1、基因的克隆與表達基因的克隆與表達基因克隆基因克隆(gene cloning)基因表達基因表達(gene expression) -原核基因表達原核基因表達 -真核基因表達真核基因表達基 因 克 隆 Gene Cloning概述概述克隆載體克隆載體受體細胞受體細胞體外重組的策略體外重組的策略基因克隆工作流程基因克隆工作流程一、概述 確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的盆子載體是DNA而不是蛋白質(zhì) 揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機理 提出了中心法則和操縱子學說，破譯了遺傳密碼1973年年Cohen完成第一個基因工程實驗完成第一個基因工程實驗經(jīng)經(jīng)體外重組體外重組獲得雜合獲得雜合DNA雜合子

2、轉(zhuǎn)化入大腸桿菌雜合子轉(zhuǎn)化入大腸桿菌所需元件：所需元件： 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 連接酶連接酶 載體載體 受體細胞受體細胞基因克?。ǚ肿涌寺』蚩寺。ǚ肿涌寺olecular cloning）-通過體外重組技術(shù)通過體外重組技術(shù),將一將一段目的段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當經(jīng)切割、連接插入適當載載體體，并導(dǎo)入，并導(dǎo)入受體細胞受體細胞，擴增形成大量，擴增形成大量子代分子的過程。子代分子的過程?；蚩寺〉暮诵幕蚩寺〉暮诵?體外重組體外重組(Recombination) : 人工將一段目的人工將一段目的DNA插入一個載體的過程。插入一個載體的過程。 基因克隆的技術(shù)路線基因克隆的技術(shù)路線 目的基因

3、目的基因 載體載體體外重組體外重組重組子（雜合重組子（雜合DNA）轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化受體細胞受體細胞篩選陽性克隆篩選陽性克隆大量擴增，獲得子代大量擴增，獲得子代DNA二、克隆載體二、克隆載體復(fù)制基因(replicator)選擇性記號克隆位點三、受體細胞三、受體細胞1 1、定義：外源、定義：外源DNADNA導(dǎo)入的細胞，是重導(dǎo)入的細胞，是重組體擴增的場所。組體擴增的場所。2 2、要求：易于接納外源、要求：易于接納外源DNADNA 無特異的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶無特異的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶 載體復(fù)制、擴增不受阻載體復(fù)制、擴增不受阻 與載體有互補性與載體有互補性四、體外重組的策略四、體外重組的策略1 1、粘末端連接、粘末

4、端連接1 1）全同源粘末端連接）全同源粘末端連接 最方便簡單最方便簡單 高背景高背景- -載體自身環(huán)化載體自身環(huán)化 雙向插入雙向插入2 2）定向克?。菏雇庠椿蚨ㄏ虿迦氲捷d體）定向克隆：使外源基因定向插入到載體中的克隆策略中的克隆策略 粘粘- -粘連接：最有效、最快捷粘連接：最有效、最快捷 粘粘- -平連接：適用于外源基因僅與載體有平連接：適用于外源基因僅與載體有一個相同酶切位點，可將另一末端補平一個相同酶切位點，可將另一末端補平2 2、平末端連接：、平末端連接： 酶切點為平末端或任何兩個末端補平酶切點為平末端或任何兩個末端補平的的DNADNA 效率低，酶用量大效率低，酶用量大3 3、人工接頭

5、連接、人工接頭連接人工接頭：人工合成含有酶切位點的寡人工接頭：人工合成含有酶切位點的寡核苷酸片段核苷酸片段4 4、T-AT-A克隆克隆 T-vectorT-vector兩條鏈的兩條鏈的55端含有一個端含有一個游離的游離的T T PCRPCR過程中，普通的過程中，普通的TaqTaq酶可在產(chǎn)物酶可在產(chǎn)物的的33端多加一個端多加一個A A五、基因克隆的工作流程五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的獲得（一）目的基因的獲得1 1、直接分離、直接分離3 3、構(gòu)建、構(gòu)建cDNAcDNA文庫文庫4 4、PCRPCR5 5、人工合成、人工合成6 6、差異顯示、差異顯示1 1、直接分離、直接分離DNADNA適用

