1、中國藥科大學(xué)藥物代謝動力學(xué)實驗考查知 識點(diǎn)整理藥物代謝動力學(xué)實驗考查知識點(diǎn)整理第一部分：HPLC使用注意事項1、HPLC組成：泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)系統(tǒng)/積分儀2、反相色譜：分離機(jī)理：“反相色譜”固定相極性小于流動相極性常用流動相：乙睛、甲醇，水 3、色譜柱的分類：按填料：球形、無定形 按含碳量：C18、C8按應(yīng)用：分析柱、制備柱、預(yù)處理柱 按粒徑：150mm*,5以m等按填料類型：正相柱、反相柱、手性柱 4、鍵合相色譜柱的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定不易流失；應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑；消除硅羥基的不良影響；缺點(diǎn)：pH得在38范圍內(nèi)5、C18柱的活化：90% 10% 90%勺甲醇溶液1ml/m

2、in依次沖洗30min 6、流動相：使用之前需超聲脫氣目的：色譜泵輸液準(zhǔn)確提高檢測性能保護(hù)色譜柱流動相脫氣的方法：加熱，抽真空，超聲，通惰性氣體流動相組成：流動相配置：緩沖溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，不要儲存時間過長，避免pH值發(fā)生變化和成分分解，影響色譜分離的效果；有機(jī)溶液和緩沖液使用前均需經(jīng)以m微孔濾膜過濾；流動相使用前脫氣。7、常用定量方法：外標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)物的要求：化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測品相似；樣品中不存在；不與樣品組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；保留值與待測值接近；濃度相當(dāng)；與其他色譜峰分離好8、樣品的預(yù)處理：目的：除雜質(zhì)；濃縮微量成分；改善分離；保護(hù)色譜柱； 提高檢測靈敏度方法：高速離心，過濾，選擇性沉淀，衍生反應(yīng)；

3、液固萃取、液液萃取沉淀蛋白的溶劑：有機(jī)溶劑：乙睛、甲醇 強(qiáng)酸：三氯乙酸、過氯酸鹽：50麻酸鏤、10%TCA分析測定用試劑為色譜純及以上， 水為超純水第二部分：實驗設(shè)計1、考慮問題：動物種屬、給藥劑量、取血時間、采樣量、血藥濃度大概范圍2、分析方法建立：色譜柱、流動相組成、柱溫箱溫度、 樣品處理方法、風(fēng)量下限與標(biāo)曲范圍第三部分：實驗相關(guān)條件與數(shù)據(jù)處理實驗一：1、采血點(diǎn)設(shè)計一般原則為獲得給藥后的一個完整的血藥濃度-時間曲線，采樣時間點(diǎn)的設(shè)計應(yīng)兼顧藥物的吸收相、平衡相和消除相。一般在吸 收相至少需要23個采樣點(diǎn)，對于吸收快的血管外給藥的藥 物，應(yīng)盡量避免第一個點(diǎn)是峰濃度；在Cmax附近至少需要3 個

4、采樣點(diǎn)；消除相需要 46個采樣點(diǎn)。整個采樣時間至少應(yīng) 持續(xù)到35個半衰期，或持續(xù)到血藥濃度為Cmax的 1/101/20 o為保證最佳采樣點(diǎn)，建議在正式試驗前，選擇 23只動物進(jìn)行預(yù)試驗，然后根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果，審核并修正原設(shè)計的 采樣點(diǎn)。2、動物給藥方式：股靜脈注射 3、麻醉：腹腔注射20% 烏拉坦4、采血方式：眼眶靜脈叢采血5、蛋白沉淀方式：10喻氯酸，渦旋，15000rpm 10min, 取100ul上清二次離心6、非那西丁色譜條件流動相：50mM磷酸鹽緩沖液中，并稀釋到 1L）:乙睛色譜柱：島津 Shimadzu VP-ODS; 150 X; 5 以 m 檢測波長：254nm 柱溫：40

