1、馬鞭草化學(xué)成分的研究作者：孫成、李峰、李炎平、周明軍 指導(dǎo)老師：楊勇勛年級專業(yè)：（2009級應(yīng)用化工技術(shù)）摘 要：本論文由兩部分組成，第一部分主要是對馬鞭草的化學(xué)成分及藥理作用作一介紹和說明；最后一部分是馬鞭草的化學(xué)成分研究。為了尋找具有抗腫瘤等生理活性的環(huán)烯醚萜類化合物，我們對馬鞭草進行了化學(xué)成分研究，現(xiàn)通過硅膠柱色譜等方法，從馬鞭草中分離得一個化合物，并根據(jù)理化性質(zhì)與核磁共振光譜，鑒定化合物為馬鞭草苷，此化合物的分離與鑒定為下一步的新藥開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：馬鞭草 化學(xué)成分 環(huán)烯醚萜苷 馬鞭草苷Abstract：This paper includes two chapters: p

2、art 1 is a review of the research progress on chemical constituents and bioactivity of Verbena officinalis L., the last part is the study on the chemical constituents from Verbena officinalis L.To find the iridoid glucosides constituents which have many bioactivities such as anticancer from Verbena

3、officinalis L., we investigated the chemical constituents of Verbena officinalis L. Now, one compound was isolated From the Verbena officinalis L. by the various chromatography such as silica gel column. On the basis of chemical evidences and extensive spectroscopic methods, the structure of the com

4、pound 1 was elucidated as verbenalin. The isolation and identify of compound 1 provide a basis of exploitation a new drug. Key words: Verbena officinalis L chemical constituents iridoid glucosides verbenalin1馬鞭草研究現(xiàn)狀1.1馬鞭草概述馬鞭草為馬鞭草科多年生植物，又名紫頂龍牙草、燕尾草等，始載于名醫(yī)別錄1。馬鞭草通常情況下高度為30-120厘米，主根近木質(zhì)，黃白色，有多數(shù)須根；莖四棱形，

5、多分枝；雙子葉對生；其花秋夏開放，成藍紫色。馬鞭草喜肥、喜濕潤、怕澇、不耐干旱，但一般的土壤均可生長。廣泛分布于中國的西南、江浙、陜西等地；其在國外分布亦廣泛，主產(chǎn)熱帶美洲2。長期以來，馬鞭草在中國被作為傳統(tǒng)中藥使用，其有清熱解毒、活血散瘀、利水消腫等功效；可用于治療瘧疾、白喉、流行性感冒、咳嗽等病狀。中國藥典2005年版一部記載馬鞭草用于經(jīng)閉痛經(jīng)、瘧疾、水腫等病；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明馬鞭草具有消炎、止痛、止血、抗菌等作用。國外對馬鞭草的研究始于20世紀初，后來研究人員相繼從馬鞭草中分離出了環(huán)烯醚萜類、黃酮類、甾體類等幾十種化合物，并確定部分化合物有免疫活性、抗癌、鎮(zhèn)痛等藥理作用3。1.2馬鞭草藥

6、理作用及臨床應(yīng)用1.2.1抗癌作用焦中秀、徐昌蘇等研究者表明馬鞭草醇提物對絨毛膜癌JAR細胞增值有明顯抑制作用，具有抗絨癌作用，且有特異性4。1.2.2抗早孕作用馬鞭草醇提物是孕婦忌用藥物，南京醫(yī)科大學(xué)一附院曾對76例停經(jīng)33-42d的早孕婦女口服復(fù)方馬鞭草粉劑，流產(chǎn)率達83.4%。張濤等發(fā)現(xiàn)馬鞭草甲醇提起物對大鼠的妊娠率達到80%。進一步研究證明馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷和3、4二氫甲馬鞭草苷均能顯著增加大鼠子宮平滑肌條的收縮頻率和振幅，從而更深入說明馬鞭草具有抗早孕的作用4。1.2.3免疫調(diào)節(jié)作用劉玉琴對645例免疫性不孕者（血清抗精子抗體AsAb）、抗子宮內(nèi)膜抗體（EmAb）、康卵巢抗體（A

