1、組織切片染色技術(shù)應(yīng)用學(xué)習(xí)目標(biāo)掌握：染色、常規(guī)染色的概念；HE染色的基本步驟。 熟悉：染色的目的、原理；常用染色術(shù)語；染色前后的處理；蘇木素-伊紅染色液的配制。 了解：染色的注意事項。 染色概述第一節(jié)一、染色的概念就是利用染料在組織切片上給予顏色，使其與組織或細(xì)胞內(nèi)的某種成分發(fā)生作用，經(jīng)過透明后通過光譜吸收和折射，使其各種微細(xì)結(jié)構(gòu)能顯現(xiàn)不同顏色，這樣在顯微鏡下就可顯示出組織細(xì)胞的各種成分。 染色是制片過程中的一個重要環(huán)節(jié) 二、染色的目的將染料配制成溶液將組織切片浸入染色劑內(nèi)經(jīng)一定的時間，組織或細(xì)胞及其他異常的成分被染上不同深淺的顏色對光產(chǎn)生不同的折射率便于在光鏡下觀察。 染色的物理作用(1）毛細(xì)

2、管作用及滲透作用染色劑與組織細(xì)胞沒有牢固的結(jié)合(2)吸收作用：又稱溶解學(xué)說。組織吸收染色劑，牢固的結(jié)合。組織的著色與溶液的顏色相同。三、染色原理(3)吸附作用 是固體物質(zhì)的特性，即較大的物體能從周圍溶液(染液)中吸附一些小顆粒(化合物或離子)到自身的特性。細(xì)胞中各種蛋白質(zhì)或膠體有不同的吸附面，因此能選擇性地吸收不同的離子，即某種蛋白質(zhì)對某種染色劑有吸附作用,而對別種染色劑無吸附作用，這就可以解釋鑒別染色現(xiàn)象。 三、染色原理 染色的化學(xué)作用染色劑按性質(zhì)可分為酸性、堿性和中性染色劑，而動、植物的細(xì)胞內(nèi)一般也可區(qū)分為酸性(陰離子)和堿性(陽離子)部分。當(dāng)堿性染色劑溶液中的有色部分成為陽離子時，就能與

3、細(xì)胞的陰離子(酸件部分)較牢固地結(jié)合，當(dāng)酸性染色劑溶液中的有色部分成為陰離子時，就能與細(xì)胞內(nèi)的陽離子(堿性部分)較牢固地結(jié)合。 三、染色原理 例如，細(xì)胞核（尤其是核內(nèi)的染色質(zhì)）主要由核酸組成，是酸性的組成成分，故和堿性染色劑(蘇木精)的親和力很強，易于著色。細(xì)胞質(zhì)含堿性物質(zhì)，故和酸性染色劑(伊紅)的親和力很大，易于著色。進行性染色和退行性染色 進行性染色：組織成分著色由淺至深，當(dāng)達(dá)到所需要的強度時，終止染色。此種方法無需“分化”，例如，卡紅染色。 退行性染色：是先把組織濃染過度，超過所需的程度，然后再用某些溶液脫去多余的染色劑，以達(dá)到適當(dāng)?shù)纳疃?，并使不?yīng)著色的組織細(xì)胞脫色。這個步驟稱為“分化”

4、。 三、染色原理直接染色，間接染色和媒染劑 直接染色：染色無需第三種物質(zhì)參加，染色劑和組織即可直接結(jié)合著色。 間接染色：單獨染料本身的水溶液或酒精溶液，幾乎不能與組織細(xì)胞結(jié)合或結(jié)合的能力很弱，必須有第三種成分媒染劑參與，才能使染色劑與組織細(xì)胞有效地結(jié)合起來。媒染劑：通常是雙價或三價金屬如鋁、鐵的硫酸鹽或氧化物。媒染劑在染色中起著架橋作用，既能與染料結(jié)合又能與組織相結(jié)合，達(dá)到了促進染色的效果。 三、染色原理促染劑 用以加強染料和組織細(xì)胞結(jié)合能力的物質(zhì)稱為促染劑促染劑如化學(xué)反應(yīng)中的催化劑，少量存在就有明顯的促染作用。它們的作用機制也許是降低表面張力或是改變了染液的pH值。 三、染色原理分化劑 在退

5、行性染色中，附在組織細(xì)胞上多余的染色劑需用某些特定的溶液把目的物以外的部分脫去，從而使目的物與周圍組織形成鮮明的對比，同時使目的物本身的色澤也深淺適當(dāng)。這種選擇性地除去多余染色劑的過程稱為“分化”，所使用的溶液即“分化劑”。有酸性分化劑 、氧化分化劑 、媒染分化劑 三、染色原理變色反應(yīng)和正色反應(yīng) 變色反應(yīng)：染色反應(yīng)最后目的物所呈現(xiàn)的顏色和染色劑當(dāng)初的顏色不同。如：黏液用甲苯胺藍(lán)可染成紅色，而其余組織則染成不同色調(diào)的藍(lán)色。正色反應(yīng)：染色反應(yīng)最后目的物所呈現(xiàn)的顏色和染色劑的顏色相同。如：酸性品紅總是將組織染成不同色調(diào)的紅色；淡綠染成不同色調(diào)的綠色。三、染色原理四、染色劑（一）染色劑染色的化學(xué)基礎(chǔ)染

