1、免疫電泳技術(shù)免疫電泳技術(shù)免疫電泳技術(shù)n是將電泳與免疫擴(kuò)散相結(jié)合的一種常是將電泳與免疫擴(kuò)散相結(jié)合的一種常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法 。沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 是是可溶性抗原可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合所出現(xiàn)的當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合所出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象沉淀現(xiàn)象。分類分類液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)絮狀沉淀試驗(yàn)絮狀沉淀試驗(yàn)環(huán)狀沉淀試驗(yàn)環(huán)狀沉淀試驗(yàn)免疫濁度測(cè)定免疫濁度測(cè)定凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀試驗(yàn)免疫擴(kuò)散免疫擴(kuò)散免疫電泳免疫電泳單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)火箭免疫電泳火箭免疫電泳對(duì)流免疫電泳對(duì)流免疫電泳沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)火箭免疫電泳n

2、是將單向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合的一種定是將單向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合的一種定量檢測(cè)技術(shù)。量檢測(cè)技術(shù)。n定量的抗原加入到含有一定量的相應(yīng)抗體定量的抗原加入到含有一定量的相應(yīng)抗體的瓊脂糖凝膠中，在電場(chǎng)的作用下，引起的瓊脂糖凝膠中，在電場(chǎng)的作用下，引起抗原抗體的遷移和相互反應(yīng)，當(dāng)抗原與抗抗原抗體的遷移和相互反應(yīng)，當(dāng)抗原與抗體分子達(dá)到適當(dāng)比例時(shí)，形成一個(gè)形狀如體分子達(dá)到適當(dāng)比例時(shí)，形成一個(gè)形狀如火箭的不溶性免疫復(fù)合物沉淀峰，峰的高火箭的不溶性免疫復(fù)合物沉淀峰，峰的高度與待撿樣中的抗原濃度呈正相關(guān)。度與待撿樣中的抗原濃度呈正相關(guān)。 應(yīng)用n當(dāng)瓊脂中抗體濃度固定時(shí)，以不同稀釋度當(dāng)瓊脂中抗體濃度固定時(shí)，以不同稀釋

3、度標(biāo)準(zhǔn)抗原泳動(dòng)后形成的沉淀峰為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)抗原泳動(dòng)后形成的沉淀峰為縱坐標(biāo)，抗原濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)抗原濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的沉淀峰長(zhǎng)度即可計(jì)算出待測(cè)抗原的樣品的沉淀峰長(zhǎng)度即可計(jì)算出待測(cè)抗原的含量；反之，當(dāng)瓊脂中抗原濃度固定時(shí)，含量；反之，當(dāng)瓊脂中抗原濃度固定時(shí)，便可測(cè)定待測(cè)抗體的含量便可測(cè)定待測(cè)抗體的含量( (即反向火箭免疫即反向火箭免疫電泳電泳) )。 對(duì)流免疫電泳n將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的一種將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)。技術(shù)。 n此法操作簡(jiǎn)便，僅需此法操作簡(jiǎn)便，僅需30306060分鐘，靈分鐘，靈敏度比雙向擴(kuò)散高敏度比雙向擴(kuò)散高10101515倍；

4、但缺點(diǎn)倍；但缺點(diǎn)是特異性不如雙向瓊脂擴(kuò)散高。是特異性不如雙向瓊脂擴(kuò)散高。 實(shí)驗(yàn)原理n實(shí)質(zhì)上是定向加速的雙向免疫擴(kuò)散技術(shù)。實(shí)質(zhì)上是定向加速的雙向免疫擴(kuò)散技術(shù)。n在在pH8.6pH8.6的緩沖液中，蛋白質(zhì)抗原帶負(fù)電荷的緩沖液中，蛋白質(zhì)抗原帶負(fù)電荷向正極泳動(dòng)；而抗體大部分屬于向正極泳動(dòng)；而抗體大部分屬于IgIg，由于，由于分子量大，暴露的極性基團(tuán)較少，在離子分子量大，暴露的極性基團(tuán)較少，在離子瓊脂中泳動(dòng)緩慢，同時(shí)受電滲作用的影響瓊脂中泳動(dòng)緩慢，同時(shí)受電滲作用的影響向負(fù)極泳動(dòng)，在抗原抗體相遇的最適比例向負(fù)極泳動(dòng)，在抗原抗體相遇的最適比例處形成乳白色沉淀線。處形成乳白色沉淀線。n電滲是指在電場(chǎng)中液體對(duì)于

