1、高效液相色譜法測(cè)定奶粉中三聚氰胺含量 High-performance liquid chromatography (HPLC) in melamine milk powder content 系別：環(huán)境工程系 專業(yè)名稱：食品營(yíng)養(yǎng)與檢測(cè) 班級(jí)：101 姓名：賀斌學(xué)號(hào):08摘 要目的：測(cè)定奶粉中三聚氰胺的含量。方法：采用甲醇-0.02mol/L硫酸銨（體積比 4：96）為流動(dòng)相，流動(dòng)相溶解樣品， Hedera 5-C8（4.6×250mm，5m）柱(江蘇漢邦科技)分離,235nm檢測(cè)。結(jié)果：線性范圍為 26.24ng 2099.2ng(r=0.9999,n=9),平均回收率為 96.8

2、2%，RSD=1.57%（n=9）。結(jié)論：該方法奶粉中三聚氰胺的含量結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可操作性強(qiáng),適用于奶粉中三聚氰胺的定性定量檢測(cè)。關(guān)鍵詞：三聚氰胺；奶粉；HPLCABSTRACTObjective: to determine melamine milk powder in the content. Methods: using methanol - 0.02 mol/L ammonium sulfate (volume but 6 than) as mobile phase, the current phase solubility samples, Hedera 5 - C8 (4.6

3、 x 250mm, 5 muon m) column (jiangsu chamberlain overseas technology) 235nm detection separation,. Results: the linear range for 26.24 ng 2099.2 ng (r = was 0.9999, n = 9), and the average recovery was 96.82%, RSD = 1.57% (n = 9). Conclusion: this method melamine milk powder in the content, the resul

4、ts are stable good reproducibility, the maneuverability is strong, applicable to commercial melamine qualitative and quantitative detection.Key words: Melamine; Milk powder; HPLC目錄1 實(shí)驗(yàn)1.1 儀器和試藥 儀器 1.1.2 試藥1.2 色譜條件1.3 對(duì)照品溶液的配制1.4 供試品溶液的制備2 結(jié)果與討論2.1 線性和定量限2.2 精密度考察2.3 重復(fù)性考察2.4 加樣回收考察2.5 樣品測(cè)定2.6 討論 波長(zhǎng)選

5、擇 流動(dòng)相選擇 樣品提取溶劑選擇 2.6.4 樣品提取時(shí)間選擇 樣品提取方法選擇 與國(guó)標(biāo)法的比較3 參考文獻(xiàn)1 實(shí)驗(yàn) 1.1 儀器和試藥 儀器 高效液相色譜儀 LC310 包括 LC-P100高壓恒流泵，LC-UV100紫外檢測(cè)器，LC-C0100柱溫箱， LC-WS310液相色譜工作站，均為江蘇天瑞信息技術(shù)有限公司產(chǎn)品，電子天平（賽多利斯），超聲波清洗器（張家港神科超聲），紫外分光光度計(jì)（上海精密），精密酸度計(jì)（上海精科），超純水機(jī)（南京易普易達(dá)）。 試藥 磷酸二氫鉀、磷酸、硫酸銨、檸檬酸、醋酸、醋酸銨，氨水，三氯乙酸，均為分析純；辛烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉，均為色譜純；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)

6、 Tedia 公司）；水（超純水，自制）。三聚氰胺對(duì)照品從上海安譜公司購(gòu)買，供含量測(cè)定用。奶粉市場(chǎng)購(gòu)買各品牌。三氯乙酸溶液（1）：準(zhǔn)確稱取 10 g三氯乙酸于 1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。氨化甲醇溶液（5）：準(zhǔn)確量取5 mL氨水和 95mL甲醇，混勻后備用。陽(yáng)離子交換固相萃取柱：混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱，基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60mg，3mL。使用前依次用 3mL甲醇、5 mL水活化。后備用。1.2 色譜條件色譜柱Hedera 5-C8（4.6×250mm，5m）(江蘇漢邦科技)；流動(dòng)相：甲醇 0.02mol/L硫酸銨（體積比 4：96）（使用前

