1、病毒標本采集和核酸檢測技術指南為指導各級醫(yī)療衛(wèi)生機構和其他相關機構規(guī)范開展肺炎標本 采集與實驗室檢測工作，確保檢測質(zhì)量，提高檢測效率，特 制定本指南。一、標本采集（一）采集對象。肺炎病例、可疑感染人員和其他需要進行檢測的人員，以及 可能被污染的環(huán)境或物品等。（二）采樣人員基本要求。從事標本采集的技術人員應當經(jīng)過生物安全和實驗室檢測技 術培訓，熟練掌握標本采集方法和操作流程，考核合格后方可上 崗。采樣時，應做好標本信息記錄，嚴格遵守操作流程，確保標 本質(zhì)量符合要求、標本及相關信息可追溯。（三）標本采集基本要求。.住院病例的標本由所在醫(yī)院的醫(yī)護人員采集，密切接觸者標 本由當?shù)刂付ǖ募部貦C構、醫(yī)療機

2、構負責采集。采集標本時， 要根據(jù)不同采集對象設置不同的采樣區(qū)域，發(fā)熱患者前往發(fā)熱門 診就診和采樣。.確診病例、無癥狀感染者、入境人員、密切接觸者和密接（一）檢測人員要求。實驗室檢測人員應當具有實驗室工 作經(jīng)歷以及相關專業(yè)技術技能，接受過病毒相關檢驗檢測技能 培訓。檢測機構應當按照所開展檢測項目及標本量配備實驗室 檢測人員，以保證及時、高效完成檢測和結果報告。（二）實驗室檢測。1.實時熒光RT-PCR方法檢測病毒核酸。（1）核酸檢測實驗室。核酸檢測實驗室按功能區(qū)布置位置 的不同，可分為集中布置形式和分散布置形式。開展病毒核酸檢測的實驗室應當設置以下區(qū)域：試劑儲存和準備區(qū)、標 本制備區(qū)、擴增和產(chǎn)物

3、分析區(qū)。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域 可適當合并。如采用標本加樣、核酸提取及擴增檢測為一體的 自動化分析儀，標本制備區(qū)、擴增和產(chǎn)物分析區(qū)可合并。集中 布置形式的實驗室設置應遵循“各區(qū)獨立，單向流動（注意風 向，壓力梯度走向），因地制宜，方便工作”的原則。各區(qū)的 功能如下：試劑儲存和準備區(qū)：用于分裝、儲存試劑、制備擴增反 應混合液，以及儲存和準備實驗耗材。該區(qū)應配備冰箱或冰柜、離 心機、試驗臺、渦旋振蕩器、微量加樣器等。為防止污染， 該區(qū)宜保持正壓狀態(tài)。標本制備區(qū)：標本轉(zhuǎn)運桶的開啟、標本滅活（必要時）、 核酸提取及模板加入至擴增反應管等。該區(qū)應配備冰箱或冰柜、生 物安全柜、離心機、試驗臺、微量加樣器

4、，可根據(jù)實際工作10 需要選配自動化核酸提取儀等。標本轉(zhuǎn)運桶的開啟、分裝應在 生物安全柜內(nèi)完成。為防止污染，該區(qū)宜保持負壓狀態(tài)。為操 作方便，標本的分裝以及核酸提取也可以在獨立的生物安全二 級(BSL-2)實驗室進行，提取的核酸可以轉(zhuǎn)運至該區(qū)加至擴增 反應液中。核酸擴增和產(chǎn)物分析區(qū)：進行核酸擴增反應和產(chǎn)物分析。 該區(qū)應配備實時熒光定量PCR儀。為防止擴增產(chǎn)物污染環(huán)境， 該區(qū)宜保持負壓狀態(tài)，壓力等于或低于標本制備區(qū)。(2)病毒核酸的熒光定量RT-PCR檢測。實驗室應當制定 標準操作程序(SOP),并嚴格按照SOP進行操作。接到標本后, 應當在生物安全柜內(nèi)對標本進行清點核對，并依據(jù)SOP進行試 劑