5、一個(gè)固定固體電滲是指在電場(chǎng)中液體對(duì)于一個(gè)固定固體的相對(duì)移動(dòng)。瓊脂是一種酸性物質(zhì)，在堿的相對(duì)移動(dòng)。瓊脂是一種酸性物質(zhì)，在堿性溶液中帶負(fù)電荷，而與它接觸的溶液帶性溶液中帶負(fù)電荷，而與它接觸的溶液帶正電荷，因此液體向負(fù)極泳動(dòng)，產(chǎn)生電滲正電荷，因此液體向負(fù)極泳動(dòng)，產(chǎn)生電滲 A：Ag、Ab濃度及擴(kuò)散率近似；濃度及擴(kuò)散率近似；B：Ag、Ab濃度近似，擴(kuò)散率濃度近似，擴(kuò)散率Ag Ab ；C：Ag、Ab濃度近似，擴(kuò)散率濃度近似，擴(kuò)散率Ag Ab ；D：擴(kuò)散率近似，濃度：擴(kuò)散率近似，濃度Ag Ab ；E：濃度：濃度Ag Ab，擴(kuò)散率，擴(kuò)散率Ag Ab ；F：濃度：濃度Ag Ab，擴(kuò)散率，擴(kuò)散率Ag Ab材料和試

6、劑材料和試劑 1 1、AFPAFP診斷血清：診斷血清：2 2、肝癌病人血清：（陽(yáng)性對(duì)照）、肝癌病人血清：（陽(yáng)性對(duì)照）3 3、待檢血清：人血清、待檢血清：人血清 4 4、陰性對(duì)照血清：正常人血清、陰性對(duì)照血清：正常人血清 5 5、pH8.6pH8.6、離子強(qiáng)度、離子強(qiáng)度0.05M0.05M巴比妥緩沖液巴比妥緩沖液6 6、離子瓊脂：用巴比妥緩沖液配制。、離子瓊脂：用巴比妥緩沖液配制。7 7、電泳儀、電泳儀 8 8、其他：打孔器、移液器，槍頭、其他：打孔器、移液器，槍頭操作步驟n瓊脂糖凝膠板的制備瓊脂糖凝膠板的制備n打孔、加樣打孔、加樣n電泳電泳n結(jié)果觀察結(jié)果觀察n影響結(jié)果的因素影響結(jié)果的因素 制板

7、、加樣、打孔制板、加樣、打孔n用吸管吸取用吸管吸取4ml4ml加熱溶化的瓊脂鋪在載玻片加熱溶化的瓊脂鋪在載玻片上上, ,待凝。待凝。n打孔打孔: :用打孔器在瓊脂板上打孔用打孔器在瓊脂板上打孔( (孔距孔距4mm),4mm),如圖。如圖。n加樣加樣: :將待測(cè)抗原樣品約將待測(cè)抗原樣品約10ul10ul加在陰極側(cè)孔加在陰極側(cè)孔內(nèi)內(nèi), ,抗血清加在陽(yáng)極側(cè)抗血清加在陽(yáng)極側(cè), ,加樣時(shí)應(yīng)加滿小孔加樣時(shí)應(yīng)加滿小孔但不能溢出但不能溢出AbAgAbAb：甲胎蛋白診斷血清：甲胎蛋白診斷血清AgAg：1 1、肝癌病人血清（陽(yáng)性對(duì)照）、肝癌病人血清（陽(yáng)性對(duì)照） 2 2、正常人血清（、正常人血清（陰性對(duì)照陰性對(duì)照）

8、 3 3、待測(cè)血清、待測(cè)血清123電泳n將加好樣品的板置于電泳槽上，抗原孔置將加好樣品的板置于電泳槽上，抗原孔置負(fù)極端，抗體孔置正極端。瓊脂板兩端分負(fù)極端，抗體孔置正極端。瓊脂板兩端分別用四層紗布與別用四層紗布與0.05mol/L0.05mol/L、PH8.6PH8.6的緩沖的緩沖液相連，接通電源。電流以玻片的寬度計(jì)液相連，接通電源。電流以玻片的寬度計(jì)算，為算，為4mA/cm4mA/cm；電壓以玻片的長(zhǎng)度計(jì)算，；電壓以玻片的長(zhǎng)度計(jì)算，為為6V/cm6V/cm；通電；通電30-60min30-60min后，切斷電源，觀后，切斷電源，觀察結(jié)果察結(jié)果結(jié)果和討論結(jié)果和討論n將玻片對(duì)著光，先觀察將玻片對(duì)

