1、一、概述 在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中, DNA雙鏈中的一條鏈為模板,稱為模板鏈或反義鏈反義鏈,而另一條鏈稱為編碼鏈或有義有義鏈鏈。 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)前面的序列稱為上游上游(upstream),后面的序列稱為下游下游(downstream)。起始點(diǎn)為+1,上游的第一個(gè)核苷酸為-1,其他的依次類推。第一節(jié)第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)與終止轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)與終止 轉(zhuǎn)錄起始主要由DNA分子上的啟動(dòng)子啟動(dòng)子（promoter)控制;終止由終止子終止子控制. DNA鏈上提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的序列稱為終止子（terminator）。是一個(gè)基因的末端或是一個(gè)操縱子的末端的一段特定序列。 由啟動(dòng)子到終止子的序列稱為轉(zhuǎn)錄單位(transcription

2、 unit)。 大腸桿菌RNA聚合酶由多亞基組成。2稱為全酶（holoenzyme），分子量約為480kDa。亞基與全酶結(jié)合松弛，應(yīng)用磷酸纖維素柱很容易使之與全酶分離。解離后的部分（2）稱為核心酶（core enzyme）。 啟動(dòng)子（promoter）是指DNA分子上被RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。 啟動(dòng)子是控制轉(zhuǎn)錄起始的序列，并在很大程度上決定著某一基因的表達(dá)強(qiáng)度。 二、原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)二、原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu) 分析了分析了100多種大腸桿菌啟動(dòng)子的序列，發(fā)現(xiàn)主要有多種大腸桿菌啟動(dòng)子的序列，發(fā)現(xiàn)主要有2個(gè)保守個(gè)保守區(qū)域：區(qū)域：10區(qū)、區(qū)、35區(qū)。區(qū)。 （1）-10區(qū)區(qū) 在轉(zhuǎn)錄起

3、始點(diǎn)的上游緊接著一個(gè)在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游緊接著一個(gè)6bp的保的保守序列守序列,在幾乎目前已知所有的啟動(dòng)子中均存在。其在幾乎目前已知所有的啟動(dòng)子中均存在。其中心位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約中心位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約-10bp處（在不同啟動(dòng)子處（在不同啟動(dòng)子中有所差別），因此這一保守序列又稱中有所差別），因此這一保守序列又稱 為為-10序列序列。其一致序列為其一致序列為T80A95T45A60A50T96，又稱為，又稱為Pribnow框框. 其中帶下劃線的其中帶下劃線的T稱為稱為“保守保守T”。 Pribnow盒是盒是RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn)聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn),又稱又稱結(jié)結(jié)合位點(diǎn)合位點(diǎn),或稱或稱為解鏈區(qū)。

4、為解鏈區(qū)。 該區(qū)域富含該區(qū)域富含AT對(duì)對(duì),熔點(diǎn)較低熔點(diǎn)較低, RNA聚合酶的結(jié)合使得這個(gè)聚合酶的結(jié)合使得這個(gè)AT豐富豐富區(qū)消耗較低的能量而解旋，此時(shí)區(qū)消耗較低的能量而解旋，此時(shí)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的復(fù)合物便由聚合酶與啟動(dòng)子的復(fù)合物便由封閉復(fù)合物封閉復(fù)合物(closed-promoter complex) 轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)變?yōu)殚_(kāi)放復(fù)合物開(kāi)放復(fù)合物(open-promoter complex) ，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。（2）35區(qū)區(qū) 在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游35bp處，有另一個(gè)保守序列，稱處，有另一個(gè)保守序列，稱為為35序列。其一致序列為序列。其一致序列為T82T84G78A65C54A45。該保

5、守序列又稱。該保守序列又稱SextamaSextama框框。RNA聚合酶的聚合酶的因子可以識(shí)別該位點(diǎn)，所以稱作因子可以識(shí)別該位點(diǎn)，所以稱作識(shí)別位識(shí)別位點(diǎn)點(diǎn)。RNA聚合酶先識(shí)別的這一區(qū)域并與之結(jié)合，然后再與結(jié)合位點(diǎn)聚合酶先識(shí)別的這一區(qū)域并與之結(jié)合，然后再與結(jié)合位點(diǎn)相互作用。相互作用。v決定原核啟動(dòng)子強(qiáng)弱的因素(1) Sextama Box (-35區(qū)）(2) Pribnow Box（-10區(qū)）(3) Distance between the two boxes（兩個(gè)區(qū)之間的距離）三、轉(zhuǎn)錄的終止三、轉(zhuǎn)錄的終止 在大腸桿菌中，有兩種類型的終止子，第一類終止子稱為不依在大腸桿菌中，有兩種類型的終止子，