6、于克隆原核生物的適用于克隆原核生物的基因組文庫基因組文庫2 2、構(gòu)建基因組文庫，篩選目的基因、構(gòu)建基因組文庫，篩選目的基因 基因組文庫基因組文庫(gene library)(gene library)：將某：將某種生物的基因組種生物的基因組DNADNA切割成一定大小切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導(dǎo)的片段，并與合適的載體重組后導(dǎo)入宿主細胞，進行克隆。這些存在入宿主細胞，進行克隆。這些存在于所有重組體內(nèi)的基因組于所有重組體內(nèi)的基因組DNADNA片段的片段的集合，即基因組文庫，它包含了該集合，即基因組文庫，它包含了該生物的所有基因。生物的所有基因。構(gòu)建流程構(gòu)建流程抽提基因組抽提基因組DN

7、ADNA鳥槍法制備鳥槍法制備DNADNA片段片段DNADNA片段與載體重組片段與載體重組轉(zhuǎn)化宿主菌轉(zhuǎn)化宿主菌篩選目的基因（核酸探針法、篩選目的基因（核酸探針法、免疫結(jié)合法）免疫結(jié)合法） 特點及應(yīng)用：特點及應(yīng)用：包含所有遺傳信息包含所有遺傳信息構(gòu)建難度大（單拷貝基因、長片段基因）構(gòu)建難度大（單拷貝基因、長片段基因）篩選難度大篩選難度大用于研究基因在基因組中的情況用于研究基因在基因組中的情況3 3、構(gòu)建、構(gòu)建cDNAcDNA文庫，篩選目的基因文庫，篩選目的基因cDNAcDNA文庫文庫(complementary DNA (complementary DNA library)library)以組織細

8、胞中的以組織細胞中的mRNAmRNA為模板，為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA cDNA ，各，各cDNAcDNA分子分子分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿主細胞克隆擴增。這些在重組體內(nèi)的主細胞克隆擴增。這些在重組體內(nèi)的cDNAcDNA的集合即的集合即cDNAcDNA文庫。文庫。 cDNAcDNA文庫僅包含正在表達的基因文庫僅包含正在表達的基因 不同物種、不同組織的不同物種、不同組織的cDNAcDNA文庫不相同文庫不相同 基因總量少，易篩選基因總量少，易篩選4 4、PCRPCR擴增目的基因片段擴增目的基因片段適用于克隆序列清楚的基因適用于克隆序列清楚的基

9、因以基因組以基因組DNADNA為模板，直接進行為模板，直接進行PCRPCR擴擴增較難增較難多采用以多采用以mRNAmRNA為模板的為模板的RT-PCRRT-PCR法法5 5、人工合成較短的、人工合成較短的DNADNA6 6、差異顯示法、差異顯示法( (differential display, differential display, DD)DD)篩選差異表達的基因篩選差異表達的基因（二）體外重組（二）體外重組連接體系的建立：連接體系的建立： 溫度：粘末端連接：溫度：粘末端連接：12-1812-18 平末端連接：室溫（低于平末端連接：室溫（低于30)30) DNADNA量：載體分子數(shù)量：載體

10、分子數(shù)/ /目的基因分子數(shù)目的基因分子數(shù)=1=1：1-31-3 酶量：平端連接時需加大酶量酶量：平端連接時需加大酶量（三）轉(zhuǎn)化（三）轉(zhuǎn)化CaclCacl2 2法、電擊法法、電擊法（四）重組子的篩選及鑒定（四）重組子的篩選及鑒定1 1、篩選：平板法（抗生素、藍白斑）、篩選：平板法（抗生素、藍白斑） 原位雜交原位雜交2 2、鑒定：、鑒定：長度鑒定：酶切、長度鑒定：酶切、PCRPCR方向鑒定：聯(lián)合酶切方向鑒定：聯(lián)合酶切測序測序基因的表達基因的表達 Gene Expression一表達系統(tǒng)：一表達系統(tǒng)： 基因工程中用來獲得有功能的異源蛋白基因工程中用來獲得有功能的異源蛋白質(zhì)的體系，包括克隆載體，表達載

11、體及質(zhì)的體系，包括克隆載體，表達載體及受體細胞。受體細胞。 據(jù)受體細胞的不同可分為：據(jù)受體細胞的不同可分為：1原核表達系統(tǒng)原核表達系統(tǒng)： 將外源基因引入原核細胞，并使其在原將外源基因引入原核細胞，并使其在原核細胞中以核細胞中以發(fā)酵形式發(fā)酵形式快速高效地表達、快速高效地表達、合成基因產(chǎn)物的體系。合成基因產(chǎn)物的體系。2真核表達系統(tǒng)真核表達系統(tǒng)：使外源基因在真核細：使外源基因在真核細胞中表達的體系。胞中表達的體系。二原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達特點二原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達特點1.原核生物染色體原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)是裸露的環(huán)形形DNA，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進行。連續(xù)進行。