7、用孔徑為 0.45m的微孔濾膜濾過(guò)），流速： 0.4 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm，柱溫：26， 進(jìn)樣量：10L。在此色譜條件下按三聚氰胺的峰計(jì)算均在4000以上，且能到達(dá)基線分離。 1.3對(duì)照品溶液的配制 精密稱取三聚氰胺對(duì)照品32.8mg，置50ml棕色容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得三聚氰胺對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液2ml于50ml棕色容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得三聚氰胺對(duì)照品溶液（每1ml中含三聚氰胺 26.24g）。 1.4供試品溶液的制備 精密稱取奶粉樣品2g，精確到0.0001g于50ml具塞塑料離心管中，加入15mL三氯乙酸（1%）溶液和5

8、mL乙腈，超聲提取10min，再振蕩提取10min后，以不低于 4000r/min離心 10min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤(rùn)濕的濾紙過(guò)濾后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL濾液，加入5mL水混勻后做待凈化液。 將待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中。依次用3mL水和3mL甲醇洗滌，抽至近干后 ，用6mL氨化甲醇溶液洗脫。整個(gè)固相萃取過(guò)程流速不超過(guò)1mL/min。洗脫液于50下用氮?dú)獯蹈?，殘留物（相?dāng)于 0.4g樣品）用1mL流動(dòng)相定容，渦旋混合 1min，過(guò)微孔濾膜后，供 HPLC測(cè)定。分別吸取對(duì)照品溶液（圖1），供試品溶液（圖2）10l進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖如下： 圖1：三聚氰胺對(duì)照品溶液圖2：奶粉樣

9、品溶液圖1：三聚氰胺圖2：奶粉樣品溶液2結(jié)果與討論 2.1線性和定量限 配制三聚氰胺質(zhì)量濃度為2.624g/ml、7.872g/ml、13.120g/ml、18.368g/ml、 26.240g/ml、52.480g/ml、131.200g/ml、157.400g/ml、209.920g/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.2中色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，分別進(jìn)樣10L，以濃度X（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，得回歸方程為：Y=311.28X 1235.40， r=0.9999，線性范圍為：26.24ng 2099.2ng，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與峰面積值具有良好的線性關(guān)系。 將標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋進(jìn)樣，以性噪比為 1

10、0（S/N=10）計(jì)算，三聚氰胺的最低檢出濃度為 0.20992g/ml,按1.4中樣品處理方法，奶粉中三聚氰胺最低檢出限為2.0992ng。 2.2精密度考察 精密吸取上述C=26.24g/ml的對(duì)照品溶液10L，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得其RSD=0.66%，表明精密度良好。 2.3重復(fù)性考察 取同一樣品6份，分別按1.4項(xiàng)下方法處理測(cè)定，得其含量的RSD=0.51%。 2.4加樣回收考察 精密稱取已經(jīng)含量的供試品1g共9份，精確到0.0001g于50ml具塞塑料離心管中，分為3組，每組3份，第一組加入三聚氰胺2mg，第二組加入三聚氰胺5mg，第三組加入三聚氰胺10mg，按1.4項(xiàng)下方法處理，分別

11、取10L進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算其平均回收率為：96.82%，RSD=1.57%（n=9）。 2.5樣品測(cè)定 選取不同廠家的奶粉分別按國(guó)標(biāo)法和上述測(cè)定方法測(cè)定三聚氰胺的含量，結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果表明：該方法測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。 表1 樣品測(cè)定結(jié)果（mg/kg） 品名國(guó)標(biāo)法本法雅士利27.8628.02三 鹿1295.251279.46雅 培未檢出未檢出貝因美未檢出未檢出伊利2.462.51 多美滋未檢出未檢出2.6 討論 波長(zhǎng)選擇 取三聚氰胺對(duì)照品溶液，在 190nm 400nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，得到光譜掃描圖，結(jié)果顯示在 235nm處有最大吸收，三聚氰胺也能到達(dá)基線分離，因此選擇 235nm作為檢測(cè)

