1、實(shí)驗(yàn)五實(shí)驗(yàn)五 細(xì)菌的單染色和革蘭氏染色細(xì)菌的單染色和革蘭氏染色 目目 的的 要要 求求n學(xué)習(xí)對(duì)學(xué)習(xí)對(duì)細(xì)菌的涂片細(xì)菌的涂片、染色和、染色和無(wú)菌操作技無(wú)菌操作技術(shù)術(shù)。 n了解了解染色原理染色原理、學(xué)習(xí)并掌握、學(xué)習(xí)并掌握單染色單染色和和革革蘭氏染色技術(shù)蘭氏染色技術(shù) 。 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 原原 理理 微生物學(xué)中常用的是微生物學(xué)中常用的是單染色法單染色法和和革蘭氏染色法革蘭氏染色法。 單染色法：?jiǎn)稳旧ǎ菏怯靡环N染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài)，不能辨是用一種染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài)，不能辨別細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)造，通常采用別細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)造，通常采用堿性染料堿性染料（如（如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅復(fù)紅 等

2、）使其著色。等）使其著色。 當(dāng)在中性、弱堿性、弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷。當(dāng)在中性、弱堿性、弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷。而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷，而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷， 因此堿性因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。 革蘭氏染色法：革蘭氏染色法：是是18841884年由丹麥病理學(xué)家年由丹麥病理學(xué)家C.GramC.Gram所創(chuàng)立的。是所創(chuàng)立的。是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細(xì)菌分為將細(xì)菌分為G G+ +菌和菌和G G菌菌，是由

3、這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 原原 理理實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 材材 料料n菌種：菌種：E.coli （大腸桿菌）（大腸桿菌） 、B.subtilis（枯草芽孢桿菌）（枯草芽孢桿菌） 或?qū)嶒?yàn)室所培養(yǎng)雜菌或?qū)嶒?yàn)室所培養(yǎng)雜菌 n試劑：試劑：石炭酸復(fù)紅染色液、革蘭氏染色液石炭酸復(fù)紅染色液、革蘭氏染色液( (草酸銨結(jié)晶草酸銨結(jié)晶紫、碘液、紫、碘液、95%乙醇、沙黃乙醇、沙黃/ /番紅染色液番紅染色液） n其他：其他：顯微鏡、載玻片、生理鹽水、酒精燈、接種環(huán)、顯微鏡、載玻片、生理鹽水、酒精燈、接種環(huán)、吸水紙、擦鏡紙等吸水紙、擦鏡紙等實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn)

4、 程程 序序一、一、單染色法：?jiǎn)稳旧ǎ?涂片涂片干燥固定干燥固定染色染色水洗水洗干燥干燥鏡鏡檢檢（高倍鏡、油鏡）（高倍鏡、油鏡）二、二、革蘭氏染色：革蘭氏染色： 涂片涂片干燥固定干燥固定結(jié)晶紫初染結(jié)晶紫初染水洗水洗碘液媒碘液媒染染水洗水洗酒精酒精脫色脫色水洗水洗沙黃復(fù)染沙黃復(fù)染水洗水洗干干燥燥鏡檢鏡檢1.1. 洗凈載玻片洗凈載玻片：先將載玻片洗凈，擦干。：先將載玻片洗凈，擦干。 2.2. 涂片：涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片中央加一滴蒸餾水取干凈載玻片一塊，在載玻片中央加一滴蒸餾水( (生理鹽水生理鹽水) )，按無(wú)菌操作法取樣品菌涂片，做成菌懸液。，按無(wú)菌操作法取樣品菌涂片，做成菌懸液。（

5、討論：討論：取菌多少對(duì)結(jié)果的影響？取菌多少對(duì)結(jié)果的影響？） 3 3. . 晾干：晾干：讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文火烘干。讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文火烘干。 4.4. 固定固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過(guò)：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過(guò)火焰火焰2-32-3次固次固定定（以不燙手為宜）。（以不燙手為宜）。 （討論：討論：固定的目的？固定的目的？） 單染色法單染色法5. 5. 染色：染色：將固定過(guò)的涂片放在廢液缸上的擱架上，加復(fù)紅將固定過(guò)的涂片放在廢液缸上的擱架上，加復(fù)紅染染色色1-2min1-2min。 6. 6. 水洗：水洗：用水洗去涂片上的染色液。用水洗去涂片上的染色液

6、。 7. 7. 干燥：干燥：將洗過(guò)的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。將洗過(guò)的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。 （討論：討論：干燥的目的？干燥的目的？） 8. 8. 鏡檢：鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，最后用油鏡。先低倍觀察，再高倍觀察，最后用油鏡。 單染色法視頻單染色法視頻n1. 1. 涂片涂片- -干燥干燥- - 固定固定 2. 2. 初染初染：在做好的涂面上滴加在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液草酸銨結(jié)晶紫染液，染染1-1-2 2分鐘分鐘，傾去染液，流水沖洗至無(wú)紫色。，傾去染液，流水沖洗至無(wú)紫色。 n3. 3. 媒染媒染：先用新配的先用新配的碘液碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面沖去殘水，

7、而后用其覆蓋涂面1 1分鐘分鐘，后水洗。，后水洗。 革蘭氏（革蘭氏（Gram）染色法：）染色法：n4. 4. 脫色脫色：除去殘水后，滴加除去殘水后，滴加95%95%酒精酒精進(jìn)行脫色約進(jìn)行脫色約2525秒左右秒左右，后立即用流水沖洗后立即用流水沖洗 n5. 5. 復(fù)染復(fù)染：滴加滴加番紅染色液番紅染色液，染，染2 2分鐘分鐘，水洗后用吸水紙吸，水洗后用吸水紙吸干。干。 n6. 6. 鏡檢鏡檢：觀察染色結(jié)果并繪圖。觀察染色結(jié)果并繪圖。革蘭氏（革蘭氏（Gram）染色）染色視頻視頻1.1.涂片不可太厚涂片不可太厚，會(huì)造成假陽(yáng)性。，會(huì)造成假陽(yáng)性。2.2.固定時(shí)固定時(shí)不能在火上烤的時(shí)間太長(zhǎng)不能在火上烤的時(shí)間

8、太長(zhǎng)，否則菌體收縮變形。，否則菌體收縮變形。 3.3.染色后必須晾干染色后必須晾干后才能用油鏡鏡檢后才能用油鏡鏡檢 。4.4.革蘭氏染色成敗的革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過(guò)度，革蘭如脫色過(guò)度，革蘭氏陽(yáng)性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時(shí)間過(guò)短，氏陽(yáng)性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時(shí)間過(guò)短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被染成革蘭氏陽(yáng)性菌。革蘭氏陰性菌也會(huì)被染成革蘭氏陽(yáng)性菌。 5. 5. 菌齡也有影響菌齡也有影響。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽(yáng)性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。革蘭氏陽(yáng)性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。 染色中注意事項(xiàng)：染色中注意事項(xiàng)： n1.1.你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭氏染色結(jié)果的正你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？確