6、第一類終止子稱為不依賴賴因子的終止子因子的終止子(或稱內(nèi)在終止子或稱內(nèi)在終止子intrinsic terminator），在體），在體外實(shí)驗(yàn)中足以使轉(zhuǎn)錄終止，外實(shí)驗(yàn)中足以使轉(zhuǎn)錄終止，屬?gòu)?qiáng)終止子屬?gòu)?qiáng)終止子。另一類終止子必須在。另一類終止子必須在因子（因子（ factor）的存在下才能終止轉(zhuǎn)錄，因此稱為依賴）的存在下才能終止轉(zhuǎn)錄，因此稱為依賴因子的因子的終止子（終止子（-dependent terminator），），屬弱終止子屬弱終止子 。 兩類終止子的共同序列特征兩類終止子的共同序列特征 在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)之前有一段反在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)之前有一段反向重復(fù)序列向重復(fù)序列. 5-ATTATTAAAGGCTCC

7、AAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTT-TTTTGGAGCCTTTTTTTT-3 3-TAATTTCCGAGGAAAA-TAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAACCTCGGAAAAAAAA-AAAAA-5 E. coli色氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄終止子（不依賴于色氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄終止子（不依賴于因子的終止子）及其中的反向因子的終止子）及其中的反向重復(fù)（黃色）重復(fù)（黃色） 兩類終止子的共同序列特征兩類終止子的共同序列特征 在轉(zhuǎn)錄在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)之前有一段反向重復(fù)序列終止點(diǎn)之前有一段反向重復(fù)序列. 5-ATTATTAAAGGCTCCAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTT

8、T-TTTTGGAGCCTTTTTTTT-3 3-TAATTTCCGAGGAAAA-TAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAACCTCGGAAAAAAAA-AAAAA-5 E. coli色氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄終止子（不依賴于色氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄終止子（不依賴于因子的終因子的終止子）及其中的反向重復(fù)（黃色）止子）及其中的反向重復(fù)（黃色）5 33 5 轉(zhuǎn)錄進(jìn)行到終止子序列時(shí)，就進(jìn)入了終止階段，包括新生RNA鏈的釋放及RNA聚合酶與DNA解離。 終止子在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)之前，RNA聚合酶是通過(guò)了終止子后面后再終止轉(zhuǎn)錄的。 推測(cè)：終止子反向重復(fù)序列處轉(zhuǎn)錄出來(lái)的RNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，即柄-嚕噗結(jié)構(gòu)（stem-

9、loop），又稱發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與RNA聚合酶的某種特定的空間結(jié)構(gòu)嵌合，造成轉(zhuǎn)錄作用的暫停典型的終止子暫停時(shí)間為60秒左右。 回文序列后面連續(xù)的A，轉(zhuǎn)錄出U，dA和U之間的氫鏈力很弱，RNA和DNA雜交易拆開(kāi)，導(dǎo)致三元復(fù)合物解體，RNA聚合酶解離下來(lái)，轉(zhuǎn)錄終止。 不依賴因子的終止子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上有兩個(gè)特征，一是形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin），莖富含GC對(duì)；二是發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端緊跟著6個(gè)連續(xù)的U串。1.不依賴于Rho因子的終止子 在體外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)盡管有該類終止子存在，但RNA聚合酶只在終止子處暫停，轉(zhuǎn)錄并不終止。向該反應(yīng)系統(tǒng)中加入因子，則可使轉(zhuǎn)錄在特定的位點(diǎn)終止。這種終止稱為依賴因子的轉(zhuǎn)錄

10、終止。 依賴于Rho因子的終止子不但柄部GC含量較低，因而暫停時(shí)間較短，且在下游缺乏連續(xù)的A/U，因此，若無(wú)Rho因子的幫助，RNA聚合酶會(huì)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄下去，稱為通讀(readthrough)。2.依賴于Rho因子的終止子 是一個(gè)大聚體蛋白質(zhì),有兩個(gè)活性：i.依賴于RNA的NTPase活性，在有單鏈RNA存在時(shí)可水解ATP ；ii.RNA-DNA解旋酶活性：與亞基作用，使RNA鏈從復(fù)合物中解離。 沿新生RNA鏈向轉(zhuǎn)錄復(fù)合物移動(dòng)，能使RNA聚合酶在依賴性終止子處終止轉(zhuǎn)錄。在原核生物中，轉(zhuǎn)錄與翻譯是同時(shí)進(jìn)行的，因子的終止作用可被核糖體的存在而阻礙。 RNA Pol轉(zhuǎn)錄DNA 因子附著到RNA 識(shí)別位點(diǎn)

