1、華中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科分子診斷室王軍;核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研討的主要對(duì)象，因此核酸提取也成為了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的最重要、最根本的操作。核酸提取亦是臨床分子診斷最關(guān)鍵的操作，直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗與否，是臨床分子診斷容易發(fā)生問(wèn)題步驟。 ;DNA：細(xì)胞核DNP 線粒體 環(huán)狀DNARNA：細(xì)胞質(zhì)中，mRNA，rRNA，tRNA 通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，構(gòu)成RNP;DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，普通都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、

2、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。DNP在低濃度鹽溶液中，幾乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化鈉溶解度最低，僅為在水中溶解度的1%，隨著鹽濃度的添加溶解度也添加，至1mol/L氯化鈉中的溶解度很大，比純水高2倍。RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在0.14mol/L氯化鈉中溶解度較大。;核酸的分別主要是指將核酸與蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子物質(zhì)分開(kāi)。核酸提取時(shí)應(yīng)遵照以下原那么: 1、保證核酸分子一級(jí)構(gòu)造的完好性; 2、排除其他分子污染。 ;大多數(shù)核酸分別與純化的方法普通都包括： 細(xì)胞裂解、酶處置、核酸與其他生物大分子物質(zhì)分別、核酸純化 每一步驟又可由多種不同的方法單獨(dú)

3、或結(jié)合實(shí)現(xiàn)。 ;細(xì)胞裂解可經(jīng)過(guò)以下幾種方法實(shí)現(xiàn)： 物理作用 化學(xué)作用 酶作用 生物作用;物理作用：包括低滲裂解、超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等方法。這些方法用機(jī)械力使細(xì)胞破碎,但機(jī)械力也可引起核酸鏈的斷裂,因此不適用于高分子量長(zhǎng)鏈核酸的分別。 超聲裂解法提取的核酸片段長(zhǎng)度從 20kb 之間,而顆粒勻漿法提取的核酸普通 10kb。 ;化學(xué)作用：變性： 加熱、參與外表活性劑(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或強(qiáng)離子劑(異硫氰酸胍、鹽酸胍、肌酸胍) 堿性PH環(huán)境：強(qiáng)堿(NaOH) 或堿性緩沖液

4、 ( TE、STE 等) 在一定的p H 環(huán)境下,外表活性劑或強(qiáng)離子劑可使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀,核酸釋放到水相；某些緩沖液中的一些金屬離子螯合劑( EDTA 等) 可螯合對(duì)核酸酶活性所必需的金屬離子Mg2+ 、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,維護(hù)核酸不被降解。 ;酶作用生物作用：主要是經(jīng)過(guò)參與溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶) 以使細(xì)胞破裂,核酸釋放。 蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì),促進(jìn)核酸的分別。其中溶菌酶能催化細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的-(1 ,4) 鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵,其在65 及有EDTA、尿素(14mol/

5、 L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時(shí)仍保管酶活性,這有利于提高對(duì)高分子量核酸的提取效率。 ;在核酸提取過(guò)程中,可經(jīng)過(guò)參與適當(dāng)?shù)拿甘共恍枨蟮奈镔|(zhì)降解,以利于核酸的分別與純化。 如在裂解液中參與蛋白酶(蛋白酶K 或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質(zhì),滅活核酸酶(DNase 和RNase)； 或者參與DNase 或RNase 去除不需求的DNA或RNA。 ;酚氯仿法酚氯仿法簡(jiǎn)介：簡(jiǎn)介：19761976，StaffordStafford及其同事創(chuàng)建?，F(xiàn)曾經(jīng)不斷及其同事創(chuàng)建?，F(xiàn)曾經(jīng)不斷改良。改良。 關(guān)鍵技術(shù)：關(guān)鍵技術(shù)：酚的運(yùn)用酚的運(yùn)用 用酚來(lái)分別核酸首先是用酚來(lái)分

6、別核酸首先是KirtyKirty，19561956年初次報(bào)道。年初次報(bào)道。當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)酚可以從水相中抽提蛋白質(zhì)，運(yùn)用陰離子當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)酚可以從水相中抽提蛋白質(zhì)，運(yùn)用陰離子鹽時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)核酸分配在水相，而蛋白質(zhì)在有機(jī)鹽時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)核酸分配在水相，而蛋白質(zhì)在有機(jī)相。相。;酚氯仿法酚氯仿法;酚氯仿法酚氯仿法酚的預(yù)備酚的預(yù)備重蒸酚重蒸酚( (去除可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)去除可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致致RNARNA和和DNADNA的交聯(lián)的醌類(lèi)氧化物；的交聯(lián)的醌類(lèi)氧化物；參與參與8 8一羥基喹嚀，以防止酚氧化，酚氧一羥基喹嚀，以防止酚氧化，酚氧化發(fā)黃，而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二化發(fā)黃，而氧化的酚可引起核酸

7、鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián)；酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián)；水飽和酚、平衡水飽和酚、平衡PHPH大于大于7.87.8不飽和的不飽和的酚能與酚能與15%15%其提及的水互溶，從而降低水相其提及的水互溶，從而降低水相中核酸產(chǎn)量中核酸產(chǎn)量開(kāi)展和改良：開(kāi)展和改良：SDSSDS取代陰離子鹽取代陰離子鹽酚：氯仿混合液添加了對(duì)糖、脂的溶解酚：氯仿混合液添加了對(duì)糖、脂的溶解異戊醇的運(yùn)用減少泡沫、使異戊醇的運(yùn)用減少泡沫、使RNaseRNase失活失活;酚氯仿法酚氯仿法裂解緩沖液異硫氰酸胍處置裂解緩沖液異硫氰酸胍處置蛋白酶蛋白酶K K消化，根據(jù)需求亦可參與消化，根據(jù)需求亦可參與DnaseDnase或或RNAaseR