5、準備、標本前處理、核酸提取、核酸擴增、結果分析及報告。 實驗室應當建立可疑標本復檢的流程。試劑準備。應當選擇國家藥品監(jiān)督管理部門批準的試劑， 建議根據(jù)核酸提取試劑及擴增體系的要求選擇配套的標本采樣 管，不建議免提取核酸直接進行核酸擴增反應。標本處理。使用含胭鹽等滅活型采樣液的標本無需進行 滅活處理，可直接進行核酸提取，而使用非滅活型采樣液的標 本，按照核酸提取試劑盒的說明，取適量標本加至核酸提取裂 解液中充分混勻作用一定的時間則可以有效滅活病毒。選用熱 滅活時可采用95T加熱15分鐘，不推薦采用56T孵育30分鐘 的處理方式滅活病毒，該條件不能保障充分滅活病毒。11污水水樣標本處理可參考污水中

6、富集濃縮和核酸檢測方 法標準(WS/T 799-2022)推薦的方法；污水拭子標本處理可 參考農(nóng)貿(mào)(集貿(mào))市場環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范(WS/T776-2021) 推薦的方法。核酸提取。將滅活后的標本取出，在生物安全柜內(nèi)打開 標本采集管加樣，或按照核酸提取試劑盒的說明，將標本與裂 解液作用足夠時間后繼續(xù)核酸提取步驟，核酸提取完成后立即 封蓋。取適量核酸加至PCR擴增反應體系中。核酸擴增。將擴增體系放入熒光定量PCR儀，按照試劑 盒說明書設置擴增程序，啟動擴增程序。擴增完成后反應管不 可開蓋，直接放于垃圾袋中，封好袋口，不可高壓，按一般醫(yī) 療廢物轉(zhuǎn)移出實驗室處理。檢測機構所選用的病毒核酸檢測試劑應針對病

7、毒基因組中開放讀碼框 lab (open reading frame lab, ORF lab) 和核衣殼蛋白(nucleocapsid protein, N)基因，人體標本檢 測原則上選擇含內(nèi)源性內(nèi)參的核酸檢測試劑。陽性標本的確認。實驗室確認陽性病例需滿足以下兩個條件中的一個：條件一：同一份標本中病毒2個靶標(ORFlab. N)實時熒 光RT-PCR檢測結果均為陽性。如果出現(xiàn)單個靶標陽性的檢測結 果，則需要重新檢測或重新采樣復核。條件二：兩種標本實時熒光RT-PCR同時出現(xiàn)單靶標陽性，12 或同種類型標本兩次采樣檢測中均出現(xiàn)單個靶標陽性的檢測結 果，可判定為陽性。環(huán)境與生物材料核酸檢測陽性

8、要排除疫苗接種物殘留污染 的影響。核酸檢測結果假陰性的可能原因包括：標本質(zhì)量差； 標本采集時間過早或過晚；標本保存、運輸和處理不當；其他 原因如病毒變異、PCR抑制等。質(zhì)控。由上級疾控部門對下級疾控實驗室進行核酸檢測 質(zhì)控考核，中國疾控中心每年至少開展一次對省級疾控機構實 驗室的質(zhì)控考核，并同時提供全國病毒實驗室檢測質(zhì)控方案， 省級針對地市級實驗室的質(zhì)控考核每年不少于兩次。各檢測機 構應當加強核酸檢測質(zhì)量控制，選用擴增檢測試劑盒指定的核 酸提取試劑和擴增儀。性能驗證。臨床標本檢測前，實驗室應對核酸提取試劑、 提取儀、擴增試劑、擴增儀等組成的檢測系統(tǒng)進行必要的性能 驗證，性能指標包括但不限于精密