7、oAb）、抗心磷脂抗體（AcAb）的陽性率分別為83.1%、7.4%、4.2%、40.9%。當中的580例施以以馬鞭草為主的藥方進行治療，與只服用強的松對照組65例病人對比，前者的1、2、3個療程的轉(zhuǎn)陽率及總?cè)焉锫史謩e比后者高出47.1%、26.7%、16.3%、46.1%，顯示了確切的免疫調(diào)節(jié)作用5。1.2.4抗炎抗病毒作用N.E.Hernandez等發(fā)現(xiàn)馬鞭草對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有明顯的抑制活性，并表明這方面的活性與馬鞭草中所含的黃酮類化合物有關(guān)。1.2.5其他作用馬鞭草對哺乳動物有持久的促進乳汁分泌的作用；可促進家兔的血液凝固，對交感神經(jīng)末梢小劑量興奮，大劑量抑制；對瘧原蟲有抑

8、制作用，可使瘧原蟲變形。此外，馬鞭草和其他草藥一起作為日常保健可以降血糖、血壓，可以抑制飲食中放射性元素的吸收。同時，馬鞭草中馬鞭草苷具有多種藥理活性，尤其是在神經(jīng)保護方面，起作用機制更是多靶點、多環(huán)節(jié)、多途徑的；因此對老年癡呆、帕金森氏病等神經(jīng)衰退病變的防治具有很大的應(yīng)用價值6。1.3馬鞭草化學(xué)成分研究現(xiàn)狀1.3.1三萜類化合物三萜類化合物廣泛存在于植物界，具有明顯的生物活性，因此其是科研的熱點。1986年，A.M.Makboul從馬鞭草中分離出三萜類化合物熊果酸又名烏蘇酸，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，其突出作用為抗腫瘤、對多種致癌、促癌有抵抗作用、對多種惡性腫瘤細胞也有抑制作用7。1.3.2甾體

9、類化合物甾體類化合物也廣泛存于植物中，目前用于治療的已超過150種。但在馬鞭草中目前研究的不多。1985年我國科學(xué)家桂承會等從馬鞭草中分離出-谷甾醇，填補了國內(nèi)對馬鞭草化學(xué)成分研究的空白8。1.3.3揮發(fā)油類化合物1996年，Jean-Claude Chakhat通過水蒸汽蒸餾，以GC和GC-MS法從得到的馬鞭草葉的總揮發(fā)油中鑒定出40多種揮發(fā)性化學(xué)成分，其主要含有檸檬烯、氧化石竹烯、斯巴醇類等9。1.3.4脂肪酸類化合物1996年，J.L.Guil等人以GC法系統(tǒng)研究了馬鞭草中的脂肪酸的種類和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)了含有豐富的C14到C24長鏈飽和脂肪酸以及相同碳鏈長度的10種不飽和脂肪酸；同時他們通過

10、紫外光譜法發(fā)現(xiàn)其含有大量草酸10。1.3.5糖苷類化合物1908年，L.Bourdier就從馬鞭草中分離出了第一個化合物馬鞭草苷。1973年Horst Rimper等人從馬鞭草和戟葉馬鞭草中均分離出另一種重要的環(huán)烯醚萜類化合物戟葉馬鞭草苷。1986年，A,M,Makboul從馬鞭草中分離的到 一種新骨架環(huán)烯醚萜類糖苷-桃葉珊瑚苷11。此外，1998年J.L.Guil Guerrero等人還研究了馬鞭草的無機成分，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)其含有豐富的Mg、Ca，另外還含有大量的K、Na、無機N、無機P和微量元素Cu、Zn、Mn。1.3.5.1馬鞭草糖苷類化合物研究現(xiàn)狀實驗已經(jīng)證實馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷、毛蕊

11、花苷是馬鞭草水溶性成分中重要的糖苷類化合物。在生物活性方面1998年Singh B發(fā)現(xiàn)馬鞭草苷口服給藥對小鼠具有明顯保護肝的作用；2001年張濤等發(fā)現(xiàn)馬鞭草中的馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷和3、4二氫甲馬鞭草苷均能顯著增加大鼠子宮平滑肌條的收縮頻率和振幅與馬鞭草醇提物抗早孕有關(guān)12。在衍生物合成方面，1962年G.Buchi等在確定其立體化學(xué)結(jié)構(gòu)時做過催化氫化等反應(yīng)；1980年前后S.Damtoft對其生物合成進行了研究。波蘭Milkowska-Leyck.K等總結(jié)了環(huán)烯醚萜類化合物涉及到了14個化合物的生物活性，包括抗細菌、抗真菌、抗過濾性病原體、抗炎、止痛、抗腫瘤以及治療風(fēng)濕等13。即便如此，馬