11、上 因子跟在RNAPol 后沿RNA移動(dòng) RNA Pol在終止位 點(diǎn)停下，并被因 子追上 在轉(zhuǎn)錄泡中 因子使DNA-RNA雜 種雙鏈解開(kāi)， 轉(zhuǎn)錄終止,釋放出 RNA Pol,因子 和RNA。 幾種細(xì)菌幾種細(xì)菌因子的氨基酸序列比較結(jié)果表明，因子的氨基酸序列比較結(jié)果表明，它們均由兩部分組成：即它們均由兩部分組成：即核心酶結(jié)合區(qū)核心酶結(jié)合區(qū)和和一一35區(qū)區(qū)一一10區(qū)結(jié)合區(qū)區(qū)結(jié)合區(qū)。前者在不同類型的。前者在不同類型的因子中具有因子中具有較高的同源性，暗示它們作用于同一種核心酶；較高的同源性，暗示它們作用于同一種核心酶；而后者則呈現(xiàn)出較大的差異性，對(duì)應(yīng)于不同的保而后者則呈現(xiàn)出較大的差異性，對(duì)應(yīng)于不同的保

12、守序列。守序列。 一種一種因子取代因子取代RNA聚合酶中的另一種聚合酶中的另一種因子，因子，即可關(guān)閉一組基因，同時(shí)打開(kāi)另一組基因。即可關(guān)閉一組基因，同時(shí)打開(kāi)另一組基因。 第二節(jié)第二節(jié) 因子的更替對(duì)因子的更替對(duì)轉(zhuǎn)錄起轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控始的調(diào)控 在細(xì)菌受到外界環(huán)境的急劇影響或芽孢菌生活方式改變時(shí)，會(huì)產(chǎn)生因子更替的現(xiàn)象。 1. 枯草桿菌因子的更替 在枯草桿菌，因子的更替控制著生活方式的改變?？莶輻U菌共有約10種因子。其中有些出現(xiàn)于正常生活期，有些出現(xiàn)于噬菌體感染或是芽孢中, 還有一些則在細(xì)菌從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向芽孢形成轉(zhuǎn)變的過(guò)程中發(fā)揮作用 枯草桿菌在正常營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期間所使用的RNA聚合酶具有與大腸桿菌相同的結(jié)構(gòu)，

13、 255, 其中的55所識(shí)別的啟動(dòng)子保守序列也與大腸桿菌因子所識(shí)別的-10與-35大致相同。而其他因子所識(shí)別的-10與-35的一致性序列各異。 枯草桿菌在芽孢形成過(guò)程中采取更換因子的策略2. 枯草桿菌噬菌體枯草桿菌噬菌體SP01的感染周期的感染周期 一組基因的表達(dá)導(dǎo)致另一組基因隨后表達(dá)，稱為基因表達(dá)的一組基因的表達(dá)導(dǎo)致另一組基因隨后表達(dá)，稱為基因表達(dá)的時(shí)序調(diào)控或級(jí)聯(lián)調(diào)控，時(shí)序調(diào)控或級(jí)聯(lián)調(diào)控，這是噬菌體感染周期中的普遍特征。這是噬菌體感染周期中的普遍特征。 在枯草桿菌噬菌體在枯草桿菌噬菌體SP01的感染周期中，其基因表達(dá)的時(shí)序調(diào)的感染周期中，其基因表達(dá)的時(shí)序調(diào)控是由一系列的控是由一系列的因子來(lái)實(shí)

14、現(xiàn)的。因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 SP01的感染周期經(jīng)歷早中晚三個(gè)階段：的感染周期經(jīng)歷早中晚三個(gè)階段： i. 剛剛感染時(shí)，早期基因被轉(zhuǎn)錄。剛剛感染時(shí)，早期基因被轉(zhuǎn)錄。 ii. 4-5分鐘后早期基因轉(zhuǎn)錄停止，中期基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。分鐘后早期基因轉(zhuǎn)錄停止，中期基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。 iii. 8-12分鐘后中期基因的轉(zhuǎn)錄又被晚期基因所取代。分鐘后中期基因的轉(zhuǎn)錄又被晚期基因所取代。 寄主的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄早期基因，早期基因包括28 ，其表達(dá)產(chǎn)物是gp28；由gp 28與宿主核心酶構(gòu)成的噬菌體RNA聚合酶特異性識(shí)別中期基因33和34的啟動(dòng)子，并促使它們合成gp33和gp34。這兩個(gè)蛋白因子置換上述RNA聚合酶中的gp28，特

