1、第5章糖基磷脂酰肌醇化蛋白及有關(guān)糖復(fù)合物還記得脂筏嗎？膜蛋白的引渡船脂筏的組成成分脂筏（lipid raft）是質(zhì)膜上富含鞘糖脂、GPI蛋白和膽固醇的微結(jié)構(gòu)域（microdomain）。蛋白質(zhì)與膜表面的結(jié)合方式1,2：整合蛋白3,4： 錨定蛋白5,6： 外周蛋白糖基磷脂酰肌醇化蛋白一類由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖鏈三者共價(jià)結(jié)合的復(fù)雜的糖復(fù)合物糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)化蛋白。GPI蛋白的分布1985年以錐蟲表面抗原為例闡明其結(jié)構(gòu)GPI蛋白廣泛存在于真核生物，包括原生動(dòng)物、酵母、粘菌、無(wú)脊椎動(dòng)物等以及哺乳動(dòng)物的血液、肝、腎、胎盤和腦等組織。目前已發(fā)

2、現(xiàn)近百種GPI蛋白，包括多種水解酶、細(xì)胞粘附分子、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面抗原和受體、原蟲抗原、補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白、朊病毒等。GPI化蛋白的種類和分布舉例補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白類粘附分子類酶類許多細(xì)胞和非造血細(xì)胞反應(yīng)性溶血膜抑制物(CD59)許多細(xì)胞和非造血細(xì)胞衰變加速因子（CD55, DAF)神經(jīng)細(xì)胞 、膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)粘附因子許多造血細(xì)胞CD58 (LFA-3)哺乳動(dòng)物組織5-核苷酸酶人及羊紅細(xì)胞、電鰻電器管乙酰膽堿酯酶胎盤、腸等哺乳動(dòng)物組織堿性磷酸酶GPI化蛋白的基本結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)：C末端殘基與GPI錨相連，通常為Gly、Ala、Ser、Cys、Asp、Asn。有些本身是糖蛋白。磷酸乙醇胺橋糖鏈: 接在肌醇磷酸的6位共

3、有的四糖結(jié)構(gòu)：Man-Man-Man-GlcN肌醇磷酸插入脂雙層內(nèi)的長(zhǎng)脂肪鏈：脂酰甘油或甘油醚；極個(gè)別被神經(jīng)酰胺取代。GPI錨GPI化蛋白的結(jié)構(gòu)要點(diǎn)結(jié)構(gòu)組成脂肪鏈與甘油的連接方式糖鏈的修飾變化糖鏈與肽鏈的連接極個(gè)別脂酰甘油被Ceramide代替其它GPI有關(guān)糖復(fù)合物存在于一些寄生性原蟲表面：脂肽磷酸聚糖 (LPPG)糖肌醇磷酸聚糖 (GIPL)脂磷酸聚糖 (LPG)糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)三種致命的原蟲布氏錐蟲（ Trypanosoma brucei ）引起的非洲昏睡病在撒哈拉以南的非洲地區(qū)每年感染萬(wàn)人，如果得不到及時(shí)治療，往往會(huì)“殺人于昏睡之中”?？菔襄F蟲（Trypanos

4、oma cruzi）引起南美錐蟲病，它由錐蝽叮咬人后排泄的糞便傳播，在拉美地區(qū)每年導(dǎo)致萬(wàn)人死亡。碩大利什曼原蟲（Leishmania major）引起的黑熱病蔓延大洲、多個(gè)國(guó)家，是公共衛(wèi)生的嚴(yán)重威脅。 錐蟲(Trypanosomes)和昏睡癥(Sleeping Sickness )非洲昏睡病錐蟲寄生之謎錐蟲本身對(duì)抗體和補(bǔ)體高度敏感它們卻生活在布滿免疫細(xì)胞的血液系統(tǒng)它們可引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)然而他們可以在同一宿主體內(nèi)繁殖生活一年或更長(zhǎng)，直至宿主死亡the GPI anchorGPI錨的加工是在翻譯后立即添加的蛋白質(zhì)的C端疏水區(qū)作為信號(hào)肽，可被切除然后以轉(zhuǎn)肽反應(yīng)被糖脂取代，形成GPI化蛋白錐蟲表面的

5、抗原變化GPI錨可在錐蟲表面形成高度密集的排列錐蟲表面于是形成由可變表面糖蛋白（Variant Surface Glycoproteins, VSGs）組成的致密外殼這種外殼與利氏曼原蟲表面的脂磷（酸）聚糖 相當(dāng)錐蟲的基因組與VSG錐蟲為單細(xì)胞真核生物，其染色體為二倍體。布氏錐蟲含有100個(gè)小染色體和20個(gè)較大染色體，編碼VSG的基因在各種染色體上都有。錐蟲基因組中的6-10%編碼VSGs (more than 1000 genes)根據(jù)在染色體上的位置分為內(nèi)部VSG基因和端粒VSG基因，VSG基因的表達(dá)總是在端粒的表達(dá)位點(diǎn)（Expression site, ES）上進(jìn)行。表達(dá)位點(diǎn)有多個(gè)，但一

6、定時(shí)期只激活一個(gè)。在特定時(shí)期只有一種VSG基因表達(dá)，而其他999種都被關(guān)閉VSG基因表達(dá)的轉(zhuǎn)換以很低幾率發(fā)生，如果宿主產(chǎn)生了對(duì)前一種VSG的抗體，則新的表達(dá)型就會(huì)迅速擴(kuò)增起來(lái)What is the advantage of expressing a single VSG?How is expression controlled?What mechanisms can you think of by which a cell could control gene expression and protein abundance?Antigenic variation所有的VSGs都是65 kDa

