1、第六章 一般毒性作用（General Toxicity of Xenobiotics ）汪春充參考書周宗燦，付立杰主編.現(xiàn)代毒理學簡明教程.軍事醫(yī)學科學出版社，2012卡薩瑞特 道爾著.毒理學基礎周宗燦主編.毒理學教程（第3版）.北京大學醫(yī)學出版社，2006All substances are poisons , there is none which is not a poison. The right dose differentiates a poison and remedy.No substance is a poison by itself. It is

2、 the dose that makes a substance a poison. Paracelsus(1473-1548) 歐洲醫(yī)生，醫(yī)藥化學運動的始祖所有物質(zhì)都是毒物，沒有不是毒物的物質(zhì)，唯有劑量使之區(qū)分為毒物還是藥物 物質(zhì)本身不是毒物，主要是劑量才使一個物質(zhì)變成毒物毒性評價或安全性評價的基本目的受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)劑量反應（效應）研究確定毒作用的靶器官確定損傷的可逆性其它：敏感檢測指標和生物學標志、毒作用機制、毒物動力學、中毒的解救措施毒性試驗的設計不是為了證明化學品的安全性，而是為了表征化學品可能產(chǎn)生的毒作用。第一節(jié) 概述（毒理學實驗基礎）描述毒理學是以動物中毒模型（model

3、）模擬/預測人中毒原型（prototype），實驗動物體內(nèi)實驗是常規(guī)試驗。gy外推 A.人是最敏感的物種B. 人和實驗動物的生物學過程包括化學物的代謝與體重（或體表面積）相關。以單位體表面積計算在人產(chǎn)生毒作用的劑量和實驗動物相近，以體重計算則人通常比實驗動物敏感，差別可達10倍。如果某一化學物對幾個物種實驗動物的毒性是相同的，則人的反應也可能是相似的毒理學研究方法體內(nèi)試驗體外試驗人體觀察流行病學研究動物實驗人群調(diào)查以實驗動物為模型，最終目的是通過外源化學物對實驗動物的毒性反應，向人(原型)外推，以期評估外源化學物對人的危害及危險性。篩選和預測急性毒性和機制研究進一步深化和證實在動物實驗中所得到

4、的資料動物實驗整體動物實驗（in vivo）體外試驗（in vitro）一般毒性試 驗特殊毒性試 驗微 生 物試 驗哺乳動物試 驗急性毒性重復劑量毒性亞慢性毒性慢性毒性致突變致癌致畸致突變器官水平組織水平細胞水平亞細胞水平分子水平實驗動物單次、多次或長期染毒所產(chǎn)生的綜合毒性效應以動物實驗為中心，動物實驗的設計、實施、結(jié)果觀察和評價是毒理學研究 的基本功 毒理學研究方法的優(yōu)缺點 研究方法流行病學研究 受控的臨床研究 毒理學體內(nèi)試驗 毒理學體外試驗 優(yōu)點 真實的暴露條件在各化學物之間發(fā)生相互作用測定在人群的作用表示全部的人敏感性 規(guī)定的限定暴露條件在人群中測定反應對某組人群(如哮喘)的研究是有力的

5、能測定效應的強度 易于控制暴露條件能測定多種效應能評價宿主特征的作用(如：性別、年齡、遺傳特征等和其他調(diào)控因素飲食等)能評價機制 影響因素少，易于控制可進行某些深入的研究(如：機制，代謝)人力物力花費較少 缺點耗資、耗時多(多為回顧性)，無健康保護難以確定暴露，有混雜暴露問題可檢測的危險性增加必需達到2倍以上測定指標較粗(發(fā)病率，死亡率) 耗資多較低濃度和較短時間的暴露限于較少量的人群限于暫時、微小、可逆的效應一般不適于研究最敏感的人群動物暴露與人暴露相關的不確定性受控的飼養(yǎng)條件與人的實際情況不一致暴露的濃度和時間的模式顯著地不同于人群的暴露 動物實驗中可觀察到體征，而沒有“癥狀”不能全面反映

6、毒作用，不能作為毒性評價和危險性評價的最后依據(jù)難以觀察慢性毒作用 Lumley(1990)/Igarashi(1994)根據(jù)有限的臨床資料報告對人的毒性約一半不能由臨床前（動物）毒性研究預測。Heywood（1983）報告27個化學物（多為藥物）的靶器官毒性在大鼠和狗（或猴）之間的相符率僅20%。Olson等（1998）報告131種化學物對動物的毒性與人的毒性的相符率，嚙齒類6%，非嚙齒類28%，合并達36%，所有物種相符率可達69%。按照目前的廣泛進行毒理學安全性評價，可在一定程度上提高新藥和各種化學品的使用安全性，但仍不能完全排除對人健康危害的風險WHO在臨床前藥物安全性實驗原則的文件中指

