1、光學(xué)顯微鏡的原理及構(gòu)造顯微鏡是人類(lèi)認(rèn)識(shí)物質(zhì)微觀世界的重要工具，是現(xiàn)代科學(xué)研究工作不可缺少的儀器之一。顯微鏡自1666 年問(wèn)世以來(lái)已有300 多年的歷史了，其間隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，顯微鏡的品種不斷增加，結(jié)構(gòu)和性能逐步得到完善和提高。根據(jù)不同的使用用途，光學(xué)顯微鏡可分為普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡、倒置顯微鏡、體視顯微鏡、偏光顯微鏡等10 多種。目前，世界上許多國(guó)家都可以生產(chǎn)光學(xué)顯微鏡，牌名、種類(lèi)繁雜，其中德國(guó)、日本等國(guó)制造的顯微鏡品質(zhì)、數(shù)量占優(yōu)勢(shì)，但價(jià)格昂貴。對(duì)于現(xiàn)代的光學(xué)顯微鏡，包括各種簡(jiǎn)單的常規(guī)檢驗(yàn)用顯微鏡、萬(wàn)能研究以及萬(wàn)能照相顯微鏡等，首先要認(rèn)識(shí)其構(gòu)造及各部件的功

2、能，同時(shí)要掌握正確的調(diào)試、使用和保養(yǎng)方法，才能在實(shí)際應(yīng)用中面對(duì)各種要求時(shí)以不同的顯微鏡檢方法，充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的功能，提高常規(guī)檢驗(yàn)工作效率.光學(xué)顯微鏡的原理和構(gòu)造隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，顯微鏡檢方法由最傳統(tǒng)的明視野、暗視野發(fā)展出了相差法、偏光方法； 熒光方法也由透射光激發(fā)進(jìn)展為落射光激發(fā)，使熒光效率大為提高；微分干涉相襯方法基于偏光方法，而巧妙地利用了微分干涉棱鏡，使之能應(yīng)用于醫(yī)學(xué)與生物學(xué)的樣品，又能應(yīng)用于金相樣品的分析與檢驗(yàn)。下面以德國(guó)ZEISS公司生產(chǎn)的Axioplan 萬(wàn)能研究用顯微鏡，簡(jiǎn)單介紹萬(wàn)能顯微鏡的基本組成部件。1. 顯微鏡主機(jī)體(stand ) 顯微鏡的主機(jī)體設(shè)計(jì)成金字塔形，而底

3、座的截面呈T 字形，使顯微鏡的整體相當(dāng)穩(wěn)固。顯微鏡的光學(xué)部件和機(jī)構(gòu)調(diào)節(jié)部件、光源的燈室、顯微照相裝置、電源變壓穩(wěn)壓器等，都可安裝在主機(jī)體上或主機(jī)體內(nèi)。2. 顯微鏡的底座(base)底座和主機(jī)體通常組成一個(gè)穩(wěn)固的整體。底座內(nèi)通常裝有透射光照明光路系統(tǒng)(聚光、集光和反光)部件，光源的濾光片組，粗/ 微調(diào)焦機(jī)構(gòu)，光源的視場(chǎng)光闌也安裝在底座上。3. 透射光光源(tranilluminator ) 透射光光源由燈室(lamp housing )、燈座(lampsocket ) 、 鹵素?zé)?( halogen lamp ) 、 集光與聚光系統(tǒng)( lamp collector and lamp conden

4、ser )及其調(diào)整裝置組成。4. 透射光光源與反射光光源的轉(zhuǎn)換開(kāi)關(guān)(toggle switch ) 這是新一代AXIO系列顯微鏡特有的裝置，透射光和反射光可通用。當(dāng)具有透/ 反兩用的配置時(shí)，利用這一轉(zhuǎn)換開(kāi)關(guān)能方便而又迅速的使透射光和反射光互相轉(zhuǎn)換。在純透射光的配置中，這一開(kāi)關(guān)就改為電源開(kāi)關(guān)。5. 電源開(kāi)關(guān)(mains switch )與亮度調(diào)節(jié)旋鈕(brightness control ) 電源開(kāi)關(guān)用來(lái)接通或切斷顯微鏡所需用的交流電源。電源開(kāi)關(guān)旋鈕也可調(diào)節(jié)照明光源的亮度，使所觀察的視域可隨時(shí)獲得適當(dāng)?shù)牧炼?，可調(diào)范圍為 3-12V。作顯微照相時(shí)，可根據(jù)曝光以及彩色底片色溫的要求來(lái)調(diào)節(jié)燈光的亮度。

5、當(dāng)準(zhǔn)備關(guān)掉電源之前，應(yīng)先將亮度調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)到最小。6. 粗、微調(diào)焦旋鈕(coaxial coarse/fine focusing controls) 調(diào)焦旋鈕轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)帶動(dòng)燕尾導(dǎo)板上下移動(dòng)，而導(dǎo)板上則裝有物臺(tái)托架和聚光鏡托架，從而使物臺(tái)趨向或遠(yuǎn)離物鏡達(dá)到調(diào)焦的效果。7. 透射光用的濾光片選擇按鈕(push buttons for filter magazine ) 透射光顯微鏡檢方法所需用的一組濾光片已安裝在顯微鏡的底座內(nèi)，通過(guò)底座外的按鈕就可以根據(jù)不同的需要來(lái)選擇適用的一塊或一組濾光片。通常的濾光片配套有：(1) 藍(lán)色色溫轉(zhuǎn)換濾光片：用來(lái)把光源的色溫由3200K 轉(zhuǎn)換成日光型彩色底片所需的5500