9、著光，先觀察AFPAFP陽(yáng)性血清孔與抗陽(yáng)性血清孔與抗體孔之間的白色沉淀線，然后再觀察待檢體孔之間的白色沉淀線，然后再觀察待檢血清孔與抗體孔之間是否也有沉淀線出現(xiàn)，血清孔與抗體孔之間是否也有沉淀線出現(xiàn)，如有沉淀線，則表示如有沉淀線，則表示AFPAFP試驗(yàn)陽(yáng)性，否則試驗(yàn)陽(yáng)性，否則AFPAFP試驗(yàn)為陰性。如沉淀線不清晰，可把瓊試驗(yàn)為陰性。如沉淀線不清晰，可把瓊脂板放在濕盒中脂板放在濕盒中3737數(shù)小時(shí)或置電泳槽過(guò)數(shù)小時(shí)或置電泳槽過(guò)夜再觀察。夜再觀察。 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1. 1. 電泳時(shí)電流不宜過(guò)大，以免蛋白質(zhì)變性。電泳時(shí)電流不宜過(guò)大，以免蛋白質(zhì)變性。2. 2. 抗原、抗體的電極方向不能放反?？乖?、抗

10、體的電極方向不能放反。3. 3. 電泳所需時(shí)間與孔間距離有關(guān)，距離越大，電泳電泳所需時(shí)間與孔間距離有關(guān)，距離越大，電泳時(shí)間越長(zhǎng)。時(shí)間越長(zhǎng)。4.4.抗原抗體濃度的比例：當(dāng)抗原抗體比例不適合時(shí)，抗原抗體濃度的比例：當(dāng)抗原抗體比例不適合時(shí)，均不能出現(xiàn)明顯可見(jiàn)的沉淀線?？乖珴馓r(shí)均不能出現(xiàn)明顯可見(jiàn)的沉淀線?？乖珴馓r(shí)都不易出現(xiàn)沉淀線。所以除了應(yīng)用高效價(jià)的血清都不易出現(xiàn)沉淀線。所以除了應(yīng)用高效價(jià)的血清外，每份待測(cè)樣品均可做幾個(gè)不同的稀釋度來(lái)進(jìn)外，每份待測(cè)樣品均可做幾個(gè)不同的稀釋度來(lái)進(jìn)行檢查。行檢查。 甲胎蛋白檢測(cè)意義：甲胎蛋白檢測(cè)意義：n甲胎蛋白，簡(jiǎn)稱甲胎蛋白，簡(jiǎn)稱AFPAFP，是由胎兒肝細(xì)胞合

11、成、，是由胎兒肝細(xì)胞合成、在胎兒血清中正常存在的一種特殊蛋白。在胎兒血清中正常存在的一種特殊蛋白。一般在妊娠后開(kāi)始上升，至胎齡一般在妊娠后開(kāi)始上升，至胎齡16162020周周時(shí)達(dá)到最高峰，然后逐漸下降，至胎兒娩時(shí)達(dá)到最高峰，然后逐漸下降，至胎兒娩出后出后1-51-5周完全消失。周完全消失。n此外，原發(fā)性肝癌、急、慢性肝炎、肝硬此外，原發(fā)性肝癌、急、慢性肝炎、肝硬化也可升高。原發(fā)性肝癌患者，血清中化也可升高。原發(fā)性肝癌患者，血清中AFPAFP陽(yáng)性率常明顯升高，超過(guò)陽(yáng)性率常明顯升高，超過(guò)400400微克微克/ /升（放升（放射免疫定量法），甚至達(dá)射免疫定量法），甚至達(dá)10001000微克微克/ /升以上升以上或呈進(jìn)行性升高。或呈進(jìn)行性升高。AFPAFP的檢測(cè)不僅有助于原的檢測(cè)不僅有助