7、出：雖然事先對生物活性物質(zhì)進行了最仔細徹底的研究，但給人使用時總是不可能避免地要冒一定的風險 基本假設為：人是最敏感的動物物種；人和實驗動物的生物學過程包括化學物的代謝，與體重(或體表面積)相關。這兩個假設也是全部實驗生物學和醫(yī)學的前提。以單位體表面積計算在人產(chǎn)生毒作用的劑量和實驗動物通常相近似。而以體重計算則人通常比實驗動物敏感，差別可能達10倍。 2. 實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對人潛在危害的必需的和可靠的方法。 描述毒理學實驗的基本原則1.化學物在實驗動物產(chǎn)生的作用可以外推于人 此原則是根據(jù)質(zhì)反應的概念，隨劑量或暴露增加，群體中效應發(fā)生率增加。 選用成年的健康(雄性和雌性未孕)實

8、驗動物是為了使實驗結(jié)果具有代表性和可重復性。以成年健康實驗動物作為一般人群的代表性實驗模型，而將幼年和老年動物、妊娠的雌性動物、疾病狀態(tài)作為特殊情況另作研究。這樣可降低實驗對象的多樣性，減少實驗誤差。3. 成年的健康(雄性和雌性末孕)實驗動物 和人可能的暴露途徑是基本的選擇 外源化學物以不同途徑染毒，實驗動物表現(xiàn)的毒性可有很大差異 。因此，毒理學試驗中染毒途徑的選擇，應盡可能模擬人接觸該受試物的方式。毒理學實驗的局限性（不確定性） WH0在臨床前藥物安全性實驗原則文件中指出“雖然事先對生物活性物質(zhì)進行了最仔細徹底的研究，但給人使用時總是不可避免地要冒一定的風險。”這就是利用動物實驗的局限性。1

9、、實驗動物結(jié)果外推到人的不確定性。 實驗動物和人對外源化學物的反應敏感性不同，有時甚至存在著質(zhì)的差別。 2、高劑量結(jié)果向低劑量外推的不定期性。4、小數(shù)量實驗動物結(jié)果外推大數(shù)量人群的不確定性。毒理學實驗所用動物數(shù)量有限，那些發(fā)生率很低的毒性反應，在少量動物中難以發(fā)現(xiàn)。 5、一般人群結(jié)果外推易感人群的不確定性3、異質(zhì)性小的群體外推異質(zhì)性大的不定期性。6、不同暴露方式（途徑、期限、頻率）的結(jié)果的外推不確定性1統(tǒng)計原則隨機：代表性對照：鑒別處理因素與非處理因素的差異及處理因素效應大小，消除和減少隨機化原則所不能控制的抽樣誤差及實驗者操作熟練程度等造成的差異 空白/陰/陽性對照，自身對照，歷史性對照重復

10、：樣本量、重復次數(shù)實驗設計過程應遵循基本原則 2動物選擇原則首先考慮代謝與毒性效應上與人一致注重對受試物毒性敏感的動物物種種屬、品系、個體差異自然壽命不太長、易于飼養(yǎng)和實驗操作、經(jīng)濟易獲得動物年齡、性別毒理學實驗設計基本原則沒有一種實驗動物完全符合物種選擇的原則，目前常規(guī)選擇2個物種：嚙齒類+非嚙齒類急性毒性試驗：大鼠、小鼠、狗亞慢性、慢性：大鼠、狗皮膚刺激試驗和致敏試驗：兔、豚鼠眼刺激試驗：兔遺傳毒理學試驗：小鼠致畸試驗：大鼠、小鼠、兔致癌試驗：大鼠、小鼠遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗：母雞為什么常選大、小鼠呢？ 因為它的毒性反應與人較為一致，而且繁殖快、易飼養(yǎng)、價格便宜且易獲取。使用實驗動物來推論于人