5、 c進(jìn)樣體積：20以L6、參數(shù)計算曲線線性判斷為一房室模型，參數(shù)計算如下：參數(shù) C0 T1/2 k Vd CL MRT AUC 公式 y = 令 x=0 得 y= 令 丫=得 T1/2=/k 得 Vd=X（給藥量）/C0 X=*2mg/ml=CL=k*Vd MRT=1/k AUC=X/CL 值 以 l/ml 480 以參數(shù) k AUC非房室 值 以-k/=- AUC0100min= AUC100s =Cl00min/k= AUC0100min+ AUC100=+AUMC0100min=9030AUMC100=t100minC100min/k+C100min/k2= AUMC=AUMC0100m

6、in+AUMC100s MRT=AUMC/AUC MRT=1/k C0=Div/VSS=/Div/AUC=/ 以 AUMC MRT C0 T1/2 CL Vss 12171 以 g*min2/ml/40min “/ml 無 VSS=/AUC2=*/實驗二：1、肝微粒體的制備方法 版本一：獲取肝臟：大鼠禁食不禁水 24小時后取肝臟，組織勻 漿：稱重剪成碎塊后加入勻漿液制成勻漿。差速離心：勻漿液4c 9000g離心15min,棄去沉淀和脂 肪層取上清液于100000g離心管中離心20min,棄上清，沉淀用 pbs 輕輕沖洗。重懸沉淀：用10ml勻漿液重懸，凍存管分裝后置 -80 C 冰箱內(nèi)保存 蛋

7、白定量：BCA法 版本二：大鼠拉頸椎處死，開腹取肝臟，用濾紙吸干水分，稱 質(zhì)量。立即放入冰冷的蔗糖溶液中清洗，用剪刀剪成碎塊，反復(fù) 清洗至無血色。加 4倍肝質(zhì)量的蔗糖溶液，在冰浴中用組 織勻漿機(jī)制成勻漿，再超聲分散30 s, 4 C 下10 000 r/min -離心20 min。上清液用四層紗布過濾除漂浮脂物，濾液在4C下50 000 r/min 離心60 min, 棄上清液，沉淀用焦磷 酸鉀緩沖液懸浮均勻，在4 C 下50 000 r/min 離心60 min,沉淀即為肝微粒體。用 Tris HCl緩沖液懸浮均勻，體 積為原上清液的1/ 4即可，分裝于塑料管中，于-80 C保 存，采用Lo

8、wry法測定肝微粒體蛋白濃度版本三：2、NADPF#系：葡萄糖-6- 磷酸(G- 6- P)葡萄糖 6 磷酸脫氫酶(G- 6- P- OH) B -NADP+ 氯化鎂5Mm3、溫孵實驗步驟：肝微粒體，非那西丁溶液，37 C水溶預(yù)溫孵5min,加入NADPH#系溶液，37c水浴溫孵，30min,加入冰 甲醇，終止溫孵，渦旋1min,高速離心10min,轉(zhuǎn)移上清液 2006 4、數(shù) 據(jù)處理雙倒數(shù)法1/V的截距為1/Vmax, 1/S的截距為-1/ Km藥物代謝動力學(xué)實驗考查知識點(diǎn)整理第一部分：HPLC使用注意事項1、HPLC組成：泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)系統(tǒng)/積分儀2、反相色譜：分離機(jī)理：

9、“反相色譜”固定相極性小于流動相極性常用流動相：乙睛、甲醇，水 3、色譜柱的分類：按填料：球形、無定形 按含碳量：C18、C8按應(yīng)用：分析柱、制備柱、預(yù)處理柱 按粒徑：150mm*,5以m等按填料類型：正相柱、反相柱、手性柱 4、鍵合相色 譜柱的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定不易流失；應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑；消除硅羥基的不良影響；缺點(diǎn)：pH得在38范圍內(nèi)5、C18柱的活化：90% 10% 90%勺甲醇溶液1ml/min依次沖洗30min 6、流動相：使用之前需超聲脫氣目的：色譜泵輸液準(zhǔn)確提高檢測性能保護(hù)色譜柱流動相脫氣的方法：加熱，抽真空，超聲，通惰性氣體流動相組成：流動相配置：緩沖溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，不要儲

