1、降血糖藥物篩選方法降血糖藥物篩選方法2010年年11月月5日日v導(dǎo)論導(dǎo)論v動物水平篩選動物水平篩選v細(xì)胞水平篩選細(xì)胞水平篩選v酶和受體水平篩選酶和受體水平篩選v總結(jié)和思考總結(jié)和思考糖尿病（糖尿?。―M, Diabetes Mellitus） 糖尿病為一種多病因的代謝疾病，特點糖尿病為一種多病因的代謝疾病，特點是慢性是慢性高血糖高血糖，伴隨因，伴隨因胰島素分泌胰島素分泌及及/或作用或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。指標(biāo)指標(biāo)：t餐后2 h 血糖高于11.1 mmol/ Lt空腹血糖高于7.0 mmol/ L 發(fā)病率發(fā)病率v全球糖尿病患者人數(shù)已超過全球糖尿

2、病患者人數(shù)已超過1.77億億，預(yù)計到，預(yù)計到2025年將年將達(dá)到達(dá)到3.7億，成為繼心血管和腫瘤之后第三位億，成為繼心血管和腫瘤之后第三位“健康健康殺手殺手” （WHO）。）。v中國糖尿病發(fā)病率達(dá)中國糖尿病發(fā)病率達(dá)5%，全國糖尿病患者人數(shù)已在，全國糖尿病患者人數(shù)已在3000萬以上，糖尿病患者的人數(shù)僅次于印度居世界第萬以上，糖尿病患者的人數(shù)僅次于印度居世界第二位。二位。世界糖尿病日世界糖尿病日 紀(jì)念胰島素的發(fā)現(xiàn)者紀(jì)念胰島素的發(fā)現(xiàn)者班廷班廷的誕辰，世界衛(wèi)生組織的誕辰，世界衛(wèi)生組織（WHO）和國際糖尿病聯(lián)盟（）和國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）將班廷醫(yī)生）將班廷醫(yī)生的生日的生日11月月14日日定為世界糖尿病

3、日（定為世界糖尿病日（WDD）。）。班廷，班廷，Banting，加拿大生理學(xué)家加拿大生理學(xué)家（1891-1941） 控制糖尿病，刻不容緩?。↙ets take control of diabetes. Now?。?糖尿病的事實糖尿病的事實v全球全球每每30秒秒就有一人因糖尿病而截肢。就有一人因糖尿病而截肢。 v每年死于糖尿病的人遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于死于艾滋病的人。每年死于糖尿病的人遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于死于艾滋病的人。v2005年，全球約年，全球約290萬萬人死于糖尿病。人死于糖尿病。 v每年患糖尿病的人數(shù)增加每年患糖尿病的人數(shù)增加700萬萬，而且多數(shù)集中在，而且多數(shù)集中在亞洲。亞洲。 v每每10秒秒中，就有人死于糖尿

4、病相關(guān)性疾病；同時，中，就有人死于糖尿病相關(guān)性疾??；同時，就有就有2例例新病例被診斷新病例被診斷 v在發(fā)達(dá)國家，糖尿病是成年人在發(fā)達(dá)國家，糖尿病是成年人失明失明和視力障礙的和視力障礙的主要原因。主要原因。 v2型糖尿病占糖尿病患者的型糖尿病占糖尿病患者的90以上。以上。 v肥胖是肥胖是2型糖尿病的主要危險因素。型糖尿病的主要危險因素。并發(fā)癥并發(fā)癥 糖尿病可導(dǎo)致糖尿病可導(dǎo)致失明失明、心腦血管疾病心腦血管疾病、腎功能衰竭腎功能衰竭、神經(jīng)病變神經(jīng)病變、肢體壞疽肢體壞疽以致截肢、昏迷等多種并發(fā)以致截肢、昏迷等多種并發(fā)癥。癥。治療藥物治療藥物v磺脲類：磺脲類： 格列本脲格列本脲（優(yōu)降糖）（優(yōu)降糖）格列齊

5、特格列齊特（達(dá)美康）（達(dá)美康） 格列吡嗪（美吡達(dá)）格列喹酮（糖適平格列吡嗪（美吡達(dá)）格列喹酮（糖適平 格列美脲（亞莫利）格列美脲（亞莫利）v雙胍類：雙胍類： 苯乙雙胍（降糖靈）二甲雙胍（美迪康）苯乙雙胍（降糖靈）二甲雙胍（美迪康） v糖苷酶抑制劑：糖苷酶抑制劑： 阿卡波糖（拜糖平）伏格列波糖（倍欣）阿卡波糖（拜糖平）伏格列波糖（倍欣） v胰島素增敏劑：胰島素增敏劑：羅格列酮（文迪雅）羅格列酮（文迪雅） v胰島素：胰島素：諾和靈、優(yōu)泌林諾和靈、優(yōu)泌林二、動物水平篩選二、動物水平篩選 2.1 I型糖尿病動物模型型糖尿病動物模型 造模方法：造模方法： 采用化學(xué)試劑破壞胰島細(xì)胞造模或因為遺傳因素，胰島