6、K色溫；(2) 綠色濾光片：用來(lái)增強(qiáng)相差觀察方法中成像的反差，或者以黑白底片作顯微照相時(shí)，可以提高片成像的反差；(3) 淺灰色濾光片：是透光率為50%的中性減光濾光片，可把視野的亮度減弱一半；(4) 灰色濾光片：是透光率為25%的中性減光濾光片，可把視野的高度減弱75%；(5) 透光率僅為6%的中性減光濾光片，可把視野的亮度變得相當(dāng)暗，95%以上的光都已被吸收掉。8. 光源的視場(chǎng)光闌(luminuos field diaphragm ) 視場(chǎng)光闌是顯微鏡照明光路系統(tǒng)中的重要部件之一，它只能按照庫(kù)勒照明系統(tǒng)的要求來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)，視場(chǎng)光闌不可以任意開(kāi)大，但要根據(jù)使用的物鏡倍數(shù)來(lái)調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)拇笮?。視?chǎng)光闌

7、的主要功用有：(1) 控制雜散光在成像光路系統(tǒng)中的影響，特別是免除雜散光對(duì)照相系統(tǒng)的干擾，使顯微照相的底片不至于蒙上一層灰霧；(2) 控制照明光束的大小，使所觀察的視域能受到均勻的照明；(3) 在熒光顯微鏡檢方法中，可以把激發(fā)光限制在所需激發(fā)樣品的視域范圍內(nèi)，以防止視域外的樣品過(guò)早受到激發(fā)。9. 聚光鏡系統(tǒng)(condenser system ) 聚光鏡系統(tǒng)是照明光路系統(tǒng)中的重要部件之一，它也只能按照庫(kù)勒照明系統(tǒng)的調(diào)整要求來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。聚光鏡系統(tǒng)調(diào)整的好壞，可以直接影響顯微鏡 視域中照明的均勻性，也可影響顯微鏡的分辨力，還可以直接控制顯微照相底片上的反差。聚光鏡系統(tǒng)通常由以下幾個(gè)部件組成：(1)

8、聚光鏡本體( condenser ) 可以是簡(jiǎn)單的阿貝聚光鏡，也可以是消球差- 消色差的優(yōu)質(zhì)聚光鏡，另外還有一種是消除了內(nèi)應(yīng)力的偏光聚光鏡。聚光鏡的重要參數(shù)之一是數(shù)值孔徑( NA)，通常為0.32；這樣的數(shù)值孔徑太小，只能與以下的物鏡配合使用，因此需配用前端透鏡來(lái)提高數(shù)值孔徑，以便與不同倍數(shù)的物鏡靈活配合使用；(2) 前端透鏡(front lens ) 前端透鏡本身的數(shù)值孔徑通常為0.63 、 0.90 、 1.30 或 1.40 ，它要附裝在聚光鏡本體上，可以方便地?cái)[進(jìn)或擺出光路。最常用的前端透鏡數(shù)值孔徑為0.90 ，當(dāng)它擺入光路時(shí)，可以和10×及以上的物鏡配用，擺出光路時(shí)可以和1

9、0×以下的物鏡如 6.3 ×、5×及2.5 ×等物鏡配用；(3) 聚光鏡的孔徑光闌(aperture diaphragm ) 孔徑光闌實(shí)際上是一個(gè)可變光圈，它是顯微鏡照明光路系統(tǒng)中的又一個(gè)重要部件，在透射光明視野法、微分干涉相襯法以及偏光法所使用的聚光鏡中，都裝有孔徑光闌。它可以影響顯微鏡在作觀察時(shí)的分辨力；直接控制顯微照相底片上的反差；可用來(lái)調(diào)節(jié)聚光鏡的數(shù)值孔徑，配合所用物鏡的數(shù)值孔徑，以取得最佳的分辨本領(lǐng)，或最大的分辨本領(lǐng)；還可以使光源的發(fā)光體成像于孔徑光闌所在的平面上，從而滿(mǎn)足庫(kù)勒照明系統(tǒng)的前提條件。在實(shí)際操作中，調(diào)節(jié)聚光鏡孔徑光闌可以改變顯微鏡中