7、的 GPI蛋白，在細(xì)胞表面呈二聚體蛋白的外端高度可變，但Cys的位置保守其他非可變蛋白如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體隱藏在表面外殼內(nèi)部Antigenic variation錐蟲基因組中有1000個(gè)基因編碼表面抗原但每個(gè)特定時(shí)期只有一個(gè)VSG基因被表達(dá)啟動(dòng)子調(diào)節(jié)？基因的位置？其他機(jī)制？轉(zhuǎn)座效應(yīng)Transposition of VSG genes occurs by intra- or intermolecular recombinationThis explains switching but not really why one gene is active and all the others

8、are silent堿基的稀有修飾染色質(zhì)修飾調(diào)控基因表達(dá)實(shí)際上發(fā)現(xiàn)失活和激活部位的一種特殊修飾（標(biāo)記為J (b-glucosyl-hydroxy-methyluracil)有差異But is this a chicken or an egg?GPI抗原的“漂移”？在非洲錐蟲病病人的紅細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)了錐蟲的一種GPI蛋白表面抗原！GPI錨介導(dǎo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞表面轉(zhuǎn)移細(xì)胞表面工程許多細(xì)菌、寄生蟲毒性蛋白也是GPI蛋白，可把毒素轉(zhuǎn)移給宿主細(xì)胞。如何抑制？GPI化蛋白的生物合成核糖體合成新生肽鏈內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔N-端去除1530aa信號(hào)肽C-端去除1530個(gè)aa肌醇磷酸GPI錨GPI化蛋白細(xì)胞質(zhì)逐個(gè)添加糖基磷酸乙醇

9、胺運(yùn)往質(zhì)膜表面Biosynthetic pathway of GPI-anchorProteolytic cleavage at w siteAddition of preformed GPI anchor at C-terminus through an amide linkageto the ethanolamine of the GPI anchorProtein can be released by action of cell surface phospholipaseGPI = glycosylphosphatidylinositol: lipid modification tha

10、t anchors proteins to the cell surfaceGPI化標(biāo)記GPI化蛋白運(yùn)送到質(zhì)膜表面的方式小窩蛋白GPI化蛋白的降解磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIP2) PLCIP3DAGPKCCa2+GPI蛋白PLCDAGGPI化蛋白的生物功能免疫及神經(jīng)細(xì)胞活化：T細(xì)胞活化神經(jīng)細(xì)胞表面的N-CAM和CNTF受體與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：脂筏作為受體葉酸受體墨素轉(zhuǎn)鐵蛋白(melanotransferrin)GPI蛋白錨定的優(yōu)勢(shì)可能賦予膜蛋白的較大的橫向運(yùn)動(dòng)性通過激活脂酶介導(dǎo)蛋白質(zhì)的釋放和分泌靶向膜蛋白使其定位于細(xì)胞表面特定的區(qū)域通過內(nèi)吞作用調(diào)節(jié)細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)參與受體介導(dǎo)的傳遞跨膜信號(hào)GPI

11、錨定蛋白的鑒定水解細(xì)胞膜表面蛋白的GPI錨細(xì)菌中提取的PI-PLC錐蟲中的GPI-PLC血清中GPI-PLD氫氟酸稀亞硝酸Western blot鑒定GPI裂解位點(diǎn)Enzymatic and chemical cleavage sites of GPI anchors useful in identifying GPI- anchored membrane proteins. (GPI-PLC) GPI-specific phospholipase C; (GPI-PLD) GPI-specific phospholipase D; (HF) hydrogen fluoride; (HONO)

12、 nitrous acid; (NaOH NH3) mild alkali treatment with either sodium hydroxide or ammonia; (PI-PLC) phosphatidylinositol-specific phospholipase C.GPI化蛋白與疾病和藥物設(shè)計(jì)陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿癥 (PNH)GPI化蛋白與細(xì)胞表面工程GPI化蛋白與抗感染藥物設(shè)計(jì)通過抑制GPI錨結(jié)合蛋白從膜上釋放而抑制病原毒素向宿主的轉(zhuǎn)移GPI蛋白與細(xì)胞表面工程體外GPI化蛋白可從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞表面細(xì)胞表面工程的步驟：把目的蛋白cDNA與GPI結(jié)合必需的C-端肽

13、cDNA融合表達(dá)，即可形成新的GPI化蛋白。提取蛋白質(zhì)與靶細(xì)胞保溫，GPI蛋白即可自動(dòng)組裝到靶細(xì)胞上。細(xì)胞表面工程的優(yōu)點(diǎn)制備較大量的GPI化蛋白可在一些難以基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面表達(dá)目的蛋白可對(duì)細(xì)胞表面蛋白進(jìn)行修飾多種GPI蛋白可以同時(shí)結(jié)合在一個(gè)細(xì)胞表面陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿癥 (PNH)Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) ：成人發(fā)病率1/105106。是一種獲得性溶血性貧血，其病因是細(xì)胞膜上缺失十幾種GPI化蛋白，如作為補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的衰變加速因子(DAF)和補(bǔ)體C8的結(jié)合蛋白等，使紅細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體敏感性增加而產(chǎn)生紅細(xì)胞溶血。缺陷在于GPI生物合成的第一步

14、，即GlcNAc向磷酸肌醇轉(zhuǎn)移這一步，相關(guān)的基因是磷脂酰肌醇聚糖A(phosphatidylinositolglycan class A, PIG-A)基因。Haemoglobinuria: Urine passed 7am is dark containing a large amount of free haemoglobin which leaks out of PNH red-cells as they burst. The urine generally clears during the day.PNH患者的血尿癥狀PNH機(jī)制PNH的治療骨髓移植補(bǔ)體抑制劑：Alexion制藥公司(Cheshire, CN, USA)獲得了美國(guó)食品藥品管理局 (FDA)批準(zhǔn)使用Soliris (eculizumab)治療PNH患者以