11、必須慎而慎之。因為動物的反應敏感性一般不及人。曾有報導發(fā)現(xiàn)有138種化合物人對之反應比大鼠更為敏感。人與大鼠對不同化合物的急性毒性敏感比值 化合物種類化合物數(shù)目敏感比值*無機化合物404.20.66有機磷化合物161.90.46有機氯化合物201.80.30藥物6210.55.80*以大鼠為1，人：大鼠另外，由于不同種屬動物其生理狀況不一，在做實驗時要根據(jù)實驗需要注意：嚙齒類動物：無嘔吐反應貓、狗：嘔吐反射靈敏，可用于研究引發(fā)嘔吐的實驗兔、豚鼠：多用于經(jīng)皮膚接觸的毒作用研究。猴：用于一些特殊的實驗。實驗中小動物至少應為清潔動物及以上級別，國際上SPF動物已成為毒理學實驗的標準實驗動物。實驗動物

12、微生物等級標準 等級 要 求級普通動物(CV)應沒有傳染給人的疾病級清潔動物(CL)除級標準外，種系清楚，沒有該動物特有的疾病級無特定病原體動物(SPF)除級標準外，動物為剖腹產(chǎn)或子宮切除產(chǎn)、按純系要求繁殖，在隔離器內(nèi)或?qū)恿魇覂?nèi)飼養(yǎng)，可有不致病細菌叢，沒有致病病原體級無菌動物(GF)在全封閉無菌條件下飼養(yǎng)的純系動物，動物體外不帶有任何微生物和寄生蟲(包括絕大部分病毒)3劑量分組原則實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對人潛在危害的必需和可靠的辦法。 除對照組外，一般設3個或3個以上劑量組，以觀察劑量-反應(效應)關系，確定受試化學物引起的毒效應及其毒性參數(shù)。 高劑量組：應出現(xiàn)明確的有害作用，或高

13、劑量組已達到極限劑量或染毒的最大劑量低劑量組：應不出現(xiàn)任何可觀察到的有害作用（即相當于NOAEL），但應當高于人可能的接觸劑量，至少等于人可能的接觸劑量中劑量組：介于高低劑量組之間，應出現(xiàn)較輕的毒性效應（相當于LOAEL）三組劑量一般按等比例計算，低劑量組一般為高劑量組的1/10-1/204試驗期限一般由毒性實驗的定義決定： 急性毒性：一次或1d內(nèi)多次觀察14d 亞慢性毒性：持續(xù)至實驗動物壽命的10%（大/小鼠90d，狗1年） 某些試驗（如致畸和多代生殖試驗）由受試實驗動物物種或品系決定。 5給受試物途徑盡可能利用人擬用途徑 吸收速率：靜脈注射吸入腹腔注射經(jīng)口經(jīng)皮質(zhì)量控制優(yōu)良實驗室規(guī)范（goo

14、d laboratory practice，GLP） ：嚴格控制可能影響實驗結(jié)果準確性的各種主客觀因素，降低試驗誤差，確保實驗結(jié)果的真實性 實驗操作規(guī)程、試劑/動物選擇、儀器使用、實驗環(huán)境 安全性評價的最終產(chǎn)品并沒有實體，而是數(shù)據(jù)。因此，難以通過檢查最終產(chǎn)品來保證其質(zhì)量，只有通過保證有關安全性試驗的計劃、實施等所有的因素和過程的可靠性才能保證最終產(chǎn)品的可靠性毒理學實驗結(jié)果評價統(tǒng)計學意義生物學意義毒理學意義統(tǒng)計分析是否具有統(tǒng)計學意義是否具有生物學意義，即是否是真實的效應是否具有毒理學意義，即是否是有害效應有統(tǒng)計學意義無生物學意義有統(tǒng)計學意義有生物學意義無統(tǒng)計學意義無生物學意義無統(tǒng)計學意義有生物學

15、意義 I IIIV III毒理學實驗結(jié)果評價統(tǒng)計學意義生物學意義毒理學意義在判斷生物學意義時應先考慮： 劑量依賴性趨勢 結(jié)果的重現(xiàn)性 相關指標結(jié)果的一致性 差別的大小和類型 兩種性別的一致性一般毒性外來化學物在一定劑量、一定接觸時間和接觸方式下對試驗動物產(chǎn)生的綜合毒效應，即基礎毒性特殊毒性：致癌、致畸、致突變 生殖發(fā)育毒性污染物理化特性了解毒性大小和特征了解在體內(nèi)蓄積和耐受了解對機體毒作用靶點和指標確定閾和閾下劑量急性毒性試驗亞急性毒性試驗亞慢性毒性試驗慢性毒性試驗一般毒性試驗外源化學物對全身各系統(tǒng)的毒性效應全身各系統(tǒng)對外源化學物的毒性反應目的要求掌握一般毒性作用的概念、試驗目的熟悉一般毒性試

