1、UPLC應(yīng)用技術(shù)簡(jiǎn)介生命科學(xué)研究中心現(xiàn)代分析檢測(cè)平臺(tái)目 錄液相色譜歷史回顧1儀器介紹與理論基礎(chǔ)2HPLC與UPLC比較3應(yīng)用和展望4色譜分離精度高，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，根據(jù)各種原理進(jìn)行分離的色譜法不僅普遍應(yīng)用于物質(zhì)成分的定量分析和檢測(cè)，而且廣泛應(yīng)用于生物物質(zhì)的制備分離和純化。是目前最好的生物純化技術(shù)。常見(jiàn)的分離方式蒸餾離心電泳過(guò)濾超濾色譜一、液相色譜歷史回顧液相色譜40年的發(fā)展史是顆粒技術(shù)的發(fā)展史。顆粒度的改變直接影響到柱效，從而對(duì)分離結(jié)果產(chǎn)生直接影響。由下圖可知：隨著顆粒度的不斷降低，色譜分離度不斷提高。一、液相色譜歷史回顧高效液相色譜法 HPLC(High Performance Liqu

2、id Chromatography ) 是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜,基于儀器方法的高效能分離手段:高性能色譜柱,高精度輸液泵,高靈敏度檢測(cè)器 廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域:醫(yī)藥,環(huán)保,石化,生命科學(xué),食品工業(yè),農(nóng)業(yè) 無(wú)論在技術(shù)上,理論上,還是在應(yīng)用上仍有較大的發(fā)展空間一、液相色譜歷史回顧 自20世紀(jì)70年代以來(lái)，隨著高效液相色譜(HPLC)技術(shù)的不斷發(fā)展，美國(guó)Waters公司于2004年的匹茲堡會(huì)議上推出了最新研制的ACQUITY超高效液相色譜(UPLC)，其采用17 m細(xì)粒徑的新型固定相，可獲得高達(dá)2萬(wàn)塊m理論塔板數(shù)的超高柱效，并以系統(tǒng)整體設(shè)計(jì)的創(chuàng)新技術(shù)，全面提升了液相色譜的速度、靈敏度和分離度，造就了

3、液相色譜性能上的飛躍和進(jìn)步并形成分離科學(xué)的一個(gè)新興領(lǐng)域。一、液相色譜歷史回顧 超高效液相色譜的發(fā)展背景 首先是大量的樣品需要在很短的時(shí)間內(nèi)完成； 其次是在生化樣品及天然產(chǎn)物樣品的分析中，樣品的復(fù)雜性對(duì)分離能力提出了更高的要求； 第三是在與質(zhì)譜等檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用時(shí)，也提出了更高的要求。 將HPLC的極限作為自己的起點(diǎn)。 一、液相色譜歷史回顧ACQUITY H-Class 系統(tǒng)總攬二、儀器介紹與理論基礎(chǔ)檢測(cè)器：光電二極管矩陣 為UPLC專門優(yōu)化的流動(dòng)池 高速檢測(cè)色譜柱管理： 1.7細(xì)粒徑新型固定相 液體加熱器樣品管理器： 低擴(kuò)散 快速進(jìn)樣周期 低交叉污染 兩個(gè)樣品盤四元溶劑管理：四元梯度在線脫氣UPL

4、C的耐壓能力二、儀器介紹與理論基礎(chǔ)技術(shù)上的突破:UPLC色譜柱技術(shù)二、儀器介紹與理論基礎(chǔ)ACQUITY UPLC H-Class主動(dòng)預(yù)熱二、儀器介紹與理論基礎(chǔ)二、儀器介紹與理論基礎(chǔ)分離度速度容量開發(fā)液相色譜方法分辨率是色譜分離中主要考慮的因素在開發(fā)色譜方法時(shí)，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下幾個(gè)因素都要考慮。靈敏度載樣量分析速度溶劑損耗三、HPLC與UPLC比較色譜條件的開發(fā)思路 根據(jù)分析物的化學(xué)性質(zhì)選配色譜條件 基于既往經(jīng)驗(yàn)及思考進(jìn)行合理猜測(cè) 通常輔以資料參考 詢問(wèn)同事“步進(jìn)式”測(cè)試開發(fā) 基于前一測(cè)試結(jié)果設(shè)計(jì)下一步的測(cè)試條件，逐步進(jìn)行 系統(tǒng)性篩選策略 先按流動(dòng)相pH、有機(jī)相和固定相的

