1、實驗二實驗二 染色體染色體C-分帶分帶一、實驗目的一、實驗目的掌握植物染色體掌握植物染色體C分帶技術(shù)及帶型分析方法。分帶技術(shù)及帶型分析方法。二、實驗原理二、實驗原理l 染色體分帶是染色體分帶是20世紀世紀60年代末興起的一項細胞學新技術(shù)。年代末興起的一項細胞學新技術(shù)。l 其基本原理是借助于其基本原理是借助于酸、堿、鹽、酶酸、堿、鹽、酶等特殊的處理程序，等特殊的處理程序，對植物有絲分裂中期的染色體進行染色，使其在一定部位對植物有絲分裂中期的染色體進行染色，使其在一定部位顯示出顯示出深淺不同深淺不同的染色帶。的染色帶。l 各染色體上染色帶的各染色體上染色帶的數(shù)目、部位、寬窄、與深淺數(shù)目、部位、寬窄

2、、與深淺具有相對具有相對的的穩(wěn)定性穩(wěn)定性，因而為染色體形態(tài)鑒別增添了辨認的依據(jù)。，因而為染色體形態(tài)鑒別增添了辨認的依據(jù)。l 染色體帶紋的多樣性反映了染色體的染色體帶紋的多樣性反映了染色體的成分、結(jié)構(gòu)、行為和成分、結(jié)構(gòu)、行為和功能功能的復雜性。因此，染色體帶型分析為細胞遺傳學、染的復雜性。因此，染色體帶型分析為細胞遺傳學、染色體工程等方面提供了新的研究手段。色體工程等方面提供了新的研究手段。l植物染色體顯帶技術(shù)包括植物染色體顯帶技術(shù)包括熒光熒光分帶和分帶和吉吉姆薩姆薩分帶兩大類。分帶兩大類。l目前在目前在植物上植物上最常用的是吉姆薩分帶技最常用的是吉姆薩分帶技術(shù)，其中術(shù)，其中C帶和帶和N帶帶較為

3、常用。較為常用。l C帶帶: Centromere Heterochromatin or constitutive Heterochromatin帶。帶。l 主要顯示著主要顯示著絲粒絲粒、端粒端粒、核仁組織區(qū)核仁組織區(qū)或染或染色體臂某些部位的組成型色體臂某些部位的組成型異染色質(zhì)異染色質(zhì)。因其。因其在染色體上的在染色體上的顯帶部位顯帶部位不同，不同，分著絲粒帶分著絲粒帶、端粒帶端粒帶、核仁組織區(qū)帶和中間帶核仁組織區(qū)帶和中間帶等相應的等相應的名稱。名稱。植物染色體植物染色體C-帶主要包括以下四種帶：帶主要包括以下四種帶：1. 著絲粒帶（著絲粒帶（Centromeric Band):指著絲粒及其附近

4、的帶。指著絲粒及其附近的帶。2. 中間帶（中間帶（Intercalary Band)：分布在著絲粒至末端之間的帶。分布在著絲粒至末端之間的帶。3. 末端帶（末端帶（Telomere Band):位于染色體兩臂末端的帶。位于染色體兩臂末端的帶。4. 核仁組織區(qū)帶（核仁組織區(qū)帶（NOR band): 位于位于NOR區(qū)的核仁染色體專一帶。區(qū)的核仁染色體專一帶。1BTriticum timopheevii, AAGG?1122分帶前分帶前分帶后分帶后三、實驗材料：三、實驗材料：黑麥黑麥四、實驗儀器及藥品：四、實驗儀器及藥品：實驗儀器實驗儀器: 顯微鏡顯微鏡: 制片、鏡檢制片、鏡檢超低溫冰箱（干冰或液氮

5、）：冷凍揭片超低溫冰箱（干冰或液氮）：冷凍揭片溫箱：恒溫處理（溫箱：恒溫處理（Ba(OH)2）恒溫水浴鍋恒溫水浴鍋: HCl, 2XSSC定時鐘，容量瓶，量筒，燒杯，試劑瓶，染色缸，定時鐘，容量瓶，量筒，燒杯，試劑瓶，染色缸，培養(yǎng)皿，載玻片架，載玻片，蓋玻片，剪刀，鑷培養(yǎng)皿，載玻片架，載玻片，蓋玻片，剪刀，鑷子，刀片子，刀片, 濾紙等濾紙等.藥品藥品:無水乙醇無水乙醇: 脫水處理脫水處理冰醋酸（冰醋酸（45%）: 壓片壓片0.2NHCl: 2NHCl（母液稀釋）弱酸處理（母液稀釋）弱酸處理Ba(OH)2 ( 7%過飽和過飽和): 弱堿處理弱堿處理2SSC：20SSC(175g NaCl+83.