10、所觀察到的視野亮度，這是由于歷史上對(duì)聚光鏡孔徑光闌的誤解所造成的錯(cuò)誤用法。這里要特別強(qiáng)調(diào)：不應(yīng)該用聚光鏡的孔徑光闌來(lái)調(diào)節(jié)視野中的亮度、更不應(yīng)該用調(diào)節(jié)聚光鏡位置高低的方法來(lái)調(diào)節(jié)視野中的亮度！以往的錯(cuò)誤用法希望能在實(shí)際操作中糾正過(guò)來(lái)。(4) 轉(zhuǎn)盤(pán)( turret ) 在多用途聚光鏡系統(tǒng)中，為方便才把明視野的孔徑光闌、暗視野的中央光擋、相差法所需用的各種不同直徑的環(huán)狀光圈、微分干涉相襯法用的 DIC棱鏡及其孔經(jīng)光闌等部件裝在轉(zhuǎn)盤(pán)上再嵌入到聚光鏡本體的座子內(nèi)，使用時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)盤(pán)就可以選用不同顯微鏡檢法所適用的聚光鏡，方便而又快捷。聚光鏡系統(tǒng)有兩個(gè)調(diào)節(jié)裝置：a. 聚光鏡的調(diào)中螺絲(centering scr

11、ews ) 調(diào)中螺絲通常為1 對(duì)，位于聚光鏡托架前方的左右測(cè)。和環(huán)形燕尾槽中的調(diào)中螺絲成三足鼎立之勢(shì)，可以聚光鏡前后、左右調(diào)整，使聚光鏡的光軸與照明光路、成像光路合軸；b. 聚光鏡托架的上下調(diào)節(jié)裝置(vertical adjustment of condenser carrier )： 利用這個(gè)調(diào)節(jié)裝置，可使聚光鏡的位置作上下調(diào)動(dòng)，使視場(chǎng)光闌經(jīng)過(guò)聚光鏡在樣品視野中的成像調(diào)到最為清晰，光闌像的位置也可利用托架上的調(diào)中螺絲來(lái)進(jìn)行調(diào)中，從而滿(mǎn)足庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整的要求。10. 機(jī)械移動(dòng)式載物臺(tái)(specimen stage ) 載物臺(tái)可以承載樣品，裝有可在水平方向上作前后、左右移動(dòng)的調(diào)節(jié)裝置，有的還可

12、以在水平方向上作大約100 度的旋轉(zhuǎn)，以便使樣品能更好地與顯微照相的取景框相適配。11. 物鏡轉(zhuǎn)換器( nosepiece ) 物鏡轉(zhuǎn)換器安裝在滑插式燕尾槽座上，已作了準(zhǔn)確的對(duì)中?？裳杆俑鼡Q物鏡。常用的有6 個(gè)、 5 個(gè)及 4 個(gè)孔位的物鏡轉(zhuǎn)換器。12. 物鏡( objectives ) 物鏡是顯微鏡的核心光學(xué)部件，顯微鏡的放大倍數(shù)、分辨本領(lǐng)、色差與像差的校正狀況、工作距離等，都有直接由物鏡來(lái)決定。衡量物鏡質(zhì)量的基本參數(shù)主要有：a. 色差消正的程度(或級(jí)別)；b. 像場(chǎng)平坦的程度；c. 所使用的玻璃材料。數(shù)值孔徑(NA)是物鏡最重要的參數(shù)，數(shù)值孔徑越大，分辨率越高。目前物鏡的數(shù)值孔徑最大只有

13、1.30 。按照物鏡色差和像差校正的程度，物鏡可以分為以下類(lèi)別：(1) 消色差物鏡( achomats) 通常對(duì)紅光與藍(lán)光兩種色光作了色差校正，但視域中像場(chǎng)的平坦程度并未作過(guò)完善的校正，因此只能作一般的觀察應(yīng)用。在偏光顯微鏡中，由于需要消除物鏡內(nèi)各個(gè)鏡片的內(nèi)應(yīng)力，反而需要利用這種鏡片數(shù)目不多的物鏡來(lái)做偏光物鏡。(2) 有限平像場(chǎng)消色差物鏡(flat-field achromats ) 這也是對(duì)兩種色光作了校正的消色差物鏡， 但視域范圍內(nèi)像場(chǎng)的平坦程度只作了有限范圍內(nèi)的校正，通常在顯微照相取景框范圍內(nèi)像場(chǎng)是平坦的，以確保顯微照相對(duì)焦的清晰，取景框范圍以外，往往不一定能保證同樣的清晰度。適用于常規(guī)

14、檢驗(yàn)而又需要作顯微照相的工作中。(3) 完善平像場(chǎng)消色差物鏡( plan-achromats ) 這也是對(duì)兩種色光作了校正的高級(jí)消色差物鏡，主要特點(diǎn)是像場(chǎng)在整個(gè)視域中作了完善的校正，適合于作要求較高的顯微鏡檢工作，特別是作顯微照相效果更好。由于這種物鏡仍采用常用的光學(xué)玻璃，不適宜作熒光等這一類(lèi)弱光的觀察和照相。(4) 螢石玻璃消色差物鏡( neofluar ) 這也是對(duì)兩種色光作了色差校正的消色差物鏡，其中全部或部分鏡片則采用了可透過(guò)近紫外光(波長(zhǎng)約為365nm) 的螢石玻璃(即氟化鈣晶體)來(lái)制造。因此特別適合于作熒光與相差方法的觀察與顯微照相，也可用在偏光顯微鏡中。(5) 完善平像場(chǎng)復(fù)消色差