12、鞭草化學(xué)成分的研究還是處于初級和發(fā)展階段。如今在人們生活水平提高的同時，各種患高血脂、動脈硬化等病人的數(shù)量亦不斷上升，人們對藥物的需求量也不斷增大。馬鞭草以其豐富的資源、較低的價格、較強的藥理作用贏得了研究者們的親睞，再加之各種科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為馬鞭草的研究提供了技術(shù)的可能性，馬鞭草化學(xué)成分的研究引起了一輪熱潮。本次我們決定選擇馬鞭草水溶性成分進行提取分離。查文獻資料可知，其水溶性成分主要為環(huán)烯醚萜類化合物，是馬鞭草中重要的活性物質(zhì)之一，含量較高，相對容易提?。黄浯螕?jù)研究發(fā)現(xiàn)環(huán)烯醚萜化合物是一些植物體內(nèi)自身的防御性物質(zhì)，具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)等廣泛生物活性，我們認為其含有治療癌癥、抗腫瘤的有效成分

13、14。2馬鞭草化學(xué)成分的研究2.1提取分離原理解析2.1.1提取分離方法的選擇從藥材中提取天然活性成分的方法有溶劑法、水蒸汽蒸餾法及升華法等。后兩種方法的應(yīng)用十分有限，大多數(shù)情況下是采用溶劑法。溶劑法系選擇適當溶劑將中草藥中的化學(xué)成分從藥材中提取出來，是根據(jù)“相似相溶”這一原理進行的。植物成分中萜類、甾體類等脂環(huán)類及芳香類化合物因極性極小，易溶于氯仿、乙醚等親脂性溶劑中；而糖苷、氨基酸類等成分則極性較大，易容于水和含水醇中。此次我們將分離馬鞭草中的環(huán)烯醚萜類化合物，所以應(yīng)選擇極性較大的溶劑進行提取。查文獻可知，水、甲醇、乙醇等都是馬鞭草的良好溶劑15。為了考慮到分離化合物的多樣性和實驗方便，我

14、們選擇95%的乙醇作溶劑，因為水對非極性化合物溶解不好，不利于多樣性的選擇；甲醇有巨毒，不利于實驗操作，同時不利于投入中式和生產(chǎn)；而乙醇對極性和非極性化合物都有較好的溶解性，又沒有巨毒。此外，考慮到馬鞭草有效成分可能不穩(wěn)定，和實驗條件的限制，我們采用溶劑法中的滲漬法在常溫常壓下提取其化學(xué)物質(zhì)。2.1.2大孔樹脂柱色譜的選擇大孔樹脂吸附柱是利用分子間范德華力和氫鍵的相互作用力而工作的，大孔樹脂是吸附性和分子篩選原理相結(jié)合的分離材料。根據(jù)吸附作用的強弱選用不同的洗脫液或不同濃度的同一溶劑，常見洗脫液有：甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。對非極性大孔樹脂，洗脫液極性越小，洗脫能力越強；對于中等極性的大孔

15、樹脂和極性較大的化合物來說，則選用極性較大的洗脫液為宜。大孔樹脂現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于天然化合物的分離和富集工作中，如苷與糖類的分離、生物堿的制備，在多糖、黃酮、三萜類化合物的分離方面都有很好的實例。大孔樹脂對糖類吸附能力很差，對色素的吸附能力很強。利用大孔樹脂的多孔結(jié)構(gòu)和選擇性吸附功能可提取分離中藥中的精致部位或有效成分，最大限度的去粗取精；目前這項技術(shù)已廣泛運用于各類中藥有效成分提取及中藥復(fù)方的現(xiàn)代化研究中16。我們選擇大孔樹脂吸附柱分別用濃度為10%、20%、30%、40%、95%的乙醇作沖洗液，以出去酚類、鞣質(zhì)類、黃酮類等雜質(zhì)。2.1.3硅膠柱的選擇在天然有機化合物分離和精制過程中，吸附現(xiàn)