6、色劑分子能夠顯示顏色的基因，稱為發(fā)色團。 主要的發(fā)色團有： N=N， N=O， C=O， C=C 偶氮基 亞硝基 羰基 烯基含有發(fā)色團的苯環(huán)化合物，稱為色原。 苯+發(fā)色團=色原染色劑分子中還需具備促使染色劑與組織細(xì)胞相結(jié)合的基因，這樣基因又稱為助色團。如NH2 COOH OH SO3H 氨基 羧基 羥基 磺酸基四、染色劑（二）染色劑的分類1按來源分 2按主要用途分 3按染色劑分子中的發(fā)色團分 4按染色劑的化學(xué)性質(zhì)分 四、染色劑1按來源分（1）天然染色劑：蘇木素、胭脂紅、地衣紅和番紅花。（2）合成染色劑：從煤焦油中提取的苯衍生物。無機化合物，如硝酸銀、氯化金、磺、鋨酸和高錳酸鉀等。四、染色劑2按

7、主要用途分（1）胞核染色劑：蘇木素、胭脂紅、甲苯胺藍(lán)、美藍(lán)和孔雀綠等。（2）胞質(zhì)染色劑：伊紅、淡綠、橘黃G、酸性品紅和苦味酸等。（3）脂質(zhì)染色劑：蘇丹、蘇丹、蘇丹黑、硫酸尼羅藍(lán)和油紅等。四、染色劑3按染色劑分子中的發(fā)色團分（1）亞硝基類：發(fā)色團為亞硝基（-NO)，如萘酚緣-B。（2）硝基染料：發(fā)色團是硝基（-NO2），如苦味酸。（3）偶氮類：發(fā)色團為偶氮基（-N=N-），屬于這一類的染色劑 有橘黃G、剛果紅、俾士麥棕和許多蘇丹類的脂質(zhì)染色劑。（4）醌亞胺類：含有兩個發(fā)色團，一個是印胺基（-N=）、一個是醌型苯環(huán)，如硫堇、美藍(lán)、甲苯胺藍(lán)O、硫酸尼羅藍(lán)、中性紅和堿性藏紅花O、焦油紫等。（5）苯甲烷

8、染料：發(fā)色團是醌型苯環(huán)，如孔雀緣、淺綠、堿性品紅、酸性品紅、結(jié)晶紫和甲基緣等。（6）山叮染料：發(fā)色團是醌型苯環(huán)，如派羅寧和伊紅Y等。（7）蒽醌染料：此類染色劑含有色原蒽醌，如茜素和胭脂蟲酸。（8）噻唑類（9）喹啉類使用極少 四、染色劑4按染色劑的化學(xué)性質(zhì)分（1）酸性染色劑： 色原-助色團-Na色原-助色團+Na+。常用的如伊紅、酸性品紅、苦味酸、橘黃G、剛果紅、水溶性苯胺藍(lán)和淡綠等酸性染料常用以染細(xì)胞質(zhì)等堿性成份。（2）堿性染色劑： 色原-助色團-Cl色原-助色團+Cl。常用的如蘇木素、卡紅、次甲基藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、硫堇和美藍(lán)等堿性染料常用以染細(xì)胞核等酸性成份。五、常用染色術(shù)語 1普通染色在組織制

9、片技術(shù)中，常規(guī)制片最廣泛應(yīng)用的是蘇木精和伊紅染色，又稱為常規(guī)染色（HE染色）。2特殊染色特殊染色就是為了顯示特定的組織結(jié)構(gòu)或其他的特殊成分，是常規(guī)染色的必要補充，也是染色技術(shù)中不可缺少的部分。它在病理診斷中起到輔助作用。3單一染色選用一種染料進行的染色，如用鐵蘇木素染睪丸生精細(xì)胞等。4復(fù)染色用兩種不同性質(zhì)的染料進行染色的方法，如用蘇木素和伊紅分別使細(xì)胞核及胞質(zhì)染成兩種顏色。5多種染色選用兩種以上的染料的染色，如Mosson三色染色法。六、染色前后處理 （一）染色前處理1脫蠟至水 二甲苯10min，37二甲苯10min，37無水乙醇 2min 無水乙醇 2min 95乙醇 2min 85乙醇 2

10、min 75乙醇 2min 流水沖洗六、染色前后處理2除去汞鹽沉淀物 對于用升汞固定或含有升汞混合固定液的切片，切片脫臘后需脫汞（浸入5%碘酒精10min），脫碘（5%硫代硫酸鈉）流水洗染色。 六、染色前后處理3脫甲醛色素 （1）濃氨水1ml，75%乙醇200ml。切片脫蠟后置溶液中30min或較久流水洗染色。（2）1%氫氧化鉀1ml，80%乙醇100ml。切片脫蠟后置溶液中10min流水洗5min80%乙醇5min蒸餾水洗染色。 六、染色前后處理4除鉻沉著物 組織用含鉻的Zenker氏液等固定的，有鉻沉淀物。除鉻沉著物可應(yīng)用鹽酸乙醇溶液，或用5%碘酒和5%硫代硫酸鈉水溶液處理。 六、染色前后