15、物鏡( plan-opo-chromats ) 這是最高一級(jí)的消色差物鏡，對(duì)紅、綠、藍(lán) 3 種顏色都作了很好的色差校正，而視域中的像也作了完善的校正，數(shù)值孔徑比螢石物鏡大，可應(yīng)用于要求極高的顯微觀察與顯微照相中，但價(jià)格十分昂貴，由于所使用的鏡片數(shù)目多達(dá)12 片，光能損失較大，不宜用作熒光觀察與照相。(6) 已消除內(nèi)應(yīng)力又可以調(diào)節(jié)中心的物鏡(pol Z objectives ) 這是一種適用于作偏光觀察的物鏡，是從以上所介紹的幾種物鏡中挑選出來(lái)的，在裝配時(shí)特別注意消除了其中的內(nèi)應(yīng)力，以免內(nèi)應(yīng)力所引起的干涉條紋干擾了偏光樣品中真正的干涉條紋。(7) 完善平像場(chǎng)螢石消色差多種介質(zhì)浸沒(méi)式物鏡(plan

16、-neofluar imm. ) 這是一種新型物鏡， 采用螢石玻璃制造其中全部或部分鏡片，成像質(zhì)量特別明亮，反差十分好，色差接近于復(fù)消色差，因此又屬于半復(fù)消色差物鏡。數(shù)值孔徑特別大，透光能力強(qiáng)，而且分辨率十分好。最大的特點(diǎn)是可用好幾種浸沒(méi)介質(zhì)，如常用的浸沒(méi)油、甘油、蒸餾水等，既可使用權(quán)蓋玻片也可以不使用。這種物鏡制成干式物鏡時(shí)，可加上校正環(huán)，用來(lái)校正蓋玻片的厚度不均勻性， 以消除蓋玻片厚度不規(guī)則造成的成像失真，對(duì)于厚度在0.12-0.22mm 之間的蓋玻片都可以作相應(yīng)的校正。1986年以來(lái)，德國(guó)蔡司公司推出的新一代光學(xué)顯微鏡，其中的物鏡突破了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的概念，采用了無(wú)限遠(yuǎn)色差校正的光學(xué)系統(tǒng)

17、(infinity color-corrected system ，簡(jiǎn)稱(chēng) ICS 物鏡)， 其特點(diǎn)是：由物鏡射出的成像光束是一束平行光，可在成像光路中按需要插入任意多的光學(xué)部件而不影響成像質(zhì)量。在顯微鏡鏡體內(nèi)有一特制的鏡筒透鏡( tube lens )與物鏡相配，兩者結(jié)合起來(lái)把物鏡的色差與像差都作了十分完善的校正，而且物鏡的視域相當(dāng)寬闊，比傳統(tǒng)物鏡的視域擴(kuò)大約40% 。這是為作熒光觀13. 熒光濾光片組插板的插口(slot for the fluorescence slider察時(shí)插入熒光濾光片組插板預(yù)留的插口。14. 勃氏鏡插板的插口(slot for Bertcand-lens slide

18、r ) 這是為作偏光觀察時(shí)插入勃氏鏡插板預(yù)留的插口，勃氏鏡是偏光顯微鏡中用作錐光干涉圖試驗(yàn)的重要部件。15. 補(bǔ)色器插板的插口(slot for auxiliary objects) 這是當(dāng)作微分干涉相襯觀察和偏光需加入的各種補(bǔ)色器預(yù)留的插口。16. 雙目鏡筒或帶照像鏡筒的雙目鏡筒(binocular tubes or binocular phototubes ) 用來(lái)安放目鏡及照像裝置。為便于觀察，鏡筒制成具有一定傾斜角度(30°或45°)，設(shè)有瞳距調(diào)節(jié)裝置，可在55°至75°范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，以適合不同使用者兩眼瞳孔距離。雙目鏡筒內(nèi)裝有一些折光和分光棱鏡，

19、能把從物鏡出來(lái)的一束成像光束等分成兩部分，分別由兩個(gè)目鏡作觀察。帶照像鏡筒的雙目筒一般在右測(cè)裝有光束分配棱鏡的拉桿，把它全部推入時(shí)只作觀察，拉出來(lái)則一邊觀察一邊照像，或全部作顯微照像。17. 目鏡( eyepieces ) 目鏡是顯微鏡中把物鏡所成的像作再一次放大的光學(xué)部件，顯微鏡的總放大倍數(shù)通常就是物鏡與目鏡放大倍數(shù)的乘積。為方便不同視力者進(jìn)行顯微拍照時(shí)調(diào)焦同樣清晰，一些目鏡設(shè)計(jì)成可調(diào)焦式。為了使顯微鏡獲得最大有效放大倍數(shù)和最高分辨本領(lǐng)，必須合理選配目鏡。到目前為止，由于受光學(xué)定律的制約，光學(xué)顯微鏡最大的有效放大倍數(shù)為 1250-1300 倍。10×目鏡是最常用而必須配備的目鏡，觀

