梭載體主要是突出其在非大腸桿菌中的操作。用來表達(dá)外源基因。第六章 基因操作中大分子的分離和檢測質(zhì)粒堿裂法的原理？答：高pH使質(zhì)粒DNA和染色體DNA變性，同時(shí)沉淀蛋白質(zhì)。再將pH值調(diào)至中性，質(zhì)粒DNA較小，很容易復(fù)性成雙鏈。而染色體DNA較大，纏結(jié)成網(wǎng)狀不溶物質(zhì)，從而可以通過離心除去。提取質(zhì)粒各溶液的作用？答：2、溶液I（Tris-HCl EDTA）：重懸菌體，提供緩沖環(huán)境。溶液II（SDS NaOH）：氫氧化鈉和SDS裂解菌體細(xì)胞壁，在細(xì)胞膜上穿孔釋放細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒。溶液III（KAc 冰醋酸）：中和氫氧化鈉、

21、SDS中的鈉被鉀替換，吸附菌體沉淀，并且高鹽溶液使蛋白質(zhì)沉淀。試劑盒回收原理？答：試劑盒的膠回收柱采用特殊硅基質(zhì)材料在一定的高鹽緩沖系統(tǒng)下高效、專一地吸附DNA、RNA的原理，配備設(shè)計(jì)獨(dú)特的離心吸附柱式結(jié)構(gòu)，使用常規(guī)臺(tái)式高速離心機(jī)，在幾分鐘之內(nèi)即可以高效回收核酸片段。Binding Buffer是為了增加洗脫柱對(duì)核酸的結(jié)合活性，Wash Solution 是洗掉柱子里除核酸物質(zhì)以外的雜質(zhì)，Elution Buffer則是最后把DNA從柱子上洗脫下來使用的溶液。聚丙烯酰胺凝膠電泳？答：為，垂直電泳其分辨率較高，可達(dá)到1bp，在DNA序列測定中發(fā)揮重要作用?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的電泳。脈沖場凝膠電泳？答：

22、脈沖場電泳可以有效地分離大相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段。脈沖場凝膠電泳是瓊脂糖凝膠電泳的改進(jìn)方式，是專門針對(duì)大片段DNA的分析檢測方法。紫外吸收法檢測DNA與RNA的濃度和純度？答：OD260/280od260是核酸吸收的最高峰，od280是蛋白吸收的最高峰。當(dāng)od260/280處于1.8-2.0時(shí)，核酸的純度較高。由于rna是單鏈，所以紫外吸收會(huì)比dna高一些，所以雙鏈dna的od260/280一般在1.8左右，而rna的od260/280在2.0左右。OD260/230 （你寫反了）od230是某些有機(jī)試劑和多糖的吸收峰，要是這個(gè)值很高，說明你的核酸很純，要是這個(gè)值很低，說明有有機(jī)試劑或多糖污

23、染。一般高于2就很好了。DNA濃度（ug/ml ）=OD260/0.02×L×稀釋倍數(shù)DNA的純化？答：低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳RNA的分離、檢測和純化答：RNA的分離主要是對(duì)mRNA的分離。1、控制潛在的RNA酶活性2、RNA的抽提和純化3、RNA的純化：由于真核生物mRNA3端的poly(A)尾可與oligo（dT）-纖維素吸附，因此可以利用親和層析法分離mRNA分子雜交的類型有？1、southern 雜交： a、southern 印記轉(zhuǎn)移：即把瓊脂糖凝膠電泳上的單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上b、用基因探針與濾膜上的單鏈DNA進(jìn)行分子雜交，如果能夠形成雜交帶，則說明有目的基因的

24、存在。還能檢測DNA片段的大小。這種方法的要求就是一定要有基因探針。2、northern 雜交：與southern 雜交完全相同，只是轉(zhuǎn)移的是RNA，雜交的也是RNA?？梢杂脕黹_判斷在轉(zhuǎn)錄水平上某基因是否表達(dá)。3、western 雜交：與southern 雜交類似，只不過轉(zhuǎn)移的是蛋白質(zhì)，雜交的也是蛋白質(zhì)。用于檢測細(xì)胞或組織樣品中是否存在被沒抗體是別的蛋白質(zhì)，從而判斷在翻譯水平上某基因是否表達(dá)。4、菌落雜交：將細(xì)菌菌落影印到濾膜上，或?qū)⒕N點(diǎn)到濾膜上，然后再生長出可見的菌落，對(duì)濾膜上的菌體進(jìn)行原位裂解，使DNA釋放出來，并使之固定在濾膜上。然后通過分子雜交，判斷哪個(gè)或哪些菌落含有與探針同源的DN