16、驗方法要點熟悉蓄積毒作用概念了解蓄積毒作用研究方法第二節(jié) 急性毒性作用acute toxicity 機體一次或24h內(nèi)多次接觸外源化學物后在短期內(nèi)（最長14天）所產(chǎn)生的毒性效應，包括一般行為和外觀改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應一、急性毒性的概念急性毒性（acute toxicity）急性毒性的概念需要注意急性接觸的次數(shù) 一次:經(jīng)口、注射； 呼吸道、皮膚(一段時間) 24h多次（不超過3次）中毒效應出現(xiàn)的時間 不能僅以接觸毒物后毒性癥狀出現(xiàn)的時間，主要以接觸毒物的時間，觀察時間：714天強度 一次性大劑量，中毒癥狀明顯，常發(fā)生死亡二、急性毒性試驗的目的求出致死劑量及其他急性毒性參數(shù)觀察中毒表現(xiàn)、

17、毒作用強度和死亡情況，初步評價毒物的毒效應特征、靶器官、劑量-反應（效應）關系 等為其他毒理試驗提供接觸劑量和選擇觀察指標的依據(jù)為毒理學機制研究提供線索 急性毒性的參數(shù)半數(shù)致死劑量：LD50GB15193.3-2003食品安全性毒理學評價程序和方法的急性毒性分級標準毒性分級大鼠經(jīng)口LD50(mg/kg)相當人（70kg）的致死量mg/kg（g/人）6級，極毒5級，劇毒 4級，中等毒3級，低毒 2級，實際無毒1級，無毒15000稍嘗 （0.05）5004000 （0.5）400030000 （5）30000250000（50）25000050000（500）500000 （2500）急性毒性危害

18、類別和急性毒性估計值（GHS） （WHO-全球化學品統(tǒng)一分類和標簽制度）接觸途徑第1類第2類第3類第4類第5類經(jīng)口（mg/kg體重）5503002000經(jīng)皮（mg/kg體重）50200100020005000氣體（ppm，V）10050025005000蒸氣（mg/L）0.52.01020粉塵與煙霧（mg/L）0.050.51.05急性毒性的參數(shù)劑量-反應曲線ED,TD：ED50, TD50, （1）霍恩法（Horn）（2）改進寇氏法（3）Bliss法 最大似然性法（maximum likelihood method），最精確的計算方法LD50的幾種計算方法（1）霍恩法（Horn）： （劑量遞

19、增法/平均移動法） 劑量對數(shù)與死亡率（反應率）的轉(zhuǎn)換數(shù)（概率單位）呈直線關系。簡單、精確度不夠！4個劑量組，每組動物數(shù)相等（4-5只），劑量按等比級排列一般為2個參考染毒系列：劑量組距為2.15倍或3.16倍根據(jù)每組動物數(shù)、組距、每組動物死亡數(shù)，查表求出受試物LD50、 95%CILD50的幾種計算方法（2）改進寇氏法（Karber法/平均致死劑量法）利用劑量對數(shù)與死亡率呈S型曲線而設計的方法該法計算簡便，準確率高，較為常用要求：每組動物數(shù)相同、至少5個實驗組、各劑量組組距呈等比級數(shù)、死亡率呈正態(tài)分布、最低劑量組死亡率80。lgLD50及其95可信限為1.35211.960.02131.352

20、10.0417LD50及95可信區(qū)間范圍為22.50mgkg(20.4424.76mgkg) （1）霍恩法（Horn）（2）改進寇氏法（3）Bliss法 最大似然性法（maximum likelihood method），最精確的計算方法LD50的幾種計算方法三、急性毒性試驗方法的要點經(jīng)典急性毒性試驗：死亡急性毒性替代試驗固定劑量法急性毒性分級法上-下移動法（階梯法）限量試驗經(jīng)典急性致死（LD50）試驗設計流程總體原則經(jīng)典急性毒性試驗實驗動物染毒途徑染毒劑量觀察周期觀察指標的選擇、計算方法和評價 急性毒性反應與人近似 易于飼養(yǎng)、操作方便 繁殖力較強，數(shù)量較大 價格較低，易于獲得（一）實驗動物的