20、察熒光時(shí)最好選用10×以下的目鏡。顯微鏡的正確調(diào)試和使用在了解了顯微鏡各主要部件的名稱(chēng)、構(gòu)造和功能之后，為了更好地發(fā)揮顯微鏡的各種功能， 提高工作效率，保證在顯微觀察及顯微照像過(guò)程中取得最佳效果，使用人員必須了解和掌握顯微鏡正確的調(diào)試方法和使用方法。尤其在新一代顯微鏡中，具備了多種功能，能進(jìn)行多種顯微鏡檢方法觀察，正確的試調(diào)方法和使用方法就顯得尤為重要。下面以Axioplan 萬(wàn)能研究顯微鏡為例，簡(jiǎn)述調(diào)試及使用方法。1. 顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整為了使顯微鏡的視野能受到均勻而又充分的照明，在顯微鏡初次安裝和調(diào)試時(shí)，就必須把照明光路系統(tǒng)調(diào)整好，這是正確使用顯微鏡，并獲得正確、可靠結(jié)果的

21、重要手段和最基本的要求。此外， 正確掌握照明光路系統(tǒng)的調(diào)整，是使用顯微鏡過(guò)程中更換光源燈泡后所必經(jīng)的步驟，也是在日常使用過(guò)程中不時(shí)地檢驗(yàn)顯微鏡性能的必要手段。顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整主要有以下4 項(xiàng)內(nèi)容：（1） 照明光源燈室在顯微外的初步調(diào)整首先將燈室的外殼打開(kāi)，壓彈簧夾子將鹵素?zé)襞菅b入插座中，安裝時(shí)避免手指直接接觸燈泡（可用柔軟的布或紙隔?。?，以免燈泡上留有指紋等臟物，影響燈泡的使用壽命。把燈室擺在桌面上，接通電源后，用專(zhuān)用的螺絲刀調(diào)節(jié)燈的調(diào)焦旋鈕孔（標(biāo)有“”） ，使燈絲投影在1-2m 外的墻上，將燈絲成像調(diào)至清晰；然后調(diào)節(jié)燈的高低位置調(diào)節(jié)絲孔（標(biāo)有“”），使燈絲位置高低適當(dāng)；再調(diào)節(jié)燈的左右

22、位置調(diào)節(jié)螺絲孔（標(biāo)有“”），使燈絲左右位置合適。（2） 光源發(fā)光體（燈絲） 在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗(yàn)和校正目的是為了把發(fā)光體的像端端正正地調(diào)入物鏡的視域范圍內(nèi)，從光源的角度去確保顯微鏡的視域受到充分而均勻的照明，這是調(diào)整庫(kù)勒照明系統(tǒng)的前提條件。需要的基本工具：對(duì)中望遠(yuǎn)鏡購(gòu)置顯微鏡時(shí)已配備。 拔掉燈庫(kù)內(nèi)的毛玻璃套筒，把燈室裝回顯微鏡上； 選用10 ×物鏡，開(kāi)亮光源程序找樣品并調(diào)焦清晰，再換用 40 ×物鏡把樣品調(diào)焦清晰（40×物鏡可以看清燈絲的全貌）； 把聚光鏡的孔徑光闌和視場(chǎng)光闌均開(kāi)到最大； 拔掉其中一個(gè)目鏡，換上對(duì)中望遠(yuǎn)鏡，抓住白色部分，另一手伸縮黑色接目鏡，就可在

23、視野中看到燈絲像； 如燈絲位置不合適，調(diào)“”孔，把燈絲像沿水平方向調(diào)好，調(diào)“”孔，把絲像沿垂直方向調(diào)好，直至將燈絲像調(diào)至剛好充滿(mǎn)物鏡孔徑的光圓像； 調(diào)整完畢后，將毛玻璃套筒插回原位，拔掉對(duì)中望遠(yuǎn)鏡，換回目鏡作下一步調(diào)整。以上所述照明光源燈室在顯微鏡外的調(diào)整和光源發(fā)光體在顯微鏡內(nèi)位置的校驗(yàn)，只需在顯微鏡初次安裝調(diào)試及更換燈泡時(shí)進(jìn)行，平時(shí)使用顯微鏡時(shí)不能隨意亂調(diào)亂動(dòng)。萬(wàn)一調(diào)亂時(shí)，可按上述步驟調(diào)回原狀。（3） 庫(kù)勒照明 （ Kohler ） 系統(tǒng)的正確調(diào)整顯微鏡的正確調(diào)試，主要工作之一是照明光路系統(tǒng)的調(diào)整，而其中的關(guān)鍵是庫(kù)勒照明系統(tǒng)的調(diào)整。對(duì)于每一位使用顯微鏡的人員，特別是作顯微照像的人員來(lái)說(shuō)，應(yīng)該