12、 2. 原核生物形成原核生物形成多順反子多順反子mRNA：mRNA在合成過程中和多個核糖體在合成過程中和多個核糖體結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。 3、一般不含內(nèi)含子（、一般不含內(nèi)含子（intron），沒有轉(zhuǎn)），沒有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng)錄及翻譯后加工系統(tǒng) 4、原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起，形成一起，形成操縱子操縱子。操縱子（操縱子（operon）：是一組功能上相：是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個遺傳單位一個遺傳單位 原核生物基因表達的基本單位（即一原核生物基因表達的基本單位（即一個轉(zhuǎn)錄單位）。

13、個轉(zhuǎn)錄單位）。共同協(xié)調(diào)作用，完成某一多肽的表達共同協(xié)調(diào)作用，完成某一多肽的表達調(diào)控。調(diào)控。包括：調(diào)控區(qū)包括：調(diào)控區(qū)(調(diào)節(jié)基因，啟動基因，調(diào)節(jié)基因，啟動基因， 操作基因操作基因)、 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因5、原核生物中參與轉(zhuǎn)錄的基因結(jié)、原核生物中參與轉(zhuǎn)錄的基因結(jié)構(gòu)：構(gòu)：啟動子啟動子終止子終止子 啟動子啟動子(promoter, P)是指能被是指能被RNA聚合聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。序列。 一般長一般長40-60bp，富含，富含A-T堿基對堿基對 具有保守序列：具有保守序列： -10區(qū)（區(qū)（pribnow box）：）：TATAAT -35區(qū)：區(qū)：

14、 RNA聚合酶識別并結(jié)合啟動子，但并不開始轉(zhuǎn)錄聚合酶識別并結(jié)合啟動子，但并不開始轉(zhuǎn)錄 各種啟動子啟動轉(zhuǎn)錄能力不同。各種啟動子啟動轉(zhuǎn)錄能力不同。 啟動子強弱取決于啟動子強弱取決于-35區(qū)和區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間區(qū)的堿基組成及其間隔序列隔序列 終止子（終止子（terminatorterminator，T T）: :位于基因位于基因33端端, ,給予給予RNARNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNADNA序序列列 6、與轉(zhuǎn)譯有關(guān)的原核細胞結(jié)構(gòu)：與轉(zhuǎn)譯有關(guān)的原核細胞結(jié)構(gòu)：核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點轉(zhuǎn)譯起始密碼子轉(zhuǎn)譯起始密碼子AUG 或或GUGSD順序順序（shine-dalgarn

15、o）：）：AUG上游上游3-11 bp長約長約3-9bpmRNA與與16s核糖體亞基間的識別與核糖體亞基間的識別與結(jié)合序列結(jié)合序列 三外源基因在原核表達系統(tǒng)中表達三外源基因在原核表達系統(tǒng)中表達的必要條件的必要條件：1.刪除內(nèi)含子和刪除內(nèi)含子和5非編碼區(qū)非編碼區(qū)2.外源基因置于強啟動子和外源基因置于強啟動子和SD順序控制順序控制下下3.維持正確開放閱讀框架（維持正確開放閱讀框架（ORF）4.mRNA穩(wěn)定且可有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋穩(wěn)定且可有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白質(zhì)不被降解白質(zhì)不被降解 四影響外源基因在原核細胞中表四影響外源基因在原核細胞中表達效率的因素達效率的因素：1、啟動子：建立表達載體時，選擇強、啟動

16、子：建立表達載體時，選擇強啟動子。啟動子。 常見原核強啟動子常見原核強啟動子： Plac：受：受Lac阻遏蛋白負調(diào)，受阻遏蛋白負調(diào)，受IPTG的的誘導(dǎo)誘導(dǎo) Ptrp：取自大腸桿菌色氨酸操縱子。：取自大腸桿菌色氨酸操縱子。 Ptac :Lac啟動子和啟動子和Trp啟動子的雜合啟啟動子的雜合啟動子。動子。 PL和和PR啟動子啟動子：噬菌體早期左：噬菌體早期左/右向啟右向啟動子，受動子，受噬菌體噬菌體CI基因負調(diào)控。溫度基因負調(diào)控。溫度誘導(dǎo)。誘導(dǎo)。 2、基因劑量：、基因劑量：3、核糖體結(jié)合位點：、核糖體結(jié)合位點：SD順序與順序與16srRNA3末端互補程度。末端互補程度。AUGSD間距離。間距離。A