10、存時間過長，避免 pH值發(fā) 生變化和成分分解，影響色譜分離的效果；有機(jī)溶液和緩沖液使用前均需經(jīng)以m微孔濾膜過濾；流動相使用前脫氣。7、常用定量方法：外標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)物的要求：化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測品相似；樣品中不存在；不與樣品組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；保留值與待測值接近；濃度相當(dāng)；與其他色譜峰分離好8、樣品的預(yù)處理：目的：除雜質(zhì)；濃縮微量成分；改善分離；保護(hù)色譜柱； 提高檢測靈敏度方法：高速離心，過濾，選擇性沉淀，衍生反應(yīng)；液固 萃取、液液萃取沉淀蛋白的溶劑：有機(jī)溶劑：乙睛、甲醇 強(qiáng)酸：三氯乙酸、過氯酸 鹽：50麻酸鏤、10%TCA分析測定用試劑為色譜純及以上， 水為超純水第二部分：實驗設(shè)計1、考慮問題：動物

11、種屬、給藥劑量、取血時間、采樣 量、血藥濃度大概范圍2、分析方法建立：色譜柱、流動相組成、柱溫箱溫度、 樣品處理方法、風(fēng)量下限與標(biāo)曲范圍第三部分：實驗相關(guān)條件與數(shù)據(jù)處理實驗一：1、采血點(diǎn)設(shè)計一般原則為獲得給藥后的一個完整的血藥濃度-時間曲線，采樣時間點(diǎn)的設(shè)計應(yīng)兼顧藥物的吸收相、平衡相和消除相。一般在吸 收相至少需要23個采樣點(diǎn)，對于吸收快的血管外給藥的藥 物，應(yīng)盡量避免第一個點(diǎn)是峰濃度；在Cmax附近至少需要3 個采樣點(diǎn)；消除相需要 46個采樣點(diǎn)。整個采樣時間至少應(yīng) 持續(xù)到35個半衰期，或持續(xù)到血藥濃度為Cmax的 1/101/20 o為保證最佳采樣點(diǎn)，建議在正式試驗前，選擇 23只動物進(jìn)行預(yù)

12、試驗，然后根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果，審核并修正原設(shè)計的采樣點(diǎn)。2、動物給藥方式：股靜脈注射 3、麻醉：腹腔注射20% 烏拉坦4、采血方式：眼眶靜脈叢采血5、蛋白沉淀方式：10%U氯酸，渦旋，15000rpm 10min, 取100ul上清二次離心6、非那西丁色譜條件流動相：50mM磷酸鹽緩沖液中，并稀釋到1L）:乙睛色譜柱：島津 Shimadzu VP-ODS; 150 X; 5 以 m 檢測波長：254nm 柱溫：40 C進(jìn)樣體積：20以L6、參數(shù)計算曲線線性判斷為一房室模型，參數(shù)計算如下：參數(shù) C0 T1/2 k Vd CL MRT AUC 公式 y = 令 x=0 得 y= 令 丫=得 T1/2

13、=/k 得 Vd=X（給藥量）/C0 X=*2mg/ml=CL=k*Vd MRT=1/k AUC=X/CL 值 以 l/ml 480 以參數(shù) k AUC非房室 值 以-k/=- AUC0100min= AUC100s =Cl00min/k= AUC0100min+ AUC100=+ AUMC0100min=9030AUMC100=t100minC100min/k+C100min/k2= AUMC=AUMC0100min+AUMC100sMRT=AUMC/AUC MRT=1/k C0=Div/VSS=/Div/AUC=/ 以 AUMC MRT C0 T1/2 CL Vss 12171 以 g*min2/ml/40min “/ml 無 VSS=/AUC2=*/實驗二：1、肝