9、度（至少要有重復性）和最 低檢測限。室內(nèi)質(zhì)控。實驗室可按照國家衛(wèi)生健康委辦公廳關于醫(yī) 療機構開展核酸檢測有關要求的通知（國衛(wèi)辦醫(yī)函（2020） 53號）要求規(guī)范開展室內(nèi)質(zhì)控。每批檢測至少有1份弱陽性質(zhì) 控品（第三方質(zhì)控品，通常為檢出限的1.5-3倍）、3份陰性質(zhì)控品（生理鹽水）。質(zhì)控品隨機放在臨床標 本中，參與從提取到擴增的全過程。大規(guī)模人群篩查時，一旦13 出現(xiàn)陽性結果，應對陽性標本采用另外一到兩種更為靈敏的核 酸檢測試劑對原始標本進行復核檢測，復核陽性方可報出。物品和環(huán)境標本的采集檢測，還需在采樣前及采樣過程中 至少設一個現(xiàn)場空白標本及一個運輸空白標本，以進行過程中 的質(zhì)量控制。室間質(zhì)評。

10、實驗室應常態(tài)化參加國家級或省級疾控機構組 織的室間質(zhì)評。對檢測量大以及承擔重點人群篩查等任務的實 驗室，可適當增加室間質(zhì)評頻率。不按要求參加室間質(zhì)評的， 或室間質(zhì)評結果不合格的，應通報批評并上報國家衛(wèi)健委，待 室間質(zhì)評通過后方可開展核酸檢測。核酸檢測實驗室質(zhì)控詳細內(nèi)容參見國家衛(wèi)生健康委辦公 廳關于加強疾控機構病毒核酸檢測實驗室質(zhì)量控制的通知 （國衛(wèi)辦疾控函2021） 548號）疾控機構病毒核酸檢測質(zhì) 量控制方案。.病毒全基因組測序。病毒全基因組測序可以監(jiān)測病毒基 因組突變，為病毒核酸檢測試劑、疫苗研發(fā)策略的改變提供實 驗數(shù)據(jù)，同時也為流調(diào)溯源工作提供支持。（1）測序標本選取原則。結合流調(diào)信息和

11、病例傳播鏈關系， 優(yōu)先選擇以下標本開展測序：核酸檢測Ct值W32的本土疫情 中的首發(fā)或早期病例、與早期病例有流行病學關聯(lián)的關鍵病例、感 染來源不明的本土病例、境外輸入病例、入境物品及相關環(huán) 境陽性標本、疫苗接種后核酸檢測陽性者標本等。測序結果應14 與本地近一個月的輸入病例和本土病例序列進行比對。對同一 傳播鏈或流行病學關系明確的病例無需全部測序。（2）測序要求。測序單位和流程。以省、自治區(qū)、直轄市為單位確定開 展病毒全基因組測序的機構，包括省級疾控機構和科研機構； 具備測序條件的省份要在接收標本后24小時內(nèi)開展測序工作。 不具備測序條件的省份要及時將標本送至病毒病所，病毒病所 收到標本后及時

12、啟動序列測定工作。結果報告與反饋。各省份要建立本省輸入、本土病例病 毒基因組數(shù)據(jù)庫，及時進行序列比對分析，逐步提高自主分析 能力。獲得的全部測序數(shù)據(jù)都必須上報中國疾控中心病毒病所 用于我國病毒溯源數(shù)據(jù)庫的更新與維護。對本土疫情的指示或 首發(fā)病例、本土疫情中由不同基因型的毒株導致的新傳播鏈的 指示或首發(fā)病例，測序完成后應于24小時內(nèi)將數(shù)據(jù)報送病毒病 所，病毒病所確認數(shù)據(jù)完整無誤后于48小時之內(nèi)反饋結果；對 本土疫情中歸屬已知傳播鏈的病例、境外輸入病例、環(huán)境標本 （非指示或首發(fā)病例相關），測序數(shù)據(jù)于每周周一上午集中上 報，病毒病所確認數(shù)據(jù)完整無誤后于一周之內(nèi)反饋結果。.血清抗體檢測。血清抗體檢測用