6、細(xì)胞受到自身免疫性破壞而產(chǎn)生的。 1）化學(xué)試劑誘導(dǎo)的高血糖動物模型）化學(xué)試劑誘導(dǎo)的高血糖動物模型 鏈脲霉素（四氧嘧啶）誘導(dǎo)的高血糖動物模型鏈脲霉素（四氧嘧啶）誘導(dǎo)的高血糖動物模型 鏈脲霉素誘導(dǎo)的高血壓動物模型鏈脲霉素誘導(dǎo)的高血壓動物模型原理：原理： 含亞硝基的化合物t 特異性破壞胰島細(xì)胞t 誘導(dǎo)NO大量合成t 激活自身免疫過程 STZ量決定細(xì)胞損傷程度： 凋亡（低劑量）凋亡（低劑量） 高劑量（壞死）高劑量（壞死）鏈脲霉素結(jié)構(gòu)鏈脲霉素結(jié)構(gòu) v方法：方法：一次性大劑量靜脈或腹腔注射STZ 大鼠（60-80 mg/kg） 小鼠（100-200 mg/kg）v注意：注意： STZ水溶液不穩(wěn)定，生物半衰

7、期5 min，造 模時新鮮配置、快速注射。v結(jié)果：結(jié)果：注射72 小時后，血糖穩(wěn)定升高，動物出現(xiàn) 三多癥狀（多食、多飲、多尿）。 v優(yōu)缺點：優(yōu)缺點：造?？焖佟⒛Ｐ头€(wěn)定、組織毒性小；但 價格昂貴2）自發(fā)性糖尿病大鼠（）自發(fā)性糖尿病大鼠（BB大鼠） 渥太華渥太華Biobreeding實驗室培育出來的自發(fā)遺傳實驗室培育出來的自發(fā)遺傳I 型糖型糖尿病大鼠。尿病大鼠。v發(fā)病機制：發(fā)病機制：自身免疫性破壞胰腺細(xì)胞引發(fā)胰腺炎v發(fā)病特征：發(fā)病特征：于出生后60日發(fā)病，體重減輕，糖尿， 低胰島素，胰腺炎、胰島細(xì)胞減少， 須胰島素治療才能生存。 2.2 II型糖尿病動物模型型糖尿病動物模型II 型糖尿病動物模型的

8、病理生理改變型糖尿病動物模型的病理生理改變t 胰島素抵抗增加t 基礎(chǔ)肝糖輸出率增加，空腹高血糖t 胰島細(xì)胞功能減退 胰島素抵抗的出現(xiàn)，為維持血糖穩(wěn)定，胰島細(xì)胞分泌胰島素代償性增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞分泌功能障礙，發(fā)展為糖尿病。1）高糖高脂飲食誘發(fā)）高糖高脂飲食誘發(fā)II型糖尿病動物模型型糖尿病動物模型v方法：方法： 采用占熱量61%高脂飲食（飽和脂肪酸的動物脂肪，蛋白質(zhì)19%，碳水化合物20%，脂肪61%），飼養(yǎng)3-6周。v指標(biāo)：指標(biāo)： 血糖升高，胰島素水平升高，出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗。v優(yōu)缺點：優(yōu)缺點： 模擬人類高糖高脂膳食誘發(fā)糖尿病模型； 但造模時間較長，成本高，不穩(wěn)定。2）自發(fā)性糖尿病大鼠（）自發(fā)

9、性糖尿病大鼠（PO大鼠） PO大鼠又稱嗜沙肥鼠發(fā)病特征發(fā)病特征： 出生兩周后，90%PO大鼠出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗癥狀。發(fā)病階段：發(fā)病階段：t 起始階段，血清及胰島素水平正常t 胰島素水平升高，血糖正常t 高胰島素水平，高血糖水平t 胰島細(xì)胞受損，導(dǎo)致低胰島素和高血糖3）肥胖高血糖小鼠（）肥胖高血糖小鼠（ob/ob小小鼠）v發(fā)病特征：發(fā)病特征：體型極胖，早期有高血糖和糖尿，血清胰島素水平高，有明顯的胰島素抗性。胰島肥大增生，胰島素含量增加。v用途：用途：胰島素增敏劑的研究4）糖尿病小鼠（）糖尿病小鼠（db/db小小鼠）v發(fā)病特征：發(fā)病特征：體型極胖，脂肪沉淀，早期有高血糖和糖尿，高胰島素血癥，晚