15、異性識(shí)別晚期基因啟動(dòng)子，最終導(dǎo)致晚期基因的表達(dá)。 中期基因以早期基因的表達(dá)產(chǎn)物為因子；晚期基因又以中期基因的表達(dá)產(chǎn)物為因子。structural genes constitutive mutants 沒(méi)有乳糖，代謝酶照樣合成（不沒(méi)有乳糖，代謝酶照樣合成（不需要誘導(dǎo)）。需要誘導(dǎo)）。merodiploiddominant/recessive cis and transRecognize another class of repressor mutants constitutive and dominant. This kind of mutant gene makes a defective pr

16、oduct that can still form tetramers with wild-type repressor monomers. However, the defective monomers spoil the activity of the whole tetramer so it cannot bind to the operator. Hence the dominant nature of this mutation.This kind of spoiler mutation is widespread in nature, and it is called by the

17、 generic name dominant-negative. Thus, Jacob and Monod, by skillful genetic analysis,were able to develop the operon concept. lThey predicted the existence of two key control elements: the repressor gene and the operator. lDeletion mutations revealed a third element (the promoter) that was necessary

18、 for expression of all three lac genes. lFurthermore, they could conclude that all three lac genes (lacZ, Y, and A) were clustered into a single control unit: the lac operon. Subsequent biochemical studies have amply confirmed Jacob and Monods beautiful hypothesis.Bacterial Transcription Initiation

19、Cooperative binding of E. coli RNA polymerase and cAMP-CAP to the lac promoter. By themselves, both RNA polymerase and cAMP-CAP have relatively low affinity for their respective binding sites in lac promoter DNA. However, interaction between residues in CAP and an a subunit of RNA polymerase forms a

20、 protein-protein complex that binds much more stably to promoter DNA than either protein alone 調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物作為阻遏物與操縱基因結(jié)合，從而關(guān)閉操縱子，稱為負(fù)控制。 調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物（例如CAP蛋白）作為激活因子開(kāi)啟轉(zhuǎn)錄，增加酶或蛋白質(zhì)的合成。稱為正控制。真正的誘導(dǎo)物是別乳糖。別乳糖的產(chǎn)生需要半乳糖苷酶。問(wèn)題：第一個(gè)別乳糖是如何產(chǎn)生的？答案是存在本底組成型合成。本底組成型合成 阻遏蛋白與lacO的結(jié)合有一個(gè)1020分鐘的半衰期： RNA聚合酶抓住阻遏蛋白脫離lacO的極短時(shí)間，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生1-2個(gè)mRNA,

21、 翻譯生成三種酶.附：模型的遺傳學(xué)驗(yàn)證與生化證據(jù)附：模型的遺傳學(xué)驗(yàn)證與生化證據(jù)In collaboration with Pardee,Jacob,Monod and created merodipoids (partial diploid bacteria).遺傳作圖遺傳作圖 Oc: operator constitutive, cis-dominant lac Is: mutation that render the repressor unable to respond to inducer. Both cis- and trans- dominant . lac I-: makes a

22、 constitutive repressor that cannot recognize the operator.constitutive and recessive. lacI-d: makes a defective product that can still form tetramers with wild type repressor monomers. However the defective monomers spoil the activity of the whole tetramer so it cannot bind to the operator. constit

23、utive; dominant-negative.野生型野生型組成型突變lacOclacI-生化與分子生物學(xué)研究阻遏物分離鑒定：阻遏物的含量極少，每細(xì)胞不超過(guò)阻遏物分離鑒定：阻遏物的含量極少，每細(xì)胞不超過(guò)10份。份。直到直到1966年，年，Walter Gilbert和和Benno Muller-Hill從從lacI的超量突變菌株中，的超量突變菌株中，利用透析（利用透析（dialysis）的方法，通過(guò)）的方法，通過(guò)IPTG與阻遏物的結(jié)合作用，分離到了與阻遏物的結(jié)合作用，分離到了這個(gè)蛋白質(zhì)。這個(gè)蛋白質(zhì)。Gilbert及其同事又用放射自顯影證明它及其同事又用放射自顯影證明它能與能與lacO DNA

24、結(jié)合。結(jié)合。放射性標(biāo)記的阻遏物不能與突變型O區(qū)結(jié)合電鏡觀察電鏡觀察Lac repressorX-ray分析兩個(gè)單體結(jié)合在一個(gè)完整的兩個(gè)單體結(jié)合在一個(gè)完整的lacO區(qū)；區(qū)；The tertiary and quaternary structures of an Escherichia coli Lac repressor missing its N-terminal DNA binding domains (top); and models for a helix-loop-helix protein, LARTH, and its duplicated version, LARFH (bottom). LARTH and LARFH were engineered by connecting two and four copies of the C-terminal -helix of the Lac repressor, respectively. LARTH exists predominantly as a homodimer that likely maintains a four-helix bundle moti