5、直接組合進(jìn)行系統(tǒng)性篩選測(cè)試o 評(píng)估結(jié)果，選擇最有效的條件組合 再進(jìn)行方法優(yōu)化o 梯度/溫度三、HPLC與UPLC比較 UPLCTM與HPLC：速度比較由于ACQUITY UPLCTM系統(tǒng)用1.7 m顆粒，柱長(zhǎng)可以比用5 m顆粒時(shí)縮短3倍而保持柱效不變，而且使分離在高3倍的流速下進(jìn)行，結(jié)果使分離過(guò)程快了9倍而分離度保持不變。三、HPLC與UPLC比較三、HPLC與UPLC比較 能夠在一個(gè)工作日內(nèi)完成方法開發(fā)!一、對(duì)pH、有機(jī)相和色譜柱的組合條件進(jìn)行系統(tǒng)性篩查 二、高分辨亞二微米色譜柱技術(shù)確保高分辨分離在更快的同時(shí)分離能力不打折扣三、可自動(dòng)選擇色譜柱和流動(dòng)相四、 四元溶劑混合使方法開發(fā)更方便 UP

6、LC技術(shù)實(shí)現(xiàn)更快更有效的方法開發(fā)三、HPLC與UPLC比較使用UPLC的一般建議三、HPLC與UPLC比較三、HPLC與UPLC比較使用UPLC的一般建議新鮮流動(dòng)相的要求三、HPLC與UPLC比較器具使用通則三、HPLC與UPLC比較方法轉(zhuǎn)換考慮因素三、HPLC與UPLC比較UPLC和HPLC區(qū)別三、HPLC與UPLC比較Click to add title in here 超高效液相色譜的應(yīng)用現(xiàn)狀1.食品安全領(lǐng)域1.1農(nóng)藥殘留物檢測(cè)領(lǐng)域1.2食品添加劑分析檢測(cè)中的應(yīng)用農(nóng)藥殘留分析屬于微量至超微量分析范疇，要求檢測(cè)儀器有非常高的靈敏度；同時(shí)，由于其具有種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn)，對(duì)檢測(cè)方法的通量

7、和速度也提出了更高的要求。在農(nóng)殘分析檢測(cè)中，UPLC與傳統(tǒng)的HPLC 相比較，不僅在分離度、靈敏度和分析速度上得到較大提高，而且很大程度上減少了樣品和試劑的消耗量，具有很好的應(yīng)用前景。隨著食品品種和添加劑種類的增加、多種添加劑的復(fù)配使用，迫切需要建立多種添加劑同時(shí)快速檢測(cè)的方法。目前，HPLC 技術(shù)是食品添加劑檢測(cè)的最常用方法；而較這一傳統(tǒng)方法而言，在技術(shù)性能上擁有優(yōu)勢(shì)的UPLC 得到了更突出的應(yīng)用。四、應(yīng)用與展望2.藥物開發(fā)領(lǐng)域2.1化學(xué)藥品分析2.2中藥藥品分析在針對(duì)藥物合成的分析方面，UPLC可實(shí)現(xiàn)隨時(shí)快速準(zhǔn)確檢測(cè)合成過(guò)程中的中間體、副產(chǎn)物或降解產(chǎn)物等。Waters公司合成了17 pm顆

8、粒度的Acquity UPLC填料，減少了固定相表面殘余硅羥基，因而在分析生物堿類樣品時(shí)，流動(dòng)相中只加入酸抑制劑，不需添加有機(jī)胺即可使其獲得良好的分離。由于在流動(dòng)相中避免了有機(jī)胺及鹽的加入，可以在一定程度上降低質(zhì)譜噪音、減少對(duì)質(zhì)譜的污染，且使用的流速適合與質(zhì)譜直接聯(lián)用，無(wú)需分流，可以進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，為中藥分析提供良好的平臺(tái)。四、應(yīng)用與展望3.其他領(lǐng)域農(nóng)藥殘留物檢測(cè)水質(zhì)和環(huán)境監(jiān)測(cè)化妝品質(zhì)量控制.四、應(yīng)用與展望 與UPLC匹配的色譜柱比較少峰面積的重復(fù)性欠佳 對(duì)高頻檢測(cè)儀器的需要超高效液相色譜的局限性盡管UPLC能顯著減少?gòu)?fù)雜樣品的分析分離時(shí)間，提高檢測(cè)的靈敏度和分離度，但目前UPLC的使用