10、期可見胰島細(xì)胞壞死。2.3 降糖藥物體內(nèi)藥效評價方法降糖藥物體內(nèi)藥效評價方法v利用糖尿病動物模型評價藥效，主要以利用糖尿病動物模型評價藥效，主要以空腹血空腹血糖、糖耐量及胰島素敏感性糖、糖耐量及胰島素敏感性為指標(biāo)。為指標(biāo)。va）空腹血糖測定）空腹血糖測定 取材：取材：動物禁食過夜，次日眼眶采血，測 定血糖濃度。 方法：方法：葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法以及 血糖儀。葡萄糖氧化酶法（國內(nèi)推薦方法）葡萄糖氧化酶法（國內(nèi)推薦方法）葡萄糖葡萄糖 + O2葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖酸葡萄糖酸+ H2O2H2O2+ 4-氨基安替吡啉氨基安替吡啉 + 酚酚過氧化物酶過氧化物酶醌亞胺醌亞胺 + H2O 醌亞

11、胺醌亞胺在在480-550 nm有最大吸收峰，醌亞胺與葡萄糖的量成有最大吸收峰，醌亞胺與葡萄糖的量成正比，正比，比色法比色法測定醌亞胺的量，即可得到葡萄糖濃度。測定醌亞胺的量，即可得到葡萄糖濃度。v原理：原理：v方法：方法：葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶過氧化物酶過氧化物酶磷酸緩沖液磷酸緩沖液酚酚4-4-氨基安替吡啉氨基安替吡啉孵育孵育15 min505 nm測定測定吸光度吸光度ODv結(jié)果：結(jié)果：v局限：局限：還原性物質(zhì)如尿酸、維 C 、膽紅素等，可 與色原性物質(zhì)競爭過氧化氫，從而消耗反 應(yīng)過程中所產(chǎn)生的過氧化氫，使測定結(jié)果偏低v 舉例：舉例：葡萄糖濃度葡萄糖濃度 =A樣品樣品-A空白空白A標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)

12、-A空白空白X 標(biāo)準(zhǔn)濃度（標(biāo)準(zhǔn)濃度（mM）樣品樣品OD 葡萄糖濃度（葡萄糖濃度（mM）空白0.050標(biāo)準(zhǔn)品0.955.0樣品A0.5?樣品B0.35? 血糖儀血糖儀v方法：方法： 手指采集1 ul血樣，將試紙頂端輕靠血樣，試紙就可以自動吸收血樣，插入血糖儀，只需5秒快速顯示測試結(jié)果v特點：特點： 方便、快速、簡單，主要用于糖 尿病患者日常監(jiān)控血糖，但準(zhǔn)確 度稍差。b）糖耐量試驗）糖耐量試驗口服糖耐量口服糖耐量試驗：試驗： 糖尿病診斷主要指標(biāo)，也是降糖藥物藥效評價糖尿病診斷主要指標(biāo)，也是降糖藥物藥效評價的主要指標(biāo)。的主要指標(biāo)。原理：原理：t口服葡萄糖后，血糖迅速上升，刺激胰島素分泌，肝糖口服葡萄

13、糖后，血糖迅速上升，刺激胰島素分泌，肝糖元合成增加，血糖持續(xù)下降。元合成增加，血糖持續(xù)下降。t正常人服用葡萄糖正常人服用葡萄糖30-60 min，血糖達(dá)到最高峰，之后迅，血糖達(dá)到最高峰，之后迅速下降，在速下降，在2 h左右，血糖降至正常。左右，血糖降至正常。t糖尿病時，耐糖功能下降，服糖后血糖峰值超過正常，糖尿病時，耐糖功能下降，服糖后血糖峰值超過正常，且且2 h不能下降到正常不能下降到正常 。v方法：方法： 實驗前動物過夜禁食，灌胃給葡萄糖或蔗糖（實驗前動物過夜禁食，灌胃給葡萄糖或蔗糖（2.5g/kg），），或淀粉（或淀粉（3-5g/kg）。測定給糖后）。測定給糖后0 h，0.5 h，1 h