12、波長(zhǎng)。 流動(dòng)相選擇 除國(guó)標(biāo)方法1用1%氫氧化鈉溶液調(diào)流動(dòng)相PH=3以外，考察了乙腈-庚烷磺酸鈉緩沖液2 ，甲醇-0.02mol/l硫酸銨3 ，乙腈-辛烷磺酸銨緩沖液4 （檸檬酸調(diào)PH=3.0）, 10.0mmolL的庚烷磺酸鈉（HCl調(diào)PH3.0）-乙腈5，0.05molL磷酸二氫鉀溶液(磷酸調(diào) pH值至3O)-乙腈7，10mmol/L醋酸鈉溶液(醋酸調(diào)pH=3)-乙腈9等系統(tǒng)，最后選擇甲醇 -0.02mol/l硫酸銨（4：96），對(duì)流動(dòng)相比例、柱溫、流速進(jìn)行反復(fù)的篩選，最后確定了本法的色譜條件。在該色譜條件下測(cè)定，得到良好的峰形，適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間，較高的理論板數(shù)，均符合國(guó)標(biāo)檢測(cè)要求。 樣品提取

13、溶劑選擇 在相同條件下，考察了中各流動(dòng)相、1%三氯乙酸+乙腈1、甲醇6、乙腈7、50%乙腈8作為提取溶劑的情況，結(jié)果表明：1%三氯乙酸+乙腈的提取率最高，雜質(zhì)最少，因此選擇國(guó)標(biāo)方法中提取溶劑為提取溶劑。 樣品提取時(shí)間選擇 在相同條件下，考察樣品進(jìn)行2min、5min、10min、15min、20min超聲的情況，結(jié)果表明，樣品在超聲10min時(shí)提取率最高，15min和20min時(shí)均無(wú)明顯的提高，因此選擇超聲10min作為樣品的提取時(shí)間。 樣品提取方法選擇 在相同條件下，考察樣品分別考察先超聲10min再振搖10min、直接超聲20min和直接振搖20min的樣品提取情況，結(jié)果先超聲10min再

14、振搖10min提取效率最高，故選擇先超聲10min再振搖10min作為提取方法。 與國(guó)標(biāo)法的比較通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，使用國(guó)標(biāo)法測(cè)定三聚氰胺時(shí)，存在以下情況：1）儀器系統(tǒng)平衡時(shí)間較長(zhǎng)，基線漂移較大，是因?yàn)橐译婧碗x子對(duì)試劑不易混合均勻，容易產(chǎn)生氣泡；2）每次配制離子對(duì)緩沖液時(shí)要調(diào)節(jié)PH值，操作復(fù)雜；3）離子對(duì)試劑價(jià)格昂貴，成本費(fèi)用較高。本文提出的HPLC法，有以下優(yōu)點(diǎn)：1）儀器系統(tǒng)平衡時(shí)間短；2）流動(dòng)相配置簡(jiǎn)捷，成本低；3）本方法的檢測(cè)限為0.5mg/kg，高于國(guó)標(biāo)方法。本法測(cè)定奶粉中三聚氰胺的含量，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、適用性好、回收率高，適合奶制品行業(yè)的質(zhì)量控制。 3 參考文獻(xiàn) 1GB/T22388-2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法M,中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社出版。 2NY/T1372-2007飼料中三聚氰胺的測(cè)定M，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社出版。 3汪輝,曹小彥，彭新凱，等.高效液相色譜-二極管陣列法測(cè)定高蛋白食品中的三聚氰胺 J，食品與機(jī)械，2007，23(5):1114-115，124. 4倪沁顏.高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定飼料中三聚氰胺的含量J，福建分析測(cè)試,2008,17(1)：57-59. 5趙永彪，李自春，劉婷，等.高效液相色譜法測(cè)定寵物食品中的三聚氰胺J，分析試驗(yàn)室,2008,27增刊:190-