24、對(duì)庫(kù)勒照明系統(tǒng)的原理及其調(diào)整步驟有一定的了解和掌握，才能充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的功能，拍出來(lái)的照片才能在效果上比較一致而又完善。庫(kù)勒照明系統(tǒng)的原理簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是：光源發(fā)光體上任意一點(diǎn)發(fā)出的光，可以照明顯微鏡的視域范圍，而光源發(fā)光體上每一點(diǎn)所發(fā)出的光匯集起來(lái)，在顯微鏡的視域中就實(shí)現(xiàn)了非常充分而又均勻的照明。調(diào)整庫(kù)勒照明系統(tǒng)的目的，是為了使所觀察的視域能獲得均勻而又充分的照明，防止雜散光對(duì)照像系統(tǒng)造成影響或干擾，以免照像時(shí)在底片形成灰霧。高調(diào)整庫(kù)勒照明系統(tǒng)的必要部件：視場(chǎng)光闌、可進(jìn)行合軸調(diào)整的聚光鏡系統(tǒng)。 選用10 ×物鏡和10 ×目鏡； 把聚光鏡前端透鏡擺進(jìn)光路中，孔徑光闌調(diào)至適中

25、的位置上（不大不?。?，再把聚光鏡升到最頂?shù)奈恢蒙?，聚光鏡轉(zhuǎn)盤(pán)調(diào)至明視野“J ”位置； 把視場(chǎng)光闌調(diào)至最?。?0.1）； 載物臺(tái)上放上已封片的生物樣品，開(kāi)亮光源，調(diào)焦清晰； 視域中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)局部照明的區(qū)域或亮斑，這是視場(chǎng)光闌的模糊像，在其中可以清晰地看到樣品的細(xì)節(jié)；在它之外是較暗的視域，不一定能把樣品的細(xì)節(jié)看得清楚； 把聚光鏡微微地向下調(diào)，使視野中的亮斑逐漸收小，慢慢變成一個(gè)清晰的多邊形象，這便是視場(chǎng)光闌的清晰像； 一般情況下，多邊形象并不在視域中央，需要調(diào)整聚光鏡的一對(duì)調(diào)中螺絲，把視場(chǎng)光闌多邊形的像調(diào)至中央位置； 逐漸開(kāi)大視場(chǎng)光闌，使多邊形象成為視域的內(nèi)接多邊形，進(jìn)一步核對(duì)調(diào)中的狀況，如對(duì)中不

26、夠理想，繼續(xù)微微調(diào)對(duì)中螺絲； 將視場(chǎng)光闌稍為再微微開(kāi)大一些，使它的多邊形象恰好消失在視域的邊緣上，至此，庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整完畢。庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整好以后，整個(gè)視域照明均勻，拍攝的顯微照片明亮清晰，反差正常。在日后使用過(guò)程中應(yīng)特別注意：a. 視場(chǎng)光闌不可任意開(kāi)大，但可隨物鏡倍數(shù)的增大而將視場(chǎng)光闌收小，隨物鏡倍數(shù)的減小而開(kāi)大；b. 聚光鏡的高低位置不準(zhǔn)亂調(diào)，否則會(huì)破壞已調(diào)整好的庫(kù)勒照明系統(tǒng)；c. 使用10×以下物鏡時(shí)要將聚光鏡前端透鏡擺出光路外，使用10×或10×以上物鏡時(shí)要將前端透鏡擺入光路中；d. 關(guān)于物鏡倍數(shù)與視場(chǎng)光闌大小配合問(wèn)題，在實(shí)際使用過(guò)程中，作為一般觀察不一

27、定要收小或開(kāi)大視場(chǎng)光闌，但作顯微照相時(shí)，為了避免雜散光線對(duì)照相系統(tǒng)的干擾，以便能拍攝到較完善的照片，則應(yīng)在使用每一個(gè)倍數(shù)的物鏡時(shí)，把視場(chǎng)光闌調(diào)節(jié)到正好消失于所觀察的視域邊上，這是比較繁復(fù)的工作，但又非做不可。較為簡(jiǎn)便的方法是把與各個(gè)倍數(shù)物鏡相對(duì)應(yīng)的視場(chǎng)光闌事先調(diào)整好，并作好記號(hào)，以后使用時(shí)根據(jù)記號(hào)直接調(diào)至相應(yīng)的位置。（4） 孔徑光闌的正確使用由于聚光鏡的孔徑光闌可以影響顯微鏡的分辨率，使用時(shí)應(yīng)掌握正確的使用方法。過(guò)去由于對(duì)孔徑光闌的認(rèn)識(shí)不足，往往把它當(dāng)作是調(diào)節(jié)視野亮度的工具。 雖然調(diào)節(jié)孔徑光闌在一定程度上可以改變視野的亮度，但會(huì)直接影響成像的反差、對(duì)比度及分辨率，在使用過(guò)程中應(yīng)盡可能避免。為了

28、發(fā)揮聚光鏡孔徑光闌的作用，以便在觀察時(shí)，尤其在作顯微照相時(shí)獲得最佳分辨率，在每換用一個(gè)倍數(shù)的物鏡時(shí)，在樣品調(diào)焦清晰后，需要調(diào)節(jié)孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑（物鏡孔徑像）的2/3 。調(diào)整方法是用對(duì)中望遠(yuǎn)鏡對(duì)焦于視野中黑色相差環(huán)上，調(diào)節(jié)孔徑光闌，可以看到一個(gè)多邊形的孔徑光闌像，然后調(diào)到等于物鏡孔徑像的2/3 ，即介于黑色相差環(huán)外與圓形視域內(nèi)之間。為方便起見(jiàn)，可把與各倍數(shù)物鏡相對(duì)應(yīng)的孔徑光闌預(yù)先調(diào)整好，并作好標(biāo)記，以免每次使用都要重新調(diào)整。2. 顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整及顯微鏡檢術(shù)概要顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整，是根據(jù)不同顯微鏡檢術(shù)的需要而進(jìn)行的。所謂顯微鏡檢術(shù)(microscopy