16、象利用的十分廣泛。其中以固-液吸附用的最多，并有物理吸附、化學(xué)吸附及半化學(xué)吸附之分。其中硅膠、氧化鋁為吸附劑進行的吸附色譜屬于物理吸附，實際工作中最常用。使用過程中吸附劑目粒大小、裝柱溶劑、洗脫劑的選擇要根據(jù)實際需要而確定16。本次我們選擇硅膠吸附柱色譜，用蒸餾水裝柱，分別用體積比為10：1、10:2、10:3的氯仿-甲醇作洗脫液。2.1.4薄層色譜的選擇薄層色譜分離是色譜法的一種，是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實驗技術(shù)。它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點，一方面適用于少量（幾到幾微克）樣品的分離；另一方面在制作薄層板時，把吸附層加大加厚，又可以用樣精制樣品，此法特別適用于揮發(fā)性較小或較

17、高溫度下易發(fā)生變化而又不能用氣相色譜分離的物質(zhì)。此外，薄層色譜還可用來跟蹤有機反應(yīng)及進行柱色譜之前的一種預(yù)試。我們將利用薄層色譜的這些優(yōu)點對馬鞭草水溶液成分進行最后分離。 2.2提取分離藥品和儀器據(jù)文獻報道，在研究馬鞭草化學(xué)成分時，一般選擇馬鞭草全草（地上部分）作為研究對象。本次我們將其根部和地上部分一起提取分離，以期獲得不同結(jié)果。還需要藥品：95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、氯仿、大孔樹脂、硅膠粉等。儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)皿（型號：RE-5205.上海亞榮生化儀器廠)、真空泵（SHZ-3型）、層析缸、氣泵、量筒、燒杯、移液管、硅膠柱、分液漏斗、注射液小瓶等。2.3提取分離工藝流程根據(jù)文獻資料

18、可知，張承忠在分離蒙古醚蘇中的環(huán)烯醚萜類化合物成分時，用乙醇回流提取之后在用丙酮溶解，粗提物先經(jīng)聚酰胺柱，不同粗組織在經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，用不同溶劑洗脫，最后得到3種化合物。張濤等人用甲醇作溶劑提取馬鞭草粗末后，回收甲醇至浸膏，用硅藻土干燥后上硅藻土柱，用不同溶劑洗脫，洗脫液分別回收至三部分，第三部分經(jīng)反復(fù)硅膠層析則可得3個化合物。參照前人研究經(jīng)驗，我們將馬鞭草根和地上部分共2500g粉粹，用95%乙醇（13L左右）在常溫下浸析三次，每次間隔時間為1天，然后減壓蒸餾粗濾液，得粗浸膏0.4kg。向浸膏中加入蒸餾水進行轉(zhuǎn)溶，并用石油醚萃取，重復(fù)操作4次，以出去水不溶性雜質(zhì)。向水溶性物質(zhì)中加入乙酸乙酯

19、萃取4次，進一步出去脂溶性雜質(zhì)，得除酯層液。將除酯層液反復(fù)減壓蒸餾至出盡有機溶劑為止。將蒸餾品加蒸餾水稀釋過大孔樹脂以出去酚類、鞣質(zhì)類、黃酮類等雜質(zhì)，讓我們需要的環(huán)烯醚萜類化合物停留在大孔樹脂內(nèi)。然后分別用10%、20%、30%、40%、95%乙醇溶液700ml洗柱，并分別回收沖洗液。分別對沖洗液在40攝氏度的溫度下減壓蒸餾并回收精餾品，經(jīng)觀察10%、20%沖洗液顏色較淺，化合物組分較少，易分離。故我們決定將10%、20%精餾品混合加入適量硅藻土干燥得粉末，將其加入已經(jīng)裝好的硅膠柱中，分別用體積比為10：1、10：2、10：3的氯仿-甲醇液沖洗，同時用注射液小瓶回收洗液并做好編號記錄（因過柱速

20、度太慢，用氣泵加壓提速）。制備薄層色譜板若干（小板用于測試，大板用于最后分離。），對回收洗液用毛細管點板測試，并觀察點板，發(fā)現(xiàn)7-39號分離效果比較明顯，將7-39號洗液混合在30攝氏度的溫度下減壓蒸餾至粉末。用甲醇溶液溶解粉末，將溶解液點薄層色譜板（60ml羥甲基纖維素鈉和20g硅膠粉鋪板）共點4塊該類板。放入層析缸中待層析好后在紫外分光光度計下查看斑點，并用鉛筆勾出斑點范圍，然后用小刀將圈好的部位削下，裝進柱中用甲醇溶液沖洗；最后進行氫譜、碳譜分析推斷其結(jié)構(gòu)。2.4結(jié)構(gòu)鑒定核磁共振譜是有機化合物結(jié)構(gòu)解析中最為有力的工具，特別是近十年發(fā)展起來的具有高分辨能力的超導(dǎo)核磁分析技術(shù)，不斷提高了圖譜