13、作病毒核酸檢測的 補充檢測，也用于評估疫苗接種后誘發(fā)的免疫反應。應采用中 國藥品監(jiān)督管理局批準的試劑進行檢測，采集急性期（發(fā)病715 天內(nèi)）和恢復期（3-4周后）雙份血清進行檢測，也可根據(jù)臨 床需要確定采集時間，疑似病毒感染者抗體檢測陽性時應排除 疫苗接種因素的影響。.病毒分離培養(yǎng)。（1）病毒分離培養(yǎng)對象。對核酸檢測Ct值W30的所有境 外輸入病例的標本、本土疫情中的首發(fā)或早期病例、與早期病例 有流行病學關聯(lián)的關鍵病例、感染來源不明的本土病例以及疫苗 接種后核酸陽性者標本開展病毒分離培養(yǎng)。（2）毒株報送與結果反饋。具有病毒分離、培養(yǎng)資質(zhì)的省 級疾控機構應開展病毒分離培養(yǎng)工作，收到關鍵標本后96

14、小 時內(nèi)開展相關工作，在獲得分離毒株后96小時內(nèi)將毒株送病毒 病所保存?zhèn)浒福⒍局晷蛄械认嚓P信息報送病毒病所。不具 備病毒分離條件的省份，要在病例報告后48小時內(nèi)啟動送樣流 程，將標本送達病毒病所，病毒病所收到標本后應在96小時 內(nèi)啟動病毒分離工作，獲得毒株后96小時內(nèi)反饋分析結果。.抗原檢測。不具備開展核酸檢測條件的基層醫(yī)療衛(wèi)生機 構、隔離觀察人員和有抗原自我檢測需求的社區(qū)居民可以進行 抗原檢測。抗原檢測不作為確診病例或無癥狀感染者診斷的依 據(jù)，僅用作核酸檢測方法的補充，實現(xiàn)“快篩快檢”，提高感 染者發(fā)現(xiàn)的及時性。具體實施流程及要求參照病毒抗原檢測 應用方案（試行）（聯(lián)防聯(lián)控機制綜發(fā)（20

15、22 ） 21號）執(zhí) 行。16三、實驗室活動Th物安全要求根據(jù)病毒傳播特性、致病性和臨床資料等信息，該病毒按照第二類病原微生物進行管理，具體要 求如下：（一）實驗活動規(guī)范。病毒培養(yǎng)、動物感染實驗應當在生物安全三級及以上實驗室開展；未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作 應當在生物安全二級及以上實驗室進行，同時采用不低于生物安全三級實驗室的個人防護；滅活材料 的操作應當在生物安全二級及以上實驗室進行；不涉及感染性材料的操作，可以在生物安全一級實驗 室進行。（二）相關標本處置。各省級衛(wèi)生健康行政部門要根據(jù)疫情防控需要和實驗室生物安全有關要求，及時研判提出病毒實 驗室檢測生物標本處置意見。對確需保存的，應當盡快

16、指定具備保存條件的機構按照相對集中原則進 行保存，或送至國家級菌（毒）種保藏中心保藏；對無需保存的，由相關機構按照生物安全有關要求 及時處理。（三）實驗室廢棄物處理及實驗室污染的處理。參考醫(yī)療機構核酸檢測工作手冊（試行第二版）。的密接在住院、隔離觀察或健康監(jiān)測期間應“單采單檢”，即單 獨采集個體的標本，單管進行核酸檢測，不得進行混采混檢。.根據(jù)臨床及實驗室檢測工作的需要，可在住院、隔離期間多 次采樣，可同時采集呼吸道、血液、便等多種標本。采樣人員應嚴 格遵循采樣規(guī)范，保障所采集標本質(zhì)量符合要求，同時應詳細記 錄受檢者信息，可利用條形碼掃描等信息化手段采集相關信息。.人群篩查應根據(jù)核酸提取、檢測