21、選擇和要求主要原則除特殊需要外，首選哺乳動物實驗動物的物種和品系 嚙齒類（rodent species） 非嚙齒類（nonrodent species） 小鼠：昆明種、NIH、ICR 大鼠：Sprague-Dawley（SD）、Wistar 犬或猴 為了有利于預測化合物對人的危害，要求選擇兩種以上的實驗動物，最好一種為嚙齒類，一種為非嚙齒類，分別求出其急性毒性參數(shù)。根據(jù)接觸途徑選擇實驗動物 急性經(jīng)口和吸入毒性試驗大鼠、小鼠 急性經(jīng)皮毒性試驗成年大鼠、豚鼠、家兔實驗動物的物種和品系實驗動物的年齡和體重剛成年、健康、未曾交配和受孕的動物小動物根據(jù)體重同一次試驗相同性別實驗動物起始體重變異范圍不應超

22、過平均體重的20%實驗動物的生存年限與體重選擇動物種類生活年限（年）生殖年齡（月）初成年體重（克）急性實驗選擇體重（克）慢性實驗選擇體重（克）小白鼠1.5221518251518大白鼠22.52315010015050100豚 鼠683250200250150200家 兔493415001500200012001500貓10123410001500250010001500狗1520341200080001500040006000實驗動物的性別雌雄各半如雌、雄動物毒效應有明顯差異，應分別并求出雌性和雄性動物的LD50值特殊的試驗研究可僅作單一性別的急性毒性試驗實驗動物分組與數(shù)量根據(jù)組數(shù)和每組數(shù)量

23、來決定總數(shù)量LD50，一般為4-6組大、小鼠每組每性別至少5只，犬類3只嚴格遵循隨機、均衡的原則隨機性： 每只動物分散到各組去的機會均等，以避免成見或系統(tǒng)誤差均衡性： 各組動物的平均體重及體重的離散度盡可能一致 每只動物的體重不應超過全體實驗動物平均體重的20% 每組之間的平均體重相差不應超過10%控制離散度控制均衡性實驗動物的預檢給藥前檢疫觀察大、小鼠、兔、豚鼠1周，犬猴2-3周適應新環(huán)境，減少環(huán)境和生理條件變化可能對試驗結(jié)果的影響篩檢健康狀況不符合試驗要求的動物實驗動物的給藥前禁食處理經(jīng)口途徑染毒，實驗動物胃腸道內(nèi)食物存留量對化學毒物的毒性可產(chǎn)生較明顯的干擾 大、小鼠隔夜禁食，染毒2h后提

24、供飼料 經(jīng)口多次染毒可不禁食（二）受試物及處理理化特性水溶液、混懸液、油溶液水溶性受試物：蒸餾水、去離子水、生理鹽水，保持與體內(nèi)滲透壓一致（注射） 水不溶性受試物：溶于或懸浮于適當?shù)挠袡C溶劑中受試物一般應臨用前新配受試物成分和配方應穩(wěn)定不變適宜容積染毒毒性較大的受試物給藥量較小毒性較低的受試物常需較大量的染毒給藥容積根據(jù)染毒途徑和實驗動物 經(jīng)口：20ml/kg(空腹動物) 經(jīng)皮：2ml/kg 靜脈：1ml/kg(5min以上)受試物及處理(三) 染毒方法模擬實際接觸的途徑和方式受試物的性質(zhì)和用途受試物毒性評價程序的要求有利于不同化學物之間結(jié)果的比較工業(yè)毒物：經(jīng)呼吸道、皮膚農(nóng)用化學物：經(jīng)口、皮膚

25、、呼吸道藥品：經(jīng)口、注射、皮膚食品：經(jīng)口環(huán)境污染物：經(jīng)口、呼吸道、皮膚 染毒途徑染毒方法消化道、呼吸道、皮膚、注射 染毒途徑影響受試物急性毒性 染毒方法不同途徑的吸收量和吸收速率吸收速率：靜脈注射呼吸道肌肉注射腹腔注射皮下注射消化道皮內(nèi)注射經(jīng)皮同一受試物不同染毒途徑LD50的大小通常符合上述規(guī)律經(jīng)口（胃腸道）染毒LD50值來比較不同化學物急性毒性大小灌胃：溶液或混懸液，以注射器經(jīng)導管注入胃內(nèi)，等容量灌胃法吞咽膠囊：將受試物裝入膠囊中，放至舌后部，迫使動物咽下。犬、猴喂飼：將受試物摻入動物飼料或飲水中供實驗動物自行攝入染毒方法空腹灌胃后23h復食灌胃的體積不超過體重的1%-2% 小鼠0.2-1.