29、)， 概括而言就是以顯微鏡觀察樣品時(shí)所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術(shù)與方法。以下簡(jiǎn)述顯微鏡檢術(shù)中已成熟的幾種方法及對(duì)應(yīng)的顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整方法。(1) 透射光明視野(brightfield ) 這是自顯微鏡發(fā)明以來(lái)最傳統(tǒng)、最普遍的應(yīng)用方法。基本部件：a. 物鏡：任何物鏡都可作明視野觀察；b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可，最好配有孔徑光闌。調(diào)整方法：在上述顯微鏡的庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整好后，即可應(yīng)用明視野法。適用范圍：所有已染色的組織切片、血液涂片等。注意事項(xiàng)：c. 使用明視野方法觀察時(shí)，一定要將庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整好；d. 視場(chǎng)光闌不可任意開(kāi)大，使用10×、10

30、×以下和10×以上物鏡時(shí)，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實(shí)出和擺進(jìn)光路中；e. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來(lái)調(diào)節(jié)視野的亮度，更不要亂調(diào)聚光鏡的高低位置，否則，會(huì)降低顯微鏡的分辨率和破壞已調(diào)整好的庫(kù)勒照明系統(tǒng)；f. 作顯微照相時(shí)，每換用一個(gè)倍數(shù)的物鏡，就要調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑的2/3 。(2) 透射光相差法(phase-contrast) 這是現(xiàn)代顯微鏡檢術(shù)中的一種反差增強(qiáng)法。基本部件：相差物鏡、明視野與相差兼用的多用途聚光鏡、對(duì)中望遠(yuǎn)鏡、綠色濾光片。調(diào)整方法：a. 在庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整好的基礎(chǔ)上，用明視野方法把樣品調(diào)焦清晰；b. 把聚光鏡轉(zhuǎn)到Ph1

31、 對(duì)準(zhǔn)轉(zhuǎn)盤(pán)刻度線位置，選用10×相差物鏡，換上待觀察的透明樣品；c. 拔掉其中一個(gè)目鏡，換上對(duì)中望遠(yuǎn)鏡，并調(diào)焦于視野中的兩個(gè)相差環(huán)上(物鏡的黑色相差環(huán)和聚光鏡的透光相差環(huán))；d. 視野中的兩個(gè)相差環(huán)不一定重合，調(diào)節(jié)聚光鏡上的兩個(gè)調(diào)節(jié)裝置(調(diào)整相差環(huán)左右位置的調(diào)節(jié)桿和調(diào)整前后位置的摩擦式轉(zhuǎn)鈕)，使透光環(huán)作前后左右移動(dòng)而與黑環(huán)重合；e. 調(diào)整好后，換回觀察用目鏡，將綠色濾光片按入光路中，即可觀察到樣品的相差像；f. 有20×和40×物鏡觀察時(shí)，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph2位置上，用100 物鏡時(shí)，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph3位置上。適用范圍：適用于觀察透明、未染色或不能染色的樣品，如各種

32、細(xì)胞、活組織、未染色或不染色的組織切片、水生生物等。(3) 微分干涉相襯法(differential interference-contrast， DIC)為了克服相差法觀察時(shí)樣品細(xì)節(jié)像周?chē)殡S有光暈，會(huì)掩沒(méi)掉本來(lái)應(yīng)該看見(jiàn)的細(xì)節(jié)，以及樣品或組織切片厚度要求相當(dāng)薄，原則上下能厚于10?m等局限性，利用雙光束干涉的原理設(shè)計(jì)子微分干涉相襯法。調(diào)整方法：a. 必須在庫(kù)勒明系統(tǒng)已調(diào)好的基礎(chǔ)上才能調(diào)好DIC 方法；b. 先用10×物鏡，以明視野先確定好能把樣品看清晰的物鏡調(diào)焦位置；c. 把起偏器(polarizer )擺入照明光路中，注意其取向應(yīng)為東西方向；d. 把聚光鏡轉(zhuǎn)盤(pán)轉(zhuǎn)到與10×

33、;物鏡對(duì)應(yīng)使用的位置上，即DIC 0.3 0.4 ；e. 在物鏡后方或物鏡轉(zhuǎn)換器上插入10×物鏡使用的DIC插片( DIC slider )；f. 把檢偏器(analyser )插入成像光路中，注意其取向應(yīng)為南北方；g. 換上待觀察的透明樣品，開(kāi)亮光源把樣品調(diào)焦清晰；h. 調(diào)節(jié) DIC插片，使微分干涉相襯的像達(dá)到最佳效果，也就是浮雕效果最為明顯；i. 同時(shí)可調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使反差的效果也達(dá)到最佳；j. 然后再細(xì)微調(diào)樣品的細(xì)節(jié)，可見(jiàn)樣品中不同層面上的結(jié)構(gòu)；k. 如果把補(bǔ)色器(first order red retardation plate )插入，并同時(shí)調(diào)節(jié)DIC 插片，可在視

