1、張旭.薄層色譜自顯影跟蹤分離天然乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究D.蘭州：蘭州理工大學(xué)，2010：1-62一、引言二、AD的發(fā)病機(jī)制及其治療藥物三、乙酰膽堿酯酶和阿爾茨海默癥四、改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)勢 人口老齡化是社會發(fā)展的趨勢與潮流。面對人口老齡化的世界性難題,老年性疾病的防治是刻不容緩的,這不僅是一個醫(yī)學(xué)問題也是一個社會問題。癡呆癥是腦部疾病引起的癥狀,表現(xiàn)為記憶力、學(xué)習(xí)能力、方向感、語言表達(dá)能力、理解能力和判斷力等智力的整體逐漸衰退,它主要困擾著老年人,是造成晚年殘疾的主要原因之一。阿爾茨海默病(AD)是造成老年癡呆的最主要原因,是一種進(jìn)行性和致命性疾病。 AD是以-淀粉樣蛋白沉積的老年斑、異常磷

2、酸化Tau蛋白構(gòu)成的神經(jīng)纖維纏結(jié)和突觸變性、皮質(zhì)及皮質(zhì)下神經(jīng)元變性為特征的腦退行性疾病,其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜,包括遺傳因素、慢性感染、免疫缺陷和環(huán)境毒素等多種原因。關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的假說有很多,如膽堿能學(xué)說、A（-淀粉樣蛋白）學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、Tau蛋白學(xué)說、神經(jīng)血管學(xué)說、基因?qū)W說等。這其中始于20世紀(jì)70年代的膽堿能學(xué)說是AD發(fā)病機(jī)制的最重要假說之一,也是目前絕大多數(shù)臨床藥物的理論依據(jù)。另外,20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的A學(xué)說也越來越得到各國學(xué)者的認(rèn)可和推崇。AChE的生物功能： 分為催化功能和非催化功能。催化功能是指AChE的經(jīng)典功能,即在膽堿能突觸處快速水解神經(jīng)遞質(zhì)ACh,從而終止膽堿能神經(jīng)信

3、號的傳遞。非催化功能是指其具有誘導(dǎo)軸突生長和突觸形成,參與細(xì)胞遷移、粘附和凋亡,促進(jìn)造血細(xì)胞形成和A聚集以及影響炎癥和免疫反應(yīng)等非經(jīng)典功能。AChE是中樞膽堿能代謝的重要物質(zhì),其活性直接影響腦內(nèi)興奮性遞質(zhì)ACh的含量。它在膽堿能突觸間快速水解神經(jīng)遞質(zhì)ACh會加重患者的癥狀,因此抑制其活性可以間接改善癥狀。另一方面,促進(jìn)A聚集的功能和AD密切相關(guān)。誘導(dǎo)細(xì)胞過度表達(dá)會AChE伴隨A表達(dá)升高,而且誘導(dǎo)A沉積并與之結(jié)合形成一種穩(wěn)定的復(fù)合物,比單純的A更具神經(jīng)毒性,會造成周圍神經(jīng)元死亡。上述結(jié)果表明,AChE不僅和AD的膽堿能系統(tǒng)有關(guān),也參與了AD患者老年斑的形成發(fā)展以及神經(jīng)元的死亡過程,而膽堿能活性下

4、降與AD的老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)密切相關(guān),二者形成惡性循環(huán),加劇了AD的惡化。目前,增強(qiáng)膽堿能活性仍然是緩解AD癥狀最有效的方法,因此,尋找活性好、毒性低的AChE仍是開發(fā)治療AD新藥的有效途徑。目前用于治療AD的AchE類藥物除石杉堿甲外都是合成藥物，如他克林，多奈哌齊等，它們的存在活性不是很強(qiáng)，選擇性較低的缺點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)的抗AChE活性較好的化合物多半是生物堿。此外，皂苷、萜類等也有不錯的AChE抑制活性。一、傳統(tǒng)的薄層色譜生物自顯影方法二、改進(jìn)的薄層色譜生物自顯影方法Rhee等采用TCL生物自顯影技術(shù)對15種石蒜科植物提取物進(jìn)行了AChE抑制活性測定,發(fā)現(xiàn)這種方法同Ellman方法相比檢測