17、所用試劑的要求確定采樣管, 用于病毒分離的標本應放置于不含有病毒滅活劑的采樣管。.物品和環(huán)境監(jiān)測應根據(jù)監(jiān)測目的和防控需求，確定采樣物品 位置與數(shù)量，采樣時應嚴格遵循采樣規(guī)范。（四）采集標本種類。每個病例必須采集呼吸道標本（上呼吸道標本或下呼吸道標 本），重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標本；根據(jù)臨床需要可留取便 標本、全血標本、血清標本和尿標本。物品和環(huán)境標本根據(jù)監(jiān)測 需求采集。標本種類如下：.上呼吸道標本：包括鼻咽拭子、口咽拭子等。.下呼吸道標本：深咳痰液、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、呼 吸道吸取物等。.便標本/肛拭子：留取糞便標本約10克（花生大?。?果不便于留取便標本，可采集肛拭子。.血液標本

18、：抗凝血，采集量5ml,建議使用含有EDTA抗凝劑的真空采血管采集血液。血清標本：盡量采集急性期、恢復期雙份血清。血清應當盡 早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）采集，第二份血清應當在發(fā)病后 第34周采集。采集量5ml,建議使用無抗凝劑的真空采血管。 血清標本主要用于抗體的測定，不進行核酸檢測。尿標本：留取中段晨尿，采集量23nli。物體表面標本：包括進口冷鏈食品或進口貨物的內(nèi)外包裝表 面，以及運輸儲藏工具等可能被污染的部位進行涂抹采集的標本。污水標本：根據(jù)海運口岸大型進口冷凍物品加工處理場所 排水系統(tǒng)分布情況，重點選取污水排水口、內(nèi)部管網(wǎng)匯集處、污 水 井、污水流向的下游或與市政管網(wǎng)的連接處等關鍵位置對

19、未經(jīng)消殺 處理的污水進行采樣。其它：已有唾液等標本用于病毒檢測的報告。（五）標本采集和處理。.鼻咽拭子：采樣人員一手輕扶被采集人員的頭部，一手執(zhí)拭 子，拭子貼鼻孔進入，沿下鼻道的底部向后緩緩深入，由于鼻道呈弧 形，不可用力過猛，以免發(fā)生外傷出血。待拭子頂端到達鼻咽腔 后壁時，輕輕旋轉(zhuǎn)一周（如遇反射性咳嗽，應停留片刻），然后 緩緩取出拭子，將拭子頭浸入含23ml病毒保存液（也可使 用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋 緊管蓋。. 口咽拭子：被采集人員頭部微仰，嘴張大，露出兩側扁桃 體，采樣人員將拭子越過舌根，在被采集者兩側扁桃體稍微用力 來回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上

20、下擦拭至少3次，將拭子 頭浸入含23nli病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng) 液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋?？谘适米右部?與鼻咽拭子放置于同一管中。.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負壓泵相連的收集器從鼻 咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻 腔或氣管，接通負壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的 粘液，并用3ml采樣液沖洗收集器一次（亦可用小兒導尿管接 在50ml注射器上來替代收集器）。.深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml 采樣液的采樣管中。如果痰液未收集于采樣液中，可在檢測前 加入23nli采樣液，或加入痰液等體積的痰液消化液。痰

21、液 消化液儲存液配方見表lo使用時將儲存液用去離子水稀釋至 50ml,與痰液等體積混合使用，或者參照試劑說明進行使用，也 可采用痰液等體積的含lg/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液將痰液化。表1痰液消化液儲存液配方成分質(zhì)量/體積 TOC o 1-5 h z 二硫蘇糖醇0. 1g氯化鈉0.78g氯化磷0.02g磷酸氫二鈉0.112g磷酸二氫鉀0. 02g水PH 值 7. 40. 2 (25)7. 5ml.支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入 氣管(約30cm深處)，注入5ml生理鹽水，接通負壓，旋轉(zhuǎn) 收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用采樣液沖洗收集 器一次，也可用小兒導尿管接在50m