25、A.DNA微陣列分析？答：是一種高通量的斑點(diǎn)雜交技術(shù)。探針標(biāo)記？答：采用同位素標(biāo)記和非同位素標(biāo)記。探針為有一定長度的DNA、RNA或寡核苷酸單鏈。使用之前要進(jìn)行標(biāo)記。隨機(jī)引物標(biāo)記：1、制作隨機(jī)引物：利用由6個(gè)核苷酸組成的序列隨機(jī)的寡核苷酸為引物，在klenowDNA聚合酶的作用下，對(duì)待標(biāo)記的DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增。這樣便擁有了由該6中核苷酸組成的所有序列，采用已經(jīng)標(biāo)記的dNTP，便制成隨機(jī)引物。什么是感受態(tài)細(xì)胞？答：細(xì)胞處于能夠吸收DNA的狀態(tài)稱感受態(tài)細(xì)胞，處于感受態(tài)的細(xì)胞稱作感受態(tài)細(xì)胞。氯化鈣制備感受態(tài)細(xì)胞原理？答：細(xì)菌處于 0,CaCl2 的低滲溶液中,菌細(xì)胞膨脹成球形,轉(zhuǎn)化混合物中的 DNA

26、 形成抗DNase 的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面,經(jīng) 42短時(shí)間熱沖擊處理,促使細(xì)胞吸收 DNA 復(fù)合物.鈣離子的作用是結(jié)合于細(xì)胞膜上,是細(xì)胞膜呈現(xiàn)一種液晶態(tài).在冷熱變化刺激下液晶態(tài)的細(xì)胞膜表面會(huì)產(chǎn)生裂隙,使外源DNA進(jìn)入.流程：電轉(zhuǎn)化法？答：也稱作電穿孔法，是一種將極性分子穿過細(xì)胞膜導(dǎo)入細(xì)胞的一種物理方法，在這個(gè)過程中一個(gè)較大的電脈沖短暫破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層，從而允許DNA等分子進(jìn)入進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)染？答：轉(zhuǎn)化(transformation)指將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺

27、傳信息轉(zhuǎn)移過程也稱轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)染是通過病毒實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。PCR擴(kuò)增原理？答：1、DNA模板的變性（9296）：雙鏈變單鏈。2、復(fù)性（退火）（3742）：引物與模板結(jié)合3、延伸（72）：DNA聚合酶將dNTP連續(xù)加到引物的3端，合成DNA。退火溫度盡可能高，防止非特異性結(jié)合。PCR的反應(yīng)體系？答：緩沖液， CaCl2、上游引物、下游引物、模板DN、dNTP、Taq酶、A/T克隆法？答：TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片段與一個(gè)具有3-T突出的載體DNA連接起來的方法。因?yàn)镻CR反應(yīng)中所使用的聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移的活性，通常在3'加上A。例如：Taq聚合酶同

28、時(shí)具有的末端連接酶的功能，PCR反應(yīng)時(shí)在每條PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3端自動(dòng)添加一個(gè)3-A突出端。只有用經(jīng)過特殊處理的具有3-T突出末端的DNA片斷才能通過T/A配對(duì)進(jìn)行連接。通過PCR的方法擴(kuò)增目的基因片斷的過程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，獲得的目的片斷通常需要通過TA克隆的方法，重組到T-載體中，通過序列測定清楚DNA序列。達(dá)到高效克隆的目的。染色體步查法？答：染色體步查采用一段分離自某一重組體一端的非重復(fù)DNA片段作為探針以鑒定含有相鄰序列的重組克隆。其中包含有反向PCR：反轉(zhuǎn)錄PCR的步驟？答：第九章 DNA序列分析第一代測序技術(shù)與第二代測序技術(shù)的區(qū)別？答：第一代測序技術(shù)為先合成后

29、測序。第二代測序技術(shù)為邊合成邊測序。Sanger雙脫氧鏈終止法？答：DNA片段序列測定的策略有？答：1、通用引物指導(dǎo)未知序列的測定：將待測的未知序列DNA片段裝載到載體上，再通過通用引物來測定待測片段的末端序列。2、引物步移：知道了未知序列中的一小段DNA序列，可以根據(jù)該序列來設(shè)計(jì)引物，從而測定該已知序列周圍的片段。并可以以此類推，引物步移3、隨機(jī)克隆測序：第十一章 DNA文庫的構(gòu)建和目的基因的篩選基因文庫定義？答：也稱DNA文庫，是指某一生物體全部或部分基因的集合，像一個(gè)沒有目錄的“圖書館”。將含有某種生物不同基因的DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各菌分別含有這種生物不同的基因，稱為基因文庫?；蛭膸斓慕M成？答：有三部分組成。1、外源DNA片段2、載體3、宿主構(gòu)建基因文庫的基本程序？答：1、提取研究對(duì)象基因DNA，制備合適大小的DNA片段，或提取組織或器官的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；2、DNA片段或cDNA與經(jīng)過特殊處理的載體連接形成重組DNA；3、重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝后侵染受體菌；4、陽性重組菌落或噬菌斑的選擇基因文庫分類？答：按照外源DNA片段來源，可將基因文庫分為基因組DNA文庫和cDN