21、質(zhì)量。故我們選擇核磁共振譜對分離物進行結(jié)構(gòu)推測，其核磁共振氫譜、核磁共振碳譜圖見附圖。經(jīng)觀察化合物為一白色無定形粉末，TLC色譜：在254nm下有熒光熄滅暗斑，硫酸乙醇顯色后顯黑色。由13C-NMR的化學(xué)位移數(shù)據(jù)可知該物質(zhì)可能有一個甲基碳（20.596），三個sp3次甲基碳（29.890，43.519，49.000），一個sp3亞甲基碳（45.462），一個甲氧基碳（51.979），一個非糖端基半縮醛碳（51.979），四個sp2碳（215.814，168.814，153.816，105.452）。同時13C-NMR圖譜給出了一組六碳單糖基信號峰（97.077，78.367，77.930，74

22、.636，71.554，62.727）。于上初步分析1H和13C-NMR的數(shù)據(jù)表明該白色無定形粉末分子結(jié)構(gòu)由環(huán)烯醚萜苷元和一個六碳糖基兩部分組成。其次看其1H-NMR化學(xué)位移值，最左邊化學(xué)位移值為7.46796、7.46521說明該化合物可能含有一個雙鍵的碳氫-CH=C-和環(huán)烯芳烴結(jié)構(gòu)；最右邊化學(xué)位移值為0.96522在1左右波動說明其可能有CH3質(zhì)子信號；化學(xué)位移值在2.02792到2.56500說明其可能含有CH2質(zhì)子信號；中間化學(xué)位移值在3.20109到3.90319較多，說明可能含有糖基，甲氧基；化學(xué)位移值在4.65417到4.89754和化學(xué)位移值在5.23063到5.24835說明

23、其可能有-CHO-O-基團，證實初步分析正確。從核磁共振氫譜圖，可知從左到右峰的積分高度比約為1:1:1:7:6:4:4，由于峰面積正比于質(zhì)子的數(shù)目，所以可以判斷其質(zhì)子數(shù)可能為24。核磁共振碳譜圖中共有碳棒17根，判斷該化合物有17個碳；其化學(xué)位移值從左到右依次為215.814、168.814、153.816、105.452、100.554、97.077、78.367、77.930、74.636、71.554、62.727、51.979、49.000、45.462、43.519、29.890、20.596，分別于馬鞭草苷的C6、C11、C3、C4、C1、C1*、C5*、C3*、C2*、C4*、

24、C6*、OMe、C5、C7、C9、C8、C10的化學(xué)位移值相近，并且氫質(zhì)子也得到完全歸屬，總結(jié)上述說論再參考文獻確定其為馬鞭草苷。分子式為C17H24O10，結(jié)構(gòu)式為：2.5小結(jié)通過本次探究性實驗使我們徹底的了解了目前馬鞭草化學(xué)成分國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及其藥理作用；建立了馬鞭草水溶性成分的提取分離方法；學(xué)會了用波譜分析對未知物進行結(jié)構(gòu)推斷；并提取了一個化合物-馬鞭草苷，達到了預(yù)期目標。雖然不是首次從馬鞭草中提取分離，但對馬鞭草化學(xué)成分的研究具有借鑒作用，我們以后還會嘗試用不同的方法去探究馬鞭草的化學(xué)成分，以期發(fā)現(xiàn)新物質(zhì)，新的活性成分。參考文獻：1田箐,趙毅明，欒新慧.馬鞭草化學(xué)成分的研究J.中國中藥雜志，2005,30(4)：2682劉宏民，鮑峰玉，閻學(xué)斌. 馬鞭草化學(xué)成分的研究J.中草藥，2002，33（6）：4923金偉軍，張志東.馬鞭草研究進展J.時珍國醫(yī)國學(xué)，2007,18(3)：14徐昌芬，盧小東，焦中秀，等馬鞭草抗早孕作用機理的初步研究南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1998,18：402-4065中國藥典委員會.中國藥典，部S.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，20