26、0ml/只，0.1-0.5ml/10g 大鼠5ml/只，0.5-1.5ml/100g 家兔10ml/2kg， 狗3006.0301.0家兔20002400100.0大鼠1001993.025003500150.0200249453500200.02503006.0貓2500300050803008.03000100150狗1000015000200500灌胃法灌胃法是用灌胃器將所應投給動物的藥灌到動物胃內(nèi)。小鼠的灌胃針長約45cm，直徑為1mm，大鼠的灌胃針長約68cm，直徑約1.2mm。灌胃針的尖端焊有一小圓金屬球，金屬球為中空的。焊金屬球的目的是防止針頭刺入氣管或損傷消化道。針頭金屬球端彎

27、曲成20左右的角度，以適應口腔、食道的生理彎曲度走向染毒方法鼠類的灌胃法：用左手固定鼠，右手持灌胃器，將灌胃針從鼠的口腔插入，壓迫鼠的頭部，使口腔與食道成一直線,將灌胃針沿咽后壁慢慢插入食道，可感到輕微的阻力,此時可略改變一下灌胃針方向，以刺激引起吞咽動作，順勢將藥液注入。一般灌胃針插入小鼠深度為34cm，大鼠或豚鼠為46cm。靜式吸入染毒動式吸入染毒經(jīng)呼吸道染毒 氣管內(nèi)注入染毒方法 吸入染毒靜式吸入染毒染毒方法方法：一定體積的密閉容器，加入易揮發(fā)的液態(tài)或氣態(tài)受試物染毒柜體積、動物數(shù)、時間，依據(jù)實驗動物最低需氣量計算優(yōu)點：簡單、方便、受試物消耗少，適合于小鼠缺點：氧氣減少，濃度不穩(wěn)定，經(jīng)皮吸收

28、，不適合稍大動物，揮發(fā)性不強的受試物用此法受限 實驗動物的最低需氣量及不同染毒柜容積放置動物數(shù)（染毒2h）實驗動物呼吸量最低需氧量定式染毒2h可放動物數(shù)(L/h)(L/h)25L50L100L300L1000L小鼠1.454.503561012153640120150大鼠10.1830.54011 2561618豚鼠10.1830.54011 2561618貓19.3057.9000034910家兔42.25126.80000145猴51.60154.80000134狗312.6097.8000001動式吸入染毒 將實驗動物處于有空氣流動的染毒柜中，新鮮空氣不斷流入，污染空氣不斷流出。溫度、濕

29、度、氧及二氧化碳分壓相對恒定，并有隨時補充受試物，維持濃度穩(wěn)定?？刹蓸颖O(jiān)測受試物濃度，可持續(xù)接觸受試物，無時間限制 染毒方法動式吸入染毒裝置的組成染毒柜機械通風系統(tǒng)配氣系統(tǒng)染毒方法動式吸入染毒設備A 整體暴露 B 口鼻暴露動式吸入染毒優(yōu)缺點染毒方法優(yōu)點：受試物濃度和氧分壓比較穩(wěn)定缺點：設備要求高，消耗受試物量很大，操作比較復雜，費時費工經(jīng)皮膚染毒染毒方法農(nóng)藥、化妝品、工業(yè)、環(huán)境、外用藥物常用大鼠染毒方式：脫毛：化學或機械法脫毛（體表面積的10%）染毒：局部涂敷或大鼠、小鼠浸尾法 經(jīng)注射途徑染毒染毒方法注射藥品、機制研究、毒物代謝動力學分類： 幾種動物不同注射途徑注射量(ml)范圍注射途徑小鼠大

30、鼠豚鼠兔狗靜脈肌肉皮下腹腔0.20.50.10.20.10.50.21.01.02.00.20.50.51.01.03.01.05.00.20.50.51.02.05.03.0100.51.01.03.05.010.05.015.02.05.03.010.0（四） 劑量選擇參考新化學物的理化性質(zhì)參考相關資料先用少量動物，以較大的劑量間隔染毒，找出10%-90%（或0%-100%）的致死劑量范圍，然后設計正式實驗的劑量和分組根據(jù)試驗所選的LD50計算方法確定劑量組數(shù)預試一般每組4只動物，每次3組，以10倍為組距。根據(jù)第一次預試結(jié)果判定需要增加還是降低劑量，組距保持不變，直至粗略預測到LD100及

