1、微生物發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)環(huán)境與生物工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心1實(shí)驗(yàn)六、機(jī)械攪拌罐培養(yǎng)大腸桿菌 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)材料四、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、注意事項(xiàng) 七、思考題2 1、學(xué)會(huì)發(fā)酵參數(shù)的設(shè)置。 2、掌握發(fā)酵液參數(shù)的測定方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 微生物在發(fā)酵培養(yǎng)的過程中其體系參數(shù)會(huì)發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)通過使用機(jī)械攪拌罐發(fā)酵培養(yǎng)大腸桿菌后測定其發(fā)酵液的菌體量、葡萄糖濃度、pH值。 采用分光光度計(jì)法在波長620nm下測定其濁度進(jìn)行菌體量分析；利用pH計(jì)測定其pH值；葡萄糖濃度的測定采用3,5-二硝基水楊酸比色定糖法，其原理為 3，5一二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，棕紅色物

2、質(zhì)顏色的深淺程度與還原糖的量成正比。二、實(shí)驗(yàn)原理4三、實(shí)驗(yàn)材料1. 菌種：大腸桿菌。2.培養(yǎng)基： 種子活化培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L ；蛋白胨10g/L ； 氯化鈉5g/L ；pH7.0-7.2。 發(fā)酵培養(yǎng)基：6g/LNa2HPO4，3g/LKH2PO4，0.5g/L NaCl，1g/LNH4Cl，0.5g/LMgSO47H2O，0.011g/L CaCl2 ，10g/L葡萄糖, pH 7.0 。 3.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和3，5-二硝基水楊酸試劑。 5四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）種子培養(yǎng) 用接種環(huán)從保存斜面中接一環(huán)至盛有種子活化培養(yǎng)基的三角瓶中，37振蕩培養(yǎng)。（二）大腸桿菌的培養(yǎng) 調(diào)小氣量，燃燒酒精，旋松接種口

3、蓋，在火焰保護(hù)下，打開接種口蓋，倒入種子，旋緊接種口蓋子。開始發(fā)酵，發(fā)酵條件為35、300r/min。每隔2小時(shí)取樣。6（三）取樣 每次取樣時(shí)將管口先流出的10ml培養(yǎng)液作為廢液，取隨后流出的20ml。（四）發(fā)酵結(jié)束處理 剩余菌液進(jìn)行滅菌處理，排放到指定地點(diǎn)，進(jìn)行罐的清洗。 四、實(shí)驗(yàn)步驟7（五）取樣分析 1.取樣菌體量的分析：測定620nm濁度。 2.葡萄糖濃度的測定：3,5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS法） （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取九支試管，編號(hào)，按下表加入各種試劑。將各管快速搖動(dòng)混勻，在沸水浴中加熱 5min,取出后立即用水冷卻到室溫，再向每支試管中加入21.5ml蒸餾水,搖勻,于520

4、nm波長測A值,以葡萄糖mg數(shù)為橫坐標(biāo),光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 四、實(shí)驗(yàn)步驟8 （2）樣品測定 取離心的上清夜稀釋，取1ml于試管中，加蒸餾水1ml，加3,5-二硝基水楊酸試劑1.5ml，加完試劑后同以上操作，測定吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡萄糖的含量，計(jì)算培養(yǎng)基中葡萄糖的量。項(xiàng)目0123456781mg/ml溶液(ml)00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖量(mg)00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸餾水(ml)2.01.81.61.41.21.00.80.60.43,5-二硝基水楊酸試劑(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5 3. pH值的測定 將不同時(shí)段取樣離心的上清夜用pH計(jì)進(jìn)行測量,觀察發(fā)酵過程中pH值的變化,并以時(shí)間為橫坐標(biāo),相應(yīng)pH值為縱坐標(biāo)作圖。9 (1) 以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體數(shù)量，濁度，葡萄糖濃度，pH為縱坐標(biāo)作圖，觀察各參數(shù)的變化。 (2)計(jì)算最大比生長速率和葡萄糖的比消耗速率。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果10 1.機(jī)械攪拌罐培養(yǎng)大腸桿菌接種和取樣過程中應(yīng)注意避免造成污染和正確使用設(shè)備。 2.注意正