11、處理（二）染色后的處理 1脫水 95%乙醇、各5min100%乙醇、各5min。2透明 二甲苯、各5min透明。3封固 通常用中性樹膠或加拿大樹膠加蓋玻片封固。 七、染色的注意事項 1切片脫蠟應(yīng)徹底。 2常規(guī)染色、特殊染色等，組織要進行固定處理，做酶反應(yīng)的組織固定更應(yīng)嚴(yán)格。凡用含升汞固定液固定的組織，切片脫蠟后，應(yīng)經(jīng)脫汞處理，同時要慎防切片脫落。3各種染料試劑一般選用化學(xué)純。各種染料啟用新品時應(yīng)先試染。配成的染液、試液應(yīng)盛于有色試劑瓶內(nèi)，瓶簽應(yīng)寫明名稱、含量、配制年月日，順序保存于避光櫥中，必要者放冰箱內(nèi)。凡須臨用時配制者，配量應(yīng)適當(dāng)。 4染色各步驟所需的時間，常受溫度、切片厚度等影響，可根據(jù)

12、鏡下觀察所見酌情予以調(diào)整。5染色過程中，勿使切片干燥。染色完畢后用顯微鏡檢查染色結(jié)果是否符合要求，并核對標(biāo)本種類、號碼、數(shù)量是否無誤。常規(guī)染色第二節(jié)一、常規(guī)染色的概念 在組織制片技術(shù)中，常規(guī)制片最廣泛應(yīng)用的是蘇木精和伊紅染色，稱為常規(guī)染色（HE染色），又稱普通染色。 二、蘇木素-伊紅染色液的配制 （一）蘇木素染液的配制方法常用的有： 1.哈瑞氏（harris）蘇木素染液最常應(yīng)用染色時間為5min10min配制 蒸餾水 1000ml 蘇木素 3g5g 碘酸鈉 1g 鉀明礬 50g80g 水醋酸 20ml其優(yōu)點是：配后即可應(yīng)用染色力較強。其缺點是：極易產(chǎn)生金屬膜沉淀。二、蘇木素-伊紅染色液的配制2

13、.埃利希（Ehrlich），蘇木素染液 配制 無水乙醇 100ml 甘油 100ml 蘇木精 2g 鉀明礬 2g3g 醋酸 5ml10ml置于陽光下自然氧化3個月左右成熟。其優(yōu)點是： 染色結(jié)果甚佳，貯存愈久染色愈強，而且不需分色。二、蘇木素-伊紅染色液的配制（二）分化液 1鹽酸酒精，是最常用的分化液。 配方：70酒精 99ml 濃鹽酸 1ml二、蘇木素-伊紅染色液的配制（三）還原液 1氫氧化氨液： 配方：濃氨水 1ml 蒸餾水 99ml 2飽和碳酸鋰液： 配制：碳酸鋰 1g 蒸餾水（冷） 78ml 3流水沖洗還原。二、蘇木素-伊紅染色液的配制（四）伊紅染液 配方：伊紅Y（水溶） 0.5glg

14、蒸餾水 99ml 若取用伊紅Y（醇溶性）應(yīng)溶于99ml 75或95的乙醇中。 若在伊紅液中加入0.5毫升冰醋酸，可加速其染色過程，并使胞質(zhì)的色澤更為艷麗。三、染色方法蘇木精伊 紅嗜堿性結(jié)構(gòu)：細(xì)胞核粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)游離核糖體等嗜酸性結(jié)構(gòu)：細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)溶酶體、線粒體等細(xì)胞器膠原纖維等常規(guī)脫蠟蘇木素染色（5-15min），水洗鹽酸乙醇溶液分化（30s），水洗伊紅染色（1-3min），水洗氨水反藍(lán)（30s），水洗90%乙醇（5min）80%乙醇（30s）100%乙醇（2次10min）二甲苯（3次5min）封片染色脫水透明封片脫蠟 染色的時間，應(yīng)根據(jù)室溫，及組織的具體情況來確定，做之前做預(yù)實驗。 在染色后，重新進入酒精和二甲苯，最后用中性樹膠封片，以便長期保存。* 切片: 固定梯度酒精上行二甲苯石蠟。* 染色: 石蠟二甲苯梯度酒精下行水。* 保存: 水梯度酒精二甲苯中性樹膠。* 蘇木素是堿性染料，藍(lán)紫色，可以使細(xì)胞核等著色。被蘇木素著色的結(jié)構(gòu)本身為酸性，具有嗜堿性。* 伊紅是酸性染料，粉紅色?？梢詫⒋蠖鄶?shù)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染成紅色。被伊紅著色的結(jié)構(gòu)本身為堿性，具