17、UG后的核苷酸后的核苷酸 五原核表達載體：五原核表達載體： 適用于在原核細胞適用于在原核細胞中表達外源基因的載體。中表達外源基因的載體。主要元件：強啟動子主要元件：強啟動子 SD順序順序 篩選標志篩選標志 其它調(diào)控基因其它調(diào)控基因 類型：類型：融合型表達載體：融合型表達載體：-融合蛋白融合蛋白非融合型表達載體：非融合型表達載體：-天然完整蛋白天然完整蛋白分泌型表達載體：分泌型表達載體：-產(chǎn)物可跨膜分泌產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙至胞周間隙 （一）融合型表達載體（一）融合型表達載體 PSDForeign DNA融合型表達載體融合型表達載體融合基因融合基因技術(shù)關(guān)鍵技術(shù)關(guān)鍵：克隆基因插入原核序列：克隆基

18、因插入原核序列3 3端而維持正確閱讀框架端而維持正確閱讀框架。 選擇合適酶切位點選擇合適酶切位點 加人工合成的加人工合成的DNA接頭接頭 構(gòu)建位相載體構(gòu)建位相載體-ATG - AAC CTG GAA TTC CTA GGT -TAC -TTG GAC CTT AAG GAT CCA-EcoRIBamHIAAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGTTTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA 載體部分序列載體部分序列DNA序列序列位相載體位相載體-含有含有3種讀碼框的系列載體種讀碼框的系列載體優(yōu)點：優(yōu)點：表達效率高表達效率高產(chǎn)物穩(wěn)定產(chǎn)物穩(wěn)定 易鑒定：融合蛋白分

19、子量大，電泳可易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定鑒定易純化：利用融合原核多肽的特性易純化：利用融合原核多肽的特性Ptac：IPTG誘導(dǎo)誘導(dǎo)GST融合蛋白融合蛋白直接純化直接純化產(chǎn)物切割方便：產(chǎn)物切割方便： pGEX-1 T凝血酶凝血酶 pGEX-2T-凝血酶凝血酶 pGEX-3T-X因子因子位相載體位相載體融合型載體融合型載體-pGEX系列系列（二）非融合型表達載體（二）非融合型表達載體 PSDForeign DNA非融合型表達載體非融合型表達載體非融合基因非融合基因主要元件：強啟動子主要元件：強啟動子 SD： ATG：第一個密碼子：第一個密碼子非融合型表達載體非融合型表達載體-pPL-La

20、mdaPL啟動子啟動子-溫度溫度誘導(dǎo)誘導(dǎo)插入位點插入位點-HpaI（三）分泌型表達載體：（三）分泌型表達載體：1、主要元件：、主要元件：啟動子和啟動子和SD序列序列信號肽序列信號肽序列 ：SD下游，編碼信號肽，下游，編碼信號肽， 可引導(dǎo)蛋白跨膜可引導(dǎo)蛋白跨膜2、優(yōu)點：分泌表達，避免降解。、優(yōu)點：分泌表達，避免降解。 分泌型表達載體分泌型表達載體-pINIII-ompA1分泌型融合表達載體分泌型融合表達載體-pEZZ18六六提高表達水平的手段提高表達水平的手段1、選擇合適載體，提高翻譯水平、選擇合適載體，提高翻譯水平 強啟動子強啟動子-提高轉(zhuǎn)錄水平提高轉(zhuǎn)錄水平 核糖體結(jié)合位點（核糖體結(jié)合位點（ATG-SD） 避免產(chǎn)物降解避免產(chǎn)物降解 ：分泌：分泌/融合表達融合表達 細菌蛋白酶抑制劑細菌蛋白酶抑制劑2、選擇合適宿主、選擇合適宿主 Lac 啟動子啟動子-LacI菌菌PL/PR - CI857 溶源菌溶源菌 3、誘導(dǎo)表達、誘導(dǎo)表達 溫度誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)-PLPR /IPTG的化學誘導(dǎo)的化學誘導(dǎo)-Plac、Ptac 4、提高表達蛋白的穩(wěn)定性，防止被宿、提高表達蛋白的穩(wěn)定性，防止被宿主降解主降解七表達產(chǎn)物的檢測：七表達產(chǎn)物的檢測： 1、特異性鑒定：、特異性鑒定：熒光抗體法熒光抗體法免疫沉淀法免疫沉淀法免疫印跡法免疫印跡法ELISA2、生物學活性鑒定、生物學活性鑒定 八、