9、仍然存在局限性。色譜柱要能夠耐受由于粒徑減小而帶來(lái)的高反壓，而且粒徑的減小也給色譜柱充填技術(shù)帶來(lái)了挑戰(zhàn)。UPLC分析樣品時(shí)峰面積的重復(fù)性略遜于HPLC，特別是低濃度樣品時(shí)更加明顯，其峰面積重復(fù)性的RSD約為HPLC的2倍。UPLC分離樣品色譜峰擴(kuò)展很小，通常峰底寬度只有幾秒鐘，低濃度的樣品峰則更窄。使用UPLC測(cè)定低濃度樣品時(shí)，準(zhǔn)確度、精密度都比較差。四、應(yīng)用與展望四、應(yīng)用與展望UPLC用于熱毒寧注射液中11種成分測(cè)定及其指紋圖譜研究 UPLC 法測(cè)定大鼠血漿中 Liguzinediol 濃度以及動(dòng)力學(xué)研究色譜條件 色譜柱: Acquity UPLC HSS T3 柱( 2.1 mm100 m

10、m， 1. 8 m) ; 流動(dòng)相 甲醇 : 水( 28 : 72) ; 流速: 0. 4 mlmin -1; 柱溫: 30 ; 檢測(cè)波長(zhǎng): 278 nm; 進(jìn)樣量: 5 l。 血漿樣品處理方法 精密吸取血漿 200 l，置5 ml 離 心 管 中， 精 密 加 入 內(nèi) 標(biāo) 溶 液 20l 及 甲 醇1. 80 ml， 漩 渦 振 蕩 3 min， 5 000 r min -1離 心 5min。精密吸取上清液 1.6 ml，45 水浴 N2 吹干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相 200 l 渦旋 30 s 使溶解， 10 000 rmin -1離心 5 min，取上清液進(jìn)樣。四、應(yīng)用與展望UPLC 測(cè)定草莓果實(shí)中

11、類胡蘿卜素含量以丙酮石油醚=12 作為提取劑，皂化提取草莓果實(shí)中類胡蘿卜素，同時(shí)采用 ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱，以乙腈甲醇=91 為流動(dòng)相，在 450 nm 下測(cè)定是進(jìn)行草莓果實(shí)類胡蘿卜素定性定量分析的最佳方法。 成熟草莓中能檢測(cè)到葉黃素、-隱黃質(zhì)、-胡蘿卜素，含量依次為：118.5、12.6、99.8 gkg-1；檢測(cè)不到番茄紅素；檢測(cè)可以在 5 min 內(nèi)完成，比常規(guī)方法節(jié)約時(shí)間 70%左右；方法平均回收率達(dá)到 93.2%，變異系數(shù)為 1.32%1.86%。四、應(yīng)用與展望風(fēng)信子花瓣花色苷組成分析UPLC 分析條件：色譜柱為 ACQUITYUPLCBEH 的 C18

12、柱（ 2.1 mm 100 mm， 1.7 m）。柱溫 45 ，流速 0.4 mL min-1，進(jìn)樣體積 3 L。流動(dòng)相 A 液為 0.1%的甲酸溶液（ V 甲酸V 水 = 0.199.9）； B 液為含 0.1%甲酸的乙腈（ V 甲酸V 乙腈 = 0.199.9）。梯度洗脫程序：0 min， 95% A， 5% B； 0.5 min， 95% A， 5% B； 2.5 min， 82% A， 18% B； 7.5 min， 65% A， 35% B；11 min， 35% A， 65% B； 12 min， 0% A， 100% B； 13 min， 0% A， 100% B； 13.5 m

13、in， 95% A， 5%B； 15 min， 95% A， 5% B。在特征吸收波長(zhǎng) 520 nm 處檢測(cè)總花色苷（ totalanthocyanins,TA）含量。以標(biāo)準(zhǔn)品氯化矢車菊( cyanidin chloride，Sigma）作為外標(biāo)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)對(duì)花瓣 TA 進(jìn)行定量。 TA 為每 g 新鮮花瓣中含有的相對(duì)于 cyanidin 的含量四、應(yīng)用與展望谷子莖尖組織中4種植物激素 赤霉素、-萘乙酸、6-芐氨基嘌呤、脫落酸色譜柱：Hypersil C18（5m，200 mm4.6 mm）；柱溫30；流速0.6 mLmin-1；進(jìn)樣量20L；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.75%冰醋酸溶液（B）； 色譜柱：ACQUITYUPLCBEH 的 C18 柱（ 2.1 mm 100 mm， 1.7 m）。柱溫 30 ，流速 0.4 mL min-1，進(jìn)樣體積 6 L。）檢測(cè)