34、野中看到不斷變化的絢麗色彩，紅、橙、黃、綠、藍(lán)、紫、粉紅、粉紫及金黃色都具有。適用范圍：透明或不能染色的組織切片，厚度可達(dá)100?m左右，培養(yǎng)中的活組織和活細(xì)胞、小生生物等。(4) 落射光激發(fā)的熒光法(incident-loght fluorescence Epi-FL ) 簡(jiǎn)稱(chēng)為落射熒光法，是近代顯微鏡檢術(shù)中新發(fā)展出來(lái)的一種強(qiáng)有力的反差增強(qiáng)法。它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品，從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡(jiǎn)便，效率高，50W的光源強(qiáng)度比透射熒光法的250W還強(qiáng)。熒光方法是利用波長(zhǎng)較短的紫外光、紫光、藍(lán)紫光、藍(lán)光及綠

35、光等去激發(fā)樣品，只要樣品中含有可產(chǎn)生熒光的成分，它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光。不同物質(zhì)只能吸改特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，而釋放的熒光也會(huì)有特定的波長(zhǎng)，因而用作特異性的鑒定十分有效， 如某些致病的細(xì)菌和螺旋體，受紫外光激發(fā)后能發(fā)出它們特有的熒光，很容易作出鑒定，這種利用物質(zhì)吸收激發(fā)光后放出特有熒光的方法稱(chēng)為自發(fā)熒光法。某些物質(zhì)自身不會(huì)吸收激發(fā)光， 或吸收后不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料，而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發(fā)光，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質(zhì)，這稱(chēng)為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及工業(yè)的特異性研究和鑒別上。調(diào)整方法：

36、熒光顯微鏡或附有熒光部件的顯微鏡，調(diào)整的方法大致相同。 汞燈的安裝a. 打開(kāi)包裝，取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上，安裝時(shí)注意手指不能直接接觸燈管和散熱帽的正面，汞燈的封氣口要對(duì)向散熱帽的左側(cè)或右側(cè)；b. 把汞燈的上電極引張安裝并固定在散熱帽底面的小孔上，再把汞燈的下電極及上電極引線另一端，分別安裝在燈座上各自的插孔中并固定；c. 鎖緊散熱片上的螺絲后，把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中，鎖緊相應(yīng)的螺絲，再把燈座上的連線和插座插到汞燈電源后部專(zhuān)用的插座上。d. 詳細(xì)的安裝方法請(qǐng)參照有關(guān)說(shuō)明書(shū)。 汞燈燈室在顯微鏡外的初步調(diào)整：a. 接通汞燈電源，讓汞燈預(yù)熱10-15min ；b. 把汞燈燈

37、室擺放在桌面上，讓汞弧投影到2-3m 外的墻上，劃一條與燈室窗口中心線對(duì)地高度一樣的水平線作為參考線；c. 轉(zhuǎn)動(dòng)燈室調(diào)焦旋鈕，使汞弧的像清晰地投影于墻上；d. 分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5 個(gè)調(diào)節(jié)螺絲孔，把汞弧的像其反射像調(diào)成并排且盡量靠近，但不要重疊在一起。 汞燈汞弧在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗(yàn)：a. 將汞燈照明光路系統(tǒng)中的視場(chǎng)光闌開(kāi)到最大；b. 把熒光濾光片組推到藍(lán)光激發(fā)的位置上，以避免汞燈中的藍(lán)光太刺眼；c. 把觀察的樣品或一塊載玻片放在物臺(tái)上，蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙；d. 取下一個(gè)物鏡，使激發(fā)的藍(lán)光經(jīng)物鏡轉(zhuǎn)換器的空檔照在白紙上，白紙上會(huì)有一藍(lán)色的圓形照明區(qū)域，汞弧的像及其反射像都應(yīng)該出現(xiàn)在這區(qū)域的中央部位，否則，可調(diào)節(jié)燈室調(diào)焦旋鈕至最清晰，然后分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5 個(gè)調(diào)節(jié)螺絲孔，直至汞弧的像及其反射像并排在照明區(qū)域的中央位置。e. 調(diào)好之后，把物鏡裝回去，通過(guò)目鏡可見(jiàn)白紙被藍(lán)光激發(fā)后發(fā)射出的黃綠色熒光；f. 仔細(xì)調(diào)焦，可看清白紙的纖維；取去白紙，樣品上的熒光細(xì)節(jié)隱約可見(jiàn)而很容易調(diào)焦清晰。 汞燈使用注意事項(xiàng)目前通常使用的為50W超高氣壓汞燈，燈管內(nèi)通有一對(duì)鎢電極和液態(tài)汞(室溫下附在管壁上)，未點(diǎn)燃時(shí)，管內(nèi)氣壓很低，在燈管的兩電極間施加電壓角發(fā)點(diǎn)燃后，汞氣化為汞蒸氣形成汞弧而產(chǎn)生