14、，2 h血漿血漿血糖濃度，并繪制血糖變化曲線。血糖濃度，并繪制血糖變化曲線。v結(jié)果：結(jié)果：葡萄糖耐量試驗葡萄糖耐量試驗050100150200250300050100150200口服葡萄糖后時間（min）葡萄糖濃度（mg/dl）sample1sample2sample3哪一個樣本是哪一個樣本是糖尿病鼠？哪糖尿病鼠？哪個是降糖藥治個是降糖藥治療后樣本？療后樣本？c) 胰島素釋放試驗胰島素釋放試驗v目的目的：檢查胰島功能和胰島素分泌水平v原理：原理：I型糖尿病，空腹胰島素水平很低； II型糖尿病，空腹胰島素水平正?；蚱撸?葡萄糖刺激后，胰島素分泌增加； 部分藥物可促進(jìn)胰島素分泌，提高胰島素水平v

15、方法：方法：灌胃給葡萄糖或蔗糖（2.5 g/kg），或淀粉 （3-5 g/kg）.測定給糖后0 h，0.5 h，1 h，2h 血漿胰島素濃度，并繪制胰島素變化曲線。胰島素測定方法（胰島素測定方法（ELISA）：）：原理：原理：預(yù)先包被胰島素抗體在ELISA 板上，加入樣品后，樣品 中的胰島素與包被抗體結(jié)合，再加入生物素標(biāo)記的抗胰 島素單克隆抗體，結(jié)合已俘獲胰島素的另一端，最后加 入過氧化酶標(biāo)記的抗生物素，生物素與抗生物素結(jié)合。 通過過氧化物酶底物顯色來定量測定樣品中的胰島素。v方法：方法：胰島素測定試劑盒（胰島素測定試劑盒（wako）v組成：組成：抗胰島素包被板；胰島素標(biāo)準(zhǔn)溶液；生物素抗胰島素

16、包被板；胰島素標(biāo)準(zhǔn)溶液；生物素標(biāo)記的抗胰島素抗體；標(biāo)記的抗胰島素抗體；HRP 標(biāo)記的鏈酶親和素；顯色標(biāo)記的鏈酶親和素；顯色底物；終止液；洗滌液底物；終止液；洗滌液v 試驗操作試驗操作：參見試劑盒說明：參見試劑盒說明v 結(jié)果：結(jié)果：胰島素標(biāo)準(zhǔn)曲線胰島素標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品樣品 OD胰島素水平胰島素水平10.85 ng/ml20.10.3 ng/ml31.58.5 ng/ml胰島素釋放試驗010203040506070020406080100120140口服葡萄糖后時間（min）胰島素濃度（ng/ml）sample 1sample 3sample 2胰島素釋放試驗051015202530350204060

17、80100120140口服葡萄糖后時間（min）胰島素濃度（ng/ml）sample1sample4圖圖 哪個樣品為正常，哪個樣品為正常，I型或型或 II型病人？型病人？圖圖 哪個為治療前或治療后？哪個為治療前或治療后？圖圖 哪個為治療前或治療后？哪個為治療前或治療后？圖圖胰島素釋放試驗010203040506070020406080100120140口服葡萄糖后時間（min）胰島素濃度（ng/ml）sample 2sample 5圖d) 葡糖鉗技術(shù)葡糖鉗技術(shù)(glucose clamp technique)v葡糖鉗技術(shù)葡糖鉗技術(shù)是美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院于是美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院于1979年創(chuàng)立的一種

18、年創(chuàng)立的一種臨床測定胰島素分泌或胰島素敏感性的定量技術(shù)。臨床測定胰島素分泌或胰島素敏感性的定量技術(shù)。 正糖鉗：正糖鉗：對胰島素的敏感性的定量分析，是國際上公認(rèn)的對胰島素的敏感性的定量分析，是國際上公認(rèn)的評估胰島素敏感性和評估胰島素敏感性和細(xì)胞功能的細(xì)胞功能的“金標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn)” 。v正糖鉗技術(shù)原理：正糖鉗技術(shù)原理： 靜脈注射胰島素使其維持高水平；靜脈注射胰島素使其維持高水平； 同時靜脈注射葡萄糖使同時靜脈注射葡萄糖使血糖維持在基礎(chǔ)血糖水平上。高胰島素水平代謝葡萄糖，血糖維持在基礎(chǔ)血糖水平上。高胰島素水平代謝葡萄糖，為維持血糖需不斷注射葡萄糖，為維持血糖需不斷注射葡萄糖，當(dāng)葡萄糖注射速率平衡時，當(dāng)葡

