1、PCR技術及其應用生物化學實驗技術1目 錄PCR的反應原理PCR的類型和應用PCR示例2 多聚酶鏈式反應（PCR：Polymerase Chain Reaction) Kary B. Mullis PCR是由美國科學家穆利斯提出的一種體外簡化條件下模擬DNA體內(nèi)復制的DNA快速擴增的方法，此技術獲得1993年諾貝爾化學獎。3體內(nèi)DNA的復制體系DNA聚合酶（I II III）拓撲異構酶解旋酶類SSB 引物dNTP Mg2+5 34Mullis的PCR構思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段5Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性(%)溫度()40 50 60

2、 70 80 90 100100 80 60 40 20耐熱DNA聚合酶Saiki（1988）將耐熱DNA聚合酶引入PCR，使利用熱變性解鏈DNA模板可行。6PCR反應循環(huán)729455PCR循環(huán)變性退火延伸7 PCR的指數(shù)擴增（2n）引物延伸延伸5533變性、退火變性、退火變性、退火延伸8TaqP1P2PCR反應體系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1 +P2DNA聚合酶：TaqE原料：dNTP反應緩沖液10 xBuffer輔助因子：Mg2+91）PCR反應成分（1）模板 單、雙鏈DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類。 DNA模板

3、一般100ng /100L。 模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。 PCR反應條件10（2）引物濃度 0.1-0.5 mol/L 濃度過高易導致模板與引物錯配,反應特異性下降。（3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產(chǎn)量。11（4）dNTP（10mM or 2.5mM ） 含四種核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP dNTP濃度取決于擴增片段的長度 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應產(chǎn)量 dNTP可與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。12（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激

4、活劑。濃度為0.5-2.5mmol/L。 Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應特異性。 Mg2+可與負離子結合,所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。132）循環(huán)參數(shù)變性 使雙鏈DNA解鏈為單鏈 94， 30-60秒(2) 退火 溫度由引物長度和GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結合;降低溫度可增加反應的靈敏性。14引物設計：（1)序列應位于高度保守區(qū),與非擴增區(qū)無同源 序列。（2）引物長度以15-40 bp為宜。（3）堿基盡可能隨機分布,G+C占40-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結構。（5）兩引物間

5、避免有互補序列。（6）引物3端為關鍵堿基；5端無嚴格限制。15（3）延伸 70-75,一般為72 延伸時間由擴增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版DNA的濃度 一般為25-35次 次數(shù)過多：擴增效率降低 錯誤摻入率增加16 PCR的應用 1、特定DNA片段（基因、調(diào)控序列）的鑒定、分離或制備。 A、DNA B、cDNA 2、基因表達分析（原位、離體） A、基因是否表達 B、基因表達水平高低 3、基因突變17基因克?。ǎ┠孓D錄酶聚合酶mRNAcDNA雜交雙鏈PCR擴增181. 細胞或組織固定：細胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進入2. PCR擴增細胞內(nèi)

6、目的片段3. 原位雜交檢測擴增產(chǎn)物A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達原位分析基因表達的組織特異性19熒光定量 PCR（real-time PCR)分析基因表達水平 通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤,實時在線監(jiān)控反應過程,結合相應的軟件可以對結果進行分析,計算待測樣品的初始模板量。內(nèi)摻式染料SYBR Green I序列特異性探針Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)引物特異性探針 Amplifluor (Intergen)205353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Gree

7、n I 21反向PCR (reverse PCR) 擴增已知序列兩側的未知序列 用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段，對某個已知DNA片段兩側的未知序列進行擴增。 未知序列未知序列已知序列22已知序列未知序列未知序列限制酶連接酶23 實時熒光定量PCR儀梯度PCR儀普通PCR儀24251、材料：含0.3Kb插入片段的克隆載體2、儀器：微量移液器及吸頭、PCR儀及PCR管 瓊脂糖凝膠電泳設備3、試劑：10XPCR反應緩沖液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mol/L 引物1和引物2二、實驗材料、儀器和試劑261.反應體系（50l體系）： 10 X PCR反應

8、緩沖液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mol/L 引物1 10mol/L引物2 模板DNA TaqE 補充水 三、操作步驟10 X B10 X P1 P210 X T10 X E 272.按照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑 并混勻： 三、操作步驟10 X Buffer 2.5 L10 X P1 2.5 L10X T 2.5 L10 X E 2.5 L25 L水 12.5 L10 X P2 2.5 L283.PCR擴增程序： 94 5-10min（預變性） 94 30S 55 30S 72 30S 72 5-10min（后延伸） 4 保溫30Cycles29

9、屏幕顯示方式30MainRun Enter List Edit File Lid運行已有程序已有程序菜單刪除已有程序新建反應程序編輯已有程序熱蓋關閉調(diào)節(jié)31EnterEnter abcdefghi# jklmnopqr# Name #stuvwxyz#In Use! .,-+/():=#Enter PCR1Control MethodBLOCK Sim-Tube輸入文件名,滿8個字符自動生成程序名,不滿8個字符時用#終止BLOCK:屏幕顯示樣品臺溫度(樣品臺溫控方式)Sim-Tube:屏幕顯示反應液溫度(模擬管溫控方式)Enter PCR1Segment #1 Hold Cycle END選擇

10、預變性保溫32循環(huán)內(nèi)第一步溫度和時間Enter PCR1Hold at 94CHold for 5m0s預變性溫度和時間Enter PCR1Segment #2Hold Cycle END 3 step PCR循環(huán)參數(shù)設置Step #194.0C Hold 0m30s循環(huán)內(nèi)步驟數(shù)33Step #1Option？ No yes不需要拓展功能Step #255.0C Hold 0m40s循環(huán)內(nèi)第二步溫度和時間Step #2Option？ No yes不需要拓展功能Step #372.0C Hold 0m30s循環(huán)內(nèi)第三步溫度和時間34不需要拓展功能設置循環(huán)數(shù)后延伸保溫后延伸溫度和時間Step #3

11、Option？ No yesTotal Cycle= 35Segment #3Hold Cycle ENDHold at 72.0CHold for 10m0s35Segment #4Hold Cycle END選擇反應完后保溫Hold at 4.0CHold for 99m0s設置反應完后的保溫溫度和時間Segment #5Hold Cycle END終止參數(shù)設置Enter PCR1Estimated Run Time：1h53m05sSave？ YES no預計反應時間，程序是否保存36LidLIDTurn off heatedLid below 9C當溫度低于9度時，熱蓋自動關閉37RunPCR1