22、l注射器上來替代收集。.肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經(jīng) 過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支氣管，將其頂端契入支氣 管分支開口，經(jīng)氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30 50ml,總量100250ml,不應超過300mlo.糞便標本：取1ml標本處理液，挑取黃豆粒大小的糞便 標本加至管中，輕輕吹吸35次，室溫靜置10分鐘，以 8000rpm離心5分鐘，吸取上清液進行檢測。糞便標本處理液可自行配制，配方見表2O也可使用HANK S液或其它等滲鹽 溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液溶解便標本制備便懸液。如 患者出現(xiàn)腹瀉癥狀，則留取糞便標本35ml,輕輕吹打混勻后, 以8000rpm離心

23、5分鐘，吸取上清液備用。表2糞便標本處理液配方成分質(zhì)量/體積Tris1.211g氯化鈉8. 5g無水氯化鈣（或含結晶水的氯化鈣）1. 1g (1.47g)水800ml用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為7. 5,以去離子水補充至1000ml.肛拭子：用消毒棉拭子輕輕插入肛門35cm,再輕輕旋 轉(zhuǎn)拔出，立即放入含有35nli病毒保存液的15ml外螺旋蓋采 樣管中，棄去尾部，旋緊管蓋。.血液標本：建議使用含有EDTA抗凝劑的真空采血管采集 血液標本5ml,根據(jù)所選用核酸提取試劑的類型確定以全血或 血漿進行核酸提取。如需分離血漿，將全血1500-2000rpm離 心10分鐘，收集上清液于無菌螺口塑料管中。.血清標本：

24、用真空負壓采血管采集血液標本5ml,室溫 靜置30分鐘，1500-2000rpm離心10分鐘，收集血清于無菌 螺口塑料管中。.物體表面標本：參考農(nóng)貿(mào)（集貿(mào)）市場環(huán)境監(jiān)測技術 規(guī)范（WS/T7762021）推薦的方法，采樣拭子充分浸潤病毒保存液后在表面重復涂抹，將拭子放回采樣管浸 潤，取出后再次涂抹采樣，重復3次以上。對表面較大的物體 進行多點分布式采樣。.污水標本：采集污水的水體標本時，參考污水中富集 濃縮和核酸檢測方法標準（WS/T799-2022）,用無菌聚乙烯 瓶采集污水樣本，采樣體積為300mlo可根據(jù)現(xiàn)場條件和檢測 需求確定水樣采集方式，如瞬時水樣（采樣點位某一時間隨機 采集的樣本）

25、或混合水樣（同一采樣點位不同時間所采集的瞬 時水樣混合后的樣本）；如農(nóng)貿(mào)（集貿(mào)）市場內(nèi)排水溝內(nèi)無法 采集足夠體積水樣，可采集污水的拭子標本，參考農(nóng)貿(mào)（集 貿(mào)）市場環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范（WS/T776-2021）推薦的方法，用拭子浸入吸附污水，將拭子 放回采樣管浸潤，取出后再次浸入污水，重復3次以上，對每 個污水采樣位置應進行多點分布式采樣。.其他材料：如唾液等標本，依據(jù)檢測需求采集。（六）標本包裝。標本采集后應在生物安全二級實驗室生 物安全柜內(nèi)分裝。.所有標本應當放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷 凍的標本采集管里，擰緊。容器外注明標本編號、種類、姓名 及采樣日期。.將密閉后的標本裝入密封袋，每袋限一份標本。標本包 裝要求要符合危險品航空安全運輸技術細則相應的標準。.涉及外部標本運輸?shù)模瑧鶕?jù)標本類型，按照A類或B 類感染性物質(zhì)進行三層包裝。（七）標本保存。用于病毒分離和核酸檢測的標本應當盡 快進行檢測，可在24小時內(nèi)檢測的標本置于4 （2-8） 保存；24小時內(nèi)無法檢測的標本應置于-7CTC或以下保存（如 無-7（TC保存條件，則于-2CTC冰箱暫存）。血清標本可在4 存放3天，-2（TC以下可長期保存。境外高風險區(qū)域人群以及肺 炎患者的密切接觸者等人員的核酸檢測標本，檢測后，應當在-