19、萄糖注射速率平衡時，此時的速率相當(dāng)于體內(nèi)代謝葡萄糖的速率此時的速率相當(dāng)于體內(nèi)代謝葡萄糖的速率。v1983發(fā)展大鼠正糖鉗試驗。發(fā)展大鼠正糖鉗試驗。Dr. Jim Liebau方法：方法：t大鼠麻醉t頸靜脈插管t接三通管，兩個進(jìn)口端一側(cè)輸入10%葡萄糖，一側(cè)輸入胰島素，出口端接靜脈插管t手術(shù)完畢，輸入4 mU/kg/min胰島素，同時輸入10%葡萄糖t 每隔10 min測定血糖t血糖輸入速率至穩(wěn)態(tài)后，記錄連續(xù)60 min葡萄糖輸注速率t 穩(wěn)態(tài)下6次葡萄糖輸注速率平均值為GIR， 6次血糖平均值為BG結(jié)果：結(jié)果：穩(wěn)態(tài)葡萄糖注射速率GIR值 11.56 mg/kg/min 血糖平均值BG 值4.13

20、mM哪個樣品胰島素敏感度高？哪個樣品是來自藥物治療后大鼠？ 02468101214161820GIRGIR（mg/kg/mi（mg/kg/min）n）sample 1sample 1sample 2sample 2胰島素-正糖鉗試驗胰島素-正糖鉗試驗三、細(xì)胞水平降糖藥物篩選三、細(xì)胞水平降糖藥物篩選 脂肪細(xì)胞（肝細(xì)胞）脂肪細(xì)胞（肝細(xì)胞）-葡萄糖消耗葡萄糖消耗 葡萄糖轉(zhuǎn)運試驗葡萄糖轉(zhuǎn)運試驗 1. 3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗實驗脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗實驗脂肪細(xì)脂肪細(xì)胞胞11mM葡萄糖葡萄糖含藥培養(yǎng)液含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)培養(yǎng)24或或48 h檢測培養(yǎng)液中檢測培養(yǎng)液中葡萄糖消耗量葡萄糖消耗量葡萄糖氧葡萄糖氧化酶

21、法化酶法計算葡萄糖計算葡萄糖消耗量消耗量陽性藥物可選擇二甲雙胍陽性藥物可選擇二甲雙胍糖消耗量糖消耗量(mM)=11mM-培養(yǎng)基葡萄糖濃度培養(yǎng)基葡萄糖濃度(mM)2. 3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運實驗脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運實驗脂肪細(xì)脂肪細(xì)胞胞加藥加藥培養(yǎng)培養(yǎng)24h0.5 uCi/ml2-deoxy-H -D-glucose3孵育孵育10min 加加NaOH裂解細(xì)胞裂解細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞裂解液裂解液KRP緩沖液緩沖液清洗清洗3次次H 含量含量同位素同位素測定儀測定儀KRP緩沖液組成：緩沖液組成：131.2 mM NaCl，4.7 mMKCl，2.47 mM CaCl2， 1.24 mM MgSO4, 2.

22、48 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES3 b b-細(xì)胞損傷模型細(xì)胞損傷模型nH2O2n鏈脲霉素n四氧嘧啶 b b-細(xì)胞胰島素分泌模型細(xì)胞胰島素分泌模型n b b-細(xì)胞ATP敏感鉀通道阻斷劑 四、分子水平降糖藥物篩選四、分子水平降糖藥物篩選4.1 a a-糖苷酶抑制劑篩選糖苷酶抑制劑篩選原理：原理：t 飲食中淀粉和蔗糖飲食中淀粉和蔗糖(雙糖雙糖)不能直接被腸壁細(xì)胞吸收，需要不能直接被腸壁細(xì)胞吸收，需要在小腸絨毛上的多種在小腸絨毛上的多種-葡糖苷酶的作用下生成單糖葡糖苷酶的作用下生成單糖(葡萄糖及葡萄糖及果糖果糖)后才能被吸收。后才能被吸收。t -糖苷酶上具有與糖苷酶上具有與寡糖及雙糖相結(jié)合的位點寡糖及雙糖相結(jié)合的位點，藥物與這個位，藥物與這個位點結(jié)合，能點結(jié)合，能可逆性地抑制可逆性地抑制小腸絨毛上的多種小腸絨毛上的多種-葡糖苷酶的活葡糖苷酶的活性。性。v-糖苷酶有多種，包括：糖苷酶有多種，包括：蔗糖酶；葡萄糖淀粉酶；麥芽糖酶；糊精酶。阿卡波糖阿卡波糖阿卡波糖與阿卡波糖與-蔗糖酶結(jié)合位點蔗糖酶結(jié)合位點方法：方法：p-NPG(底物底物)磷酸緩沖液磷酸緩沖液0.2U/ml a-糖