5、限更低且避免了難溶樣品給測定帶來的不便。Marton等利用AChE水解乙酸-萘酯的產(chǎn)物可以和快藍(lán)鹽B發(fā)生顯色反應(yīng)的原理,以TCL生物自顯影方法跟蹤分離,顯色后其背景為紫色,抑制劑斑點(diǎn)顯白色。然而,以上TCL生物自顯影方法存在三個不足:第一、酶、底物和顯色劑的用量較大,導(dǎo)致費(fèi)用較高,難以大 規(guī)模應(yīng)用,特別是對于研究經(jīng)費(fèi)不足的科研機(jī)構(gòu)第二、檢測限過高,導(dǎo)致靈敏度較低第三、顯色背景和抑制劑斑點(diǎn)反差不明顯,不易觀察。酶用量的改進(jìn)：當(dāng)將顯色劑快藍(lán)鹽B的濃度降到0.5mg/mL時,可在酶溶液濃度為1.0U/mL的條件下出現(xiàn)穩(wěn)定的紫色背景,但顏色很淺。由于產(chǎn)生的背景很淺，不利于觀察抑制斑點(diǎn)，因此對部分實(shí)驗(yàn)操

6、作進(jìn)行了改進(jìn)：待測樣品在薄層板上展開后,先噴酶液再噴乙酸-萘酯,并讓它們充分反應(yīng)一段時間,最后再噴快藍(lán)鹽B。這樣做可以保證在實(shí)驗(yàn)過程中生成更多的-萘酚,從而可以比原方法使用更少的酶液。實(shí)驗(yàn)中噴灑酶液后,并非用熱風(fēng)將板子完全吹干,而是改用冷風(fēng)吹薄層板到?jīng)]有液體流動為止,并不將板子完全吹干,這樣做更有利于保持酶的活性。顯色背景的優(yōu)化底物溶液中所含乙醇比例對顯色背景的影響：乙醇濃度不宜過高,30%-40%為宜。底物溶液濃度對顯色背景的影響：1.5mg/mL的底物濃度較為合適假陽性結(jié)果的排除將改進(jìn)的TCL生物自顯影方法中的乙酸-萘酯溶液換成-萘酚溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn),排除由于天然產(chǎn)物阻止-萘酚和快藍(lán)鹽B反應(yīng)產(chǎn)

7、生的假陽性結(jié)果,提高方法的準(zhǔn)確率1、將所用酶溶液的濃度從6.67U/mL降低到1.0U/mL,同時降低了底物和顯 色劑的用量,從而大大降低了實(shí)驗(yàn)所需費(fèi)用。2、將原方法的檢測限至少降低了兩個數(shù)量級,這對發(fā)現(xiàn)植物中微量的AChE 非常有利。3、優(yōu)化了顯色背景,從而使抑制劑斑點(diǎn)更容易被觀察到。4、將改進(jìn)的生物自顯影方法中的乙酸-萘酯溶液換成-萘酚溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 排除由于TCL天然產(chǎn)物阻止-萘酚和快藍(lán)鹽B反應(yīng)產(chǎn)生的假陽性結(jié)果, 提高 方法的準(zhǔn)確率。 通過一系列的改進(jìn),此薄層色譜生物自顯影方法已經(jīng)成為一種高通量、低花費(fèi)、便于大范圍推廣的跟蹤分離天然的方法。一、實(shí)驗(yàn)材料二、儀器與試劑三、實(shí)驗(yàn)步驟一、實(shí)驗(yàn)材

8、料： 天南星科植物石菖蒲的干燥根莖二、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑： 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 薄層板 乙醇 三、實(shí)驗(yàn)步驟：醇提物制備 稱取石菖蒲粉末50g,加入500mL乙醇熱回流提取1h,將提取液倒出,加500mL乙醇再次回流提取,兩次的提取液合并濃縮至干的醇提物?；钚詼y定 溶液配制： 底物AChE溶液的配制： AChE(500U)溶解于500mL Tris-HCL緩沖液(pH=7.8),加入500mgBSA(牛 血清白蛋白)以保持酶溶液的穩(wěn)定,此溶液可在4保持活性達(dá)6個月。150mg乙酸-萘酯溶解于40mL無水乙醇中,再用蒸餾水定容至100mL配成溶液（1.5mg/mL） 2.快藍(lán)鹽B溶液配制： 50mg快藍(lán)鹽B溶解于100mL蒸餾水中配成溶液（0.5mg/mL）點(diǎn)樣與顯色 首先,將待測樣品點(diǎn)于薄層板一端,用合適的溶劑系統(tǒng)展開,然后用吹風(fēng)機(jī)將板子完全吹干,不能殘留任何有機(jī)溶劑。噴1.0U/mLAChE溶液,冷風(fēng)快速吹至板子上沒有液體流動,再噴40%乙醇配的1.5mg/mL乙酸-萘酯溶液,也快速吹至板子上無浮液。在37恒溫水浴熱板上放置一套培養(yǎng)皿,皿底放少