1、核酸等溫擴增技術在病毒核酸等溫擴增技術在病毒檢測中的應用檢測中的應用軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所楊銀輝楊銀輝核酸等溫擴增技術核酸等溫擴增技術核酸等溫擴增的優(yōu)勢核酸等溫擴增的優(yōu)勢核酸等溫擴增的種類核酸等溫擴增的種類環(huán)介導核酸等溫擴增技術環(huán)介導核酸等溫擴增技術（LAMP）LAMP引物設計原則引物設計原則LAMP擴增引物設計擴增引物設計LAMP擴增過程擴增過程環(huán)引物在莖環(huán)結構環(huán)狀結構處識別并不斷延伸，使雙鏈過早打開，有利于復雜莖環(huán)結構的成環(huán)和外引物置換作用。這一定程度上加速了整個 LAMP 擴增循環(huán)階段的反應。LAMP的操作過程的操作過程檢測方法檢測方法LAMP技

2、術在病原體檢測中的應用技術在病原體檢測中的應用LAMP技術小結技術小結LAMP技術的優(yōu)點技術的優(yōu)點存在缺陷存在缺陷 所識別的靶位序列長度不得過大，一般在所識別的靶位序列長度不得過大，一般在300 bp 300 bp 以內。因此，無法進行長片段以內。因此，無法進行長片段 DNA DNA 的擴增；的擴增； LAMP LAMP 技術具備高靈敏度，對操作要求嚴格分區(qū)，技術具備高靈敏度，對操作要求嚴格分區(qū)，否則極易受到污染而產生假陽性結果；否則極易受到污染而產生假陽性結果； LAMP LAMP 的反應結果只有兩種即擴增與不擴增，故在的反應結果只有兩種即擴增與不擴增，故在產生非特異性擴增時是難以進行后續(xù)鑒

3、定的；產生非特異性擴增時是難以進行后續(xù)鑒定的； 產物相當復雜，無法進行后續(xù)的回收、鑒定、克隆產物相當復雜，無法進行后續(xù)的回收、鑒定、克隆等基因工程操作。等基因工程操作。NASBA的優(yōu)缺點的優(yōu)缺點 NASBA 是種 RNA 擴增法，因此其主要應用是對 RNA 病毒的檢測。 整個反應能在 42條件下進行，經過兩個小時的擴增可將模板 RNA放大至 1091010倍。 靈敏度高、特異性強、保真度高。 反應成分復雜、需要三種酶導致成本偏高、須重復加入逆轉錄酶和 T7 RNA 聚合酶。滾環(huán)放大滾環(huán)放大(rollingcircle amplification, RCA)技術技術 基于滾環(huán)只有在單鏈閉合狀態(tài)并

4、有相應引物存在下才能同溫滾動復制的原理。 基于連接酶連接、引物延伸與鏈置換擴增反應的一種等溫核酸擴增方法。在恒溫的條件下,可以產生大量的與環(huán)型探針互補的重復序列。 RCA反應體系組成：反應體系組成： 噬菌體 29DNA 聚合酶、單鏈環(huán)狀 DNA 模板和引物（一條或一對也可多條）。 噬菌體 29 DNA 聚合酶具備很強的鏈置換活性，無需模板分離，酶性穩(wěn)定，可連續(xù)數(shù)小時高效催化合成 DNA。RCA的擴增原理的擴增原理SAT技術技術 實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術（Simultaneous Amplification and Testing，簡稱SAT）是將新一代的核酸恒溫擴增技術和實時熒光檢測技術相

5、結合的一種新型核酸檢測技術。該技術具有高靈敏度、高特異性、低污染、反應穩(wěn)定等優(yōu)點。 同一溫度下，首先通過M-MLV反轉錄酶產生靶標核酸（RNA）的一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶從該DNA拷貝上產生多個（1001000個）RNA拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉錄開始進入下一個擴增循環(huán)；同時，帶有熒光標記的探針和這些RNA拷貝特異結合，產生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，實時反映擴增循環(huán)情況。SAT技術的原理技術的原理SAT技術（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA（Transcription mediated ampl

6、ification）恒溫擴增技術發(fā)展起來的一項最新核酸檢測技術，是國內企業(yè)自主研發(fā)的專利技術SAT技術的優(yōu)勢技術的優(yōu)勢 針對靶標核酸特異設計的引物和分子信標，實現(xiàn)特異性的擴增和檢測，有效防止假陰性結果。 SAT檢測的靶標核酸是RNA，而RNA在病原體外的環(huán)境中易降解，檢測結果可作為區(qū)分死菌、活菌的依據，因此更利于用藥之后療效的監(jiān)測和判愈。 SAT技術的高靈敏度、高特異性則可以最大程度地確保檢測結果的高度準確，高度可靠，有效避免假陽性、假陰性結果。IMSA擴增擴增IMSA擴增的原理擴增的原理IMSA擴增的原理擴增的原理IMSA擴增的優(yōu)點擴增的優(yōu)點 IMSA 不僅擁有 LAMP 檢測技術類似的應用

7、優(yōu)點，在引物設計和擴增原理上還具有其獨有的特點，使得其具備比 LAMP 更高檢測靈敏度的潛力。 該技術一定程度上能打破日本 LAMP 專利在我國的應用限制，使其更好地服務于我國的傳染病防控、食品安全檢測和環(huán)境物種保護等各個領域。RPA技術lRPA（recombinase polymerase amplification）技術，2006年由劍橋大學的Olaf Piepenburg等人建立。l該技術利用一種重組酶使單鏈引物與雙鏈DNA模板中互補片段結合，啟動DNA復制；不需要DNA解鏈過程。l其具有便攜，免去PCR儀等大型實驗室設備的使用；快速，20分鐘內得到檢測結果；靈敏度高，幾個拷貝即可檢出；便于保藏，采用凍干粉末狀酶等優(yōu)點。l 近年來，各國學者陸續(xù)利用RPA技術，對于DNA病毒、細菌等進行核酸檢測。 RPA技術簡介RPA的原理的原理tetrahydrofuran abas