31、LD0為止。 各組劑量的計算i =（lgLD90-lgLD10）/（n-1）或 i =（lgLD100- lgLD0）/（n-1） i為組距，n為設計的劑量組數(shù)。以最低劑量值（LD0或LD10）的對數(shù)劑量加上一個i值，即是第二個劑量組的對數(shù)劑量，依次類推直至最高劑量組劑量選擇劑量選擇化學物LD50大于2g/kg 或5g/kg，表明毒性不大我國藥品的毒理研究指導原則規(guī)定要以最大容積最高濃度給予動物后未見死亡不必計算LD50全面觀察動物的各種反應和變化，仔細分析實驗動物在染毒后出現(xiàn)的中毒表現(xiàn)、劑量效應、時間分布。觀察記錄的內(nèi)容：中毒體征及發(fā)生過程 死亡情況和時間分布 體重 病理形態(tài)學變化（五） 毒

32、性作用觀察毒性作用觀察中毒體征及發(fā)生過程詳細觀察和記錄動物出現(xiàn)的中毒體征 發(fā)生時間 體征發(fā)展的經(jīng)過各個系統(tǒng)的特征初步確定急性毒性靶器官不同表現(xiàn)提供毒性機制的信息 續(xù)表6-1 嚙齒類動物急性中毒表現(xiàn) 毒性作用觀察死亡情況和時間分布實驗動物的死亡數(shù)對LD50值產(chǎn)生明顯影響分析中毒死亡時間的分布規(guī)律可以提供重要信息 ：原形，代謝體重毒性作用觀察反映動物中毒后綜合性整體變化，比較客觀簡便的量化指標應定期多次稱量動物的體重變化，一般為每周1次或2次對體重指標的變化要仔細觀察和分析 體重變化的原因毒性作用觀察影響食欲或消化系統(tǒng)的功能影響食物的吸收和利用影響水的攝取腎功能急性損傷毒性作用觀察病理檢查死亡動物

33、：大體病理變化，如臟器外觀、大小、色澤的變化，有無充血、出血、水腫或其他改變存活動物：觀察期結(jié)束時亦應進行解剖檢查，必要時做組織病理學檢查（六） 觀察時間和周期染毒以后應即刻開始觀察動物中毒表現(xiàn)和死亡情況給藥當天應連續(xù)或多次觀察，以后可根據(jù)情況，每天2次或多次觀察直至試驗周期結(jié)束觀察周期一般為14天LD50(LC50)計算時以觀察周期內(nèi)各組動物的總死亡數(shù)為依據(jù)不同化學物質(zhì)引起動物死亡的時間存在個體差異速殺型化學毒物僅計算24h的死亡率 觀察時間和周期急性毒性替代試驗-固定劑量法不以動物死亡作為觀察終點利用預先選定或固定的一系列劑量染毒，通過觀察化學物的毒性效應對該化學物進行毒性分級劑量：5、5

34、0、300mg/kg，最高限量2000mg/kg分級標準（歐共體）： 高 毒： LD502000mg/kg平均用大鼠14.8只，經(jīng)典方法平均用大鼠24.2只。OECD組織驗證：（11個國家的33個實驗室比較固定法和經(jīng)典法的結(jié)果）毒性分級：比較了30種化合物，根據(jù)歐共體急性口服毒性分級標準，一致性80.2%毒性反應：毒性反應類型、出現(xiàn)和持續(xù)時間等方面未見明顯差別所用動物數(shù)：經(jīng)典發(fā)平均用大鼠24.2只，固定劑量法平均用大鼠14.8法替代試驗-急性毒性分級法以死亡為終點的分階段試驗法，每階段3只動物，平均經(jīng)2-4階段，根據(jù)死亡動物數(shù)，判斷急性毒性。首選大鼠，從25、200、2000mg/kg體重3個

35、固定劑量中選擇一個劑量開始試驗，根據(jù)結(jié)果判斷：不需要進一步試驗進行分級；下一階段以相同劑量的另一種性別試驗；下一階段以較高或較低的劑量水平進行（從200mg/kg體重開始）。動物觀察14天，染毒當天觀察體征和死亡至少兩次，之后每日觀察一次。每周測體重，所有動物進行大體解剖，必要時進行組織病理學檢查。上下移動法（階梯法）以死亡為終點，也可用于觀察不同的終點。根據(jù)初步資料確定第一只動物接受化學物的劑量，由第一只動物染毒后的反應決定第二只動物的接受劑量，如死亡則下一個劑量降低，如存活則下一個劑量增高。該方法需要選擇一個比較合適的劑量范圍，使得大部分動物的所接受的化學物劑量在真正的平均致死劑量左右。方