8、NAase50:48:250:48:2苯酚苯酚: :氯仿氯仿: :異戊醇混合液，與等量的裂解處置液混異戊醇混合液，與等量的裂解處置液混合，根據(jù)運(yùn)用目的合，根據(jù)運(yùn)用目的, ,兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻( (適用于分別小適用于分別小分子量核酸分子量核酸) ) 或簡(jiǎn)單顛倒混勻或簡(jiǎn)單顛倒混勻( (適用于分別高分子量核適用于分別高分子量核酸酸) ) 后離心分別。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機(jī)相后離心分別。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機(jī)相, ,核核酸那么被留于上層水相。酸那么被留于上層水相。轉(zhuǎn)移水相，反復(fù)步驟轉(zhuǎn)移水相，反復(fù)步驟3 3，直至稱(chēng)心為止。，直至稱(chēng)心為止。核酸沉淀，在含核酸的水相中參與核酸沉淀，

9、在含核酸的水相中參與p H5. 0p H5. 05. 5 ,5. 5 ,終濃度終濃度為為0. 3M 0. 3M 的的NaAc NaAc 或或KAc KAc 后后, ,鈉離子會(huì)中和核酸磷酸骨架鈉離子會(huì)中和核酸磷酸骨架上的負(fù)電荷上的負(fù)電荷, ,在酸性環(huán)境中促進(jìn)核酸的疏水復(fù)性。然后在酸性環(huán)境中促進(jìn)核酸的疏水復(fù)性。然后參與參與2 23 3倍體積的預(yù)冷的無(wú)水乙醇倍體積的預(yù)冷的無(wú)水乙醇, ,經(jīng)一定時(shí)間的孵育經(jīng)一定時(shí)間的孵育, ,可使核酸有效地沉淀。可使核酸有效地沉淀。14000g14000g離心離心3030分鐘室溫，或者假設(shè)產(chǎn)量較大可直接用玻璃鉤分鐘室溫，或者假設(shè)產(chǎn)量較大可直接用玻璃鉤子取出。子取出。70

10、%70%乙醇洗滌乙醇洗滌2-32-3次，即可將沉淀溶于次，即可將沉淀溶于TETE保管。保管。;酚氯仿法酚氯仿法純度高，純度高，RNARNA回收效率極高，尤其是回收效率極高，尤其是200bp1.8,RNA2.0) 回收實(shí)驗(yàn)：經(jīng)過(guò)real-timePCR檢測(cè)知核酸量的樣本，察看檢測(cè)值。 A260：是核酸最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)； A280：是蛋白和酚類(lèi)物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長(zhǎng) 。 A260/A280比值假設(shè)小于上述范圍，意味著有蛋白質(zhì)和酚物質(zhì)的污染。 chelex和其它一些鹽類(lèi)會(huì)影響吸光度值的測(cè)定; 影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的常見(jiàn)要素： 核酸的質(zhì)量； 其它常見(jiàn)要素： 1、抗凝劑：肝素，EDTA等； 煮沸法，凝膠過(guò)

11、濾，乙醇沉淀均不能有效去除肝素 2、溶血樣本：血紅蛋白； a、釋放Fe離子？b、亞鐵血紅素可抑制Taq酶？ 3、提取過(guò)程中摻入的物質(zhì)：乙醇(1%,抑制PCR；并干擾測(cè)序) 4、IgG；可與單鏈DNA作用阻止其與聚合酶結(jié)合；煮沸法提取的核酸不能完全防止。 5、層析柱和磁珠法能有效防止以上影響要素； 蛋白酶消化也能去除蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響 ;小結(jié)核酸提取常見(jiàn)化學(xué)試劑名稱(chēng)作用chelex100chelex100 chelex chelex 螯合金屬離子螯合金屬離子；有效除去非核酸有機(jī)物除去非核酸有機(jī)物；防止防止DNA在煮沸時(shí)降解降解；并在高溫低離子強(qiáng)度下起著催化催化DNADNA釋放釋放的作用

12、。酚氯仿混合液酚氯仿混合液 酚酚：有效變性蛋白質(zhì)；抑制了DNase的降解作用。氯仿：氯仿：增加對(duì)糖脂的溶解。SDSSDS 溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，通過(guò)溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜破壞細(xì)胞膜；解聚細(xì)胞中的核解聚細(xì)胞中的核蛋白蛋白；SDS能與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀蛋白質(zhì)變性而沉淀。異丙醇沉淀沉淀RNARNA。異戊醇降低分子表面張力降低分子表面張力，所以能減少減少抽提過(guò)程中的泡沫泡沫產(chǎn)生；并能促進(jìn)分相促進(jìn)分相。DEPCDEPC水水 DEPC(diethypyrocarbonate DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯，焦碳酸二乙酯) )處理過(guò)并經(jīng)高溫高壓消毒的處理過(guò)并經(jīng)高溫高壓消毒的MiliQMiliQ純水純水；RNaseRNase強(qiáng)烈抑制劑強(qiáng)烈抑制劑；溶解保存溶解保存RNARNA。無(wú)水乙醇沉淀沉淀DNADNA NaACNa+中和DNA分子上的負(fù)電荷，促進(jìn)促進(jìn)DNADNA沉淀沉淀 ；促使SDS蛋白復(fù)合物溶解度降低。-巰基乙醇抑制RNase的活性；防止酚還原。異硫氰酸胍和-巰基乙醇一起抑制RNase的活性；和SDS一起促使蛋白質(zhì)變性，分離核酸TE