1、T4DNALigase使用說(shuō)明書TaKaRaCode：D2011A包裝：T4DNALigase(350U/pl)25,000Units10XT4DNALigaseBuffer1ml保存：-209制品說(shuō)明本酶催化相鄰DNA鏈的5-P末端和3-OH末端以磷酸二酯鍵結(jié)合的反應(yīng)，需ATP作輔酶。本酶不僅可以催化粘性末端之間或平滑末端之間的DNA的連接，也可以催化DNA與RNA之間以及少數(shù)RNA之間的連接。酶貯存溶液Tris-HCl(pH7.5)10mMKCl50mMDTT1mMEDTA0.1mMGlycerol50%起源：Escherichiacolicarryingtheplasmidthatena

2、blehighlyexpressionofT4DNALigasegene?；钚远x在20卩1的連接反應(yīng)體系中，6pg的入DNA-HindIII的分解物在16C下反應(yīng)30分鐘時(shí)，有90%以上的DNA片段被連接所需要的酶量定義為1個(gè)活性單位(U)。本酶的1U相當(dāng)于ATP-PPi交換反應(yīng)中0.008WeissUnit。純度2,000U的本酶和1pg的入-HindIII片段在37C下反應(yīng)16小時(shí)，DNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。2,000U的本酶和1pg的SupercoiledpBR322DNA在37C下反應(yīng)16小時(shí)，DNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。2,000U的本酶和1pg的16S，23SrRNA在37C下

3、反應(yīng)16小時(shí)，RNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。用途DNA片段和載體DNA的連接。DNA片段和Linker或AdaptorDNA的連接。使用注意連接反應(yīng)因末端堿基順序的不同而反應(yīng)速度各異，一般有下列傾向突出末端：HindIIIPstIEcoRIBamHISalI平滑末端：HaeIIIAluIHincIISmaIEcoRVScaIPvuIINruI其中連接HindIII末端的速度約為連接SalI末端速度的1040倍;而連接HaeIII末端的速度約為連接SmaI末端速度的510倍。添附Buffer組成(保存：-20C)10XT4DNALigaseBufferTris-HCl(pH7.6)660mMMgC

4、l266mMDTT100mMATP1mM*Buffer在融解時(shí)，如果出現(xiàn)少量沉淀屬正常現(xiàn)象，請(qǐng)于37C保溫溶解后使用。使用例DNA片段和載體DNA的連接1.在微量離心管中制備下列連接反應(yīng)液。10XT4DNALigaseBuffer2.5p!DNA片段*約0.3pmol載體DNA*約0.03pmolT4DNALigase1pldH2Oupto25pl*DNA片段的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體DNA摩爾數(shù)的310倍。*平滑末端的載體與DNA片段進(jìn)行連接時(shí)，應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化處理，以防止其自身環(huán)化。169過(guò)夜反應(yīng)。加入2.5pl(1/10量)的3MCH3COONa(pH5.2)。加入62.5pl(2.5倍量)的冷無(wú)水乙醇，-209放置3060分鐘。離