36、法改進后，僅需要6-9只動物。 急性毒性試驗求出LD50(LC50)值，通過LD50值進行急性毒性分級(acute toxicity classification)，評價毒物的急性毒性強弱，比較毒物的急性毒性大小四、急性毒性分級和評價急性毒性分級和評價 外源化學物急性毒性分級(WHO,2003）GB15193.3-2003食品安全性毒理學評價程序和方法的急性毒性分級標準毒性分級大鼠經(jīng)口LD50(mg/kg)相當人（70kg）的致死量mg/kg（g/人）6級，極毒5級，劇毒 4級，中等毒3級，低毒 2級，實際無毒1級，無毒15000稍嘗 （0.05）5004000 （0.5）400030000

37、（5）30000250000（50）25000050000（500）500000 （2500）農(nóng)藥急性毒性分級標準（GB1567農(nóng)藥登記毒理學試驗方法）大鼠、兔、豚鼠大鼠大鼠急性毒性危害類別和急性毒性估計值（GHS） （WHO-全球化學品統(tǒng)一分類和標簽制度）接觸途徑第1類第2類第3類第4類第5類經(jīng)口（mg/kg體重）5503002000經(jīng)皮（mg/kg體重）50200100020005000氣體（ppm，V）10050025005000蒸氣（mg/L）0.52.01020粉塵與煙霧（mg/L）0.050.51.05LD50的局限性LD50的值不能等同于急性毒性，死亡僅僅是評價急性毒性的許多觀察

38、終點之一。化學物單次大劑量急性中毒，動物多死于神經(jīng)系統(tǒng)和心血管功能障礙，并不能很好地顯示毒作用的特征和靶器官LD50值不穩(wěn)定:OECD的80個實驗室測定5種化學物LD50，差別可達2.44-8.38倍物種差異對LD50影響大：16種化學藥品對人的致死劑量小于小鼠的1/10，甚至差別更大。不能期望使用動物急性毒性試驗結(jié)果來擬定人的臨床劑量急性毒性試驗程序受試物資料的采集：化學結(jié)構(gòu)式、理化性質(zhì)、純度等，或查閱文獻，搜集與之相近的化學物毒性資料。 實驗室的要求：GLP。實驗動物的選擇原則，年齡和體重等。實驗動物的分組的隨機性與均衡性。受試物劑量的分組確定。選定染毒途徑，符合人類實際接觸情況。中毒表現(xiàn)

39、的觀察，相關參數(shù)的計算。毒性分析。鑒定報告應包括如下內(nèi)容1.受試樣品名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度；2.實驗動物的種屬、品系和來源（注明合格證號和動物級別）;3.實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、動物實驗室合格證號； 4.所用染毒途徑、染毒濃度和動物分組，每組所用動物性別、數(shù)量及體重范圍；5.計算LD50/LC50的方法；6.染毒后動物中毒表現(xiàn)及出現(xiàn)時間和恢復情況、死亡時間、大體解剖所見；7.列表報告結(jié)果，計算的LD50/LC50及其95%可信區(qū)間；8.結(jié)論。 復習毒理學實驗設計的基本原則毒理學實驗中常用對照組的意義實驗動物選擇的原則和注意事項LD50的概念及毒理學意義第三節(jié)

40、 局部毒性試驗 (Local toxic effect) (Local irritant effect)機體暴露于化學物后，在其接觸和暴露部分造成的局部毒性損傷、刺激（如眼刺激、皮膚刺激）和（或）變態(tài)反應等農(nóng)藥、化妝品、消毒劑的常規(guī)項目刺激性、腐蝕性、致敏性家兔眼刺激性：眼球表面接觸受試物后產(chǎn)生的可逆性 炎性變化眼腐蝕性：眼球表面接觸受試物后產(chǎn)生的不可逆 性組織損傷一、眼刺激試驗Draize眼刺激試驗（標準方法）9只家兔，每只兔的一只眼睛滴入0.1 ml受試物。其中3只在滴人后2秒鐘用20 ml微溫水沖洗；3只在4秒后沖洗；3只不作沖洗。于滴入后24 h、48 h和72 h、4d和7d，以肉眼或手提式裂隙燈檢查眼的反應。記錄結(jié)膜（發(fā)紅、球結(jié)膜水腫和分泌物）、角膜（渾濁程度和范圍）和虹膜（充血、腫脹、對光反應）的反應程度和持續(xù)時間按規(guī)定分級標準進行評分，計算染毒后前4d最高總積分平均值