6、3g Na3C5H6O7- 1L) 1/15M Na2HPO4：23.876克克Na2HPO4.12H2O加蒸餾水加蒸餾水定容至定容至1000ml；1/15M KH2PO4： 9.07克克 KH2PO4，加蒸餾水定容至，加蒸餾水定容至1000ml；Giemsa母液：母液： Giemsa粉粉g+甲醇甲醇66ml甘油甘油66ml五五. 實驗方法實驗方法1發(fā)根發(fā)根2預處理預處理3固定固定在在45冰醋酸洋紅中浸泡片刻（室溫），然后在冰醋酸洋紅中浸泡片刻（室溫），然后在45冰醋酸冰醋酸壓片壓片。同實驗一同實驗一 在顯微鏡下挑選染色體分散而完整的片子，在顯微鏡下挑選染色體分散而完整的片子，在片子縱向一側(cè)用

7、鐵筆寫上編號在片子縱向一側(cè)用鐵筆寫上編號,置于置于70冰箱或液氮中凍片約冰箱或液氮中凍片約20min，然后用刀片揭開，然后用刀片揭開蓋玻片蓋玻片,置無水已醇中脫水約置無水已醇中脫水約10分鐘分鐘.制片置超低溫或制片置超低溫或液氮液氮（-70C）冰箱）冰箱冰凍揭片冰凍揭片4.冰凍揭片冰凍揭片 5.脫水脫水 100%ETOH 室溫室溫10分鐘分鐘6. 弱酸和弱堿處理弱酸和弱堿處理將標本片子在將標本片子在0.2N HCL中中(60)處理處理2.5分鐘，分鐘，蒸餾水沖洗；蒸餾水沖洗；室溫條件下飽和室溫條件下飽和Ba(OH)2處理處理7分鐘分鐘,用水徹底沖用水徹底沖洗干凈洗干凈;7.溫育溫育:流水沖洗后

8、置流水沖洗后置2SSC溶液溶液(60)中溫育中溫育60分鐘。分鐘。8. 染色染色:經(jīng)蒸餾水沖洗，甩干后用經(jīng)蒸餾水沖洗，甩干后用Giemsa 染液染色染液染色 約約10分鐘左右分鐘左右Giemsa染色至適度染色至適度 1/15M Na2HPO4 : 1/15M KH2PO4 = 2 : 1 20 ml 10ml 加加20-30滴染液滴染液.9. 鏡檢鏡檢, 拍照拍照.蒸餾水沖洗干凈蒸餾水沖洗干凈, 氣干氣干, 滴上二甲苯滴上二甲苯, 蓋蓋上蓋片上蓋片.10. 帶型分析帶型分析 將已分帶的標本，進行顯微攝影，沖洗、放將已分帶的標本，進行顯微攝影，沖洗、放大，按核型分析方法將染色體編號進行帶型分析，

9、大，按核型分析方法將染色體編號進行帶型分析，要求詳細記錄各染色體上各帶紋的位置、寬窄、要求詳細記錄各染色體上各帶紋的位置、寬窄、著色深淺和形狀。最后繪制染色體模式圖，在各著色深淺和形狀。最后繪制染色體模式圖，在各條染色體模式圖上標出各條帶紋的位置、寬窄、條染色體模式圖上標出各條帶紋的位置、寬窄、深淺、形狀等線條。深淺、形狀等線條。 六、染色體六、染色體C-C-分帶注意事項分帶注意事項: :1.做分帶的材料在固定液中的時間不要太做分帶的材料在固定液中的時間不要太長，否則會影響染色體形態(tài)，最終影響顯帶長，否則會影響染色體形態(tài)，最終影響顯帶;2.分帶前不宜染色，因此鏡檢時只能用相分帶前不宜染色，因此鏡檢時只能用相差鏡頭