1、第八講植物細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù) 1 單細胞的分離由完整的植物器官分離單細胞由培養(yǎng)組織（如愈傷組織） 中分離單細胞1.1 由完整的植物器官分離單細胞機械法 酶解法 葉片是分離單細胞的最好材料1.1.1 機械法 方法A：用刀片刮葉片 (花生成熟葉片)具體方法:撕去表皮露出葉肉細胞用解剖刀刮下細胞 方法B：葉片研碎、離心輕輕研磨加研磨介質(zhì)過濾、離心 研磨介質(zhì)： 40ml 20umol Sucrose 10umol MgCl2 20umol trisHCL (三羥甲基氨基甲烷 ) PH 7.8 注意： 只有薄壁組織排列松散，細胞間結(jié)觸點很少時用機械法分離葉肉細胞才能取得成功。注意： 大麥、小麥和玉米很難通

2、過酶解法使細胞分離。（葉肉細胞伸長，并在許多地方收縮，細胞間形成一種互鎖結(jié)構(gòu)）1.1.2 酶解法Takebe等（1968）最早報道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細胞加果膠酶過濾 、離心1.1.3 機械法和酶解法比較機械法酶解法細胞不受到酶的傷害；不用質(zhì)壁分離；細胞產(chǎn)量低；細胞易破。細胞受到酶的傷害；要質(zhì)壁分離；細胞產(chǎn)量高；細胞不易破。1.2 由培養(yǎng)組織（愈傷組織）分離單細胞材料：胡蘿卜肉質(zhì)根步驟： 誘導產(chǎn)生愈傷組織 愈傷組織反復繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性；搖床用于振蕩繼代懸浮 Subculture 將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物優(yōu)點：細胞團成小細胞團或單細胞；在

3、培養(yǎng)基中均勻分布；有空氣交流。2 植物細胞懸浮培養(yǎng) 技術(shù) （Suspension culture）2.1 概念： 細胞懸浮培養(yǎng)- 是指一種在受到不斷搖動的液體培養(yǎng)基里，培養(yǎng)單細胞及小細胞團的組織培養(yǎng)系統(tǒng)。2.2 特點：細胞可以不斷增殖，形成高密度的細胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；能夠提供大量較為均勻的細胞，為研究細胞的生長、分化創(chuàng)造方法和條件。必須指出：懸浮培養(yǎng)中既有單細胞，也有小細胞團。2.3 懸浮細胞培養(yǎng)基本過程 起始懸浮液的制備愈傷組織液體培養(yǎng)基搖床振蕩懸浮培養(yǎng)質(zhì)地疏松，細胞分散程度大；質(zhì)地緊密，細胞分散程度小，不適于懸浮培養(yǎng)轉(zhuǎn)速30150rpm防細胞破裂 懸浮培養(yǎng)的基本形式 分批培養(yǎng) 連續(xù)培

4、養(yǎng) 分批培養(yǎng)（Batch culture）含義：將細胞分散在一定容積的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。 在培養(yǎng)過程中除了氣體和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物可以同外界空氣交換外，一切都是密閉的。 它是進行細胞生長和細胞分裂的生理生化研究常用的培養(yǎng)方法。特點： 培養(yǎng)基體積固定 當培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)耗盡時，細胞的分裂和生長也停止 必須適當攪拌繼代的方法和最佳時期繼代方法：用注射器或移液管吸取一定量的含單細胞和小細胞團的懸浮培養(yǎng)物，并移到含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里，繼續(xù)進行培養(yǎng)。 注意：要適當稀釋繼代最佳繼代時期： 選擇指數(shù)生長期和直線生長期。細胞生長曲線在整個培養(yǎng)過程中，細胞數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的由慢到快，再到慢，最后增

5、長停止的細胞周期。 細胞的生長呈S形曲線滯后期 (lag phase)指數(shù)生長期(exponential phase)直線生長期(linear phase)減慢期(progressive deceleration phase)靜止期(stationary phase)培養(yǎng)時間培養(yǎng)細胞數(shù)目1234512345滯后期 (lag phase) 細胞很少分裂，其時間長短取決于在繼代時原種培養(yǎng)細胞所處的生長期和轉(zhuǎn)入細胞數(shù)量的多少。培養(yǎng)時間培養(yǎng)細胞數(shù)目123451指數(shù)生長期(exponential phase) 細胞分裂活躍，細胞數(shù)目迅速增加。 培養(yǎng)時間培養(yǎng)細胞數(shù)目123452直線生長期(linear p

6、hase) 細胞生長和發(fā)育最快的時期。培養(yǎng)時間培養(yǎng)細胞數(shù)目123453減慢期(progressive deceleration phase) 由于培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)耗盡，或是由于有毒代謝產(chǎn)物的積累，細胞的增長逐漸減慢。培養(yǎng)時間培養(yǎng)細胞數(shù)目123454 生長幾乎處于停止狀態(tài)，細胞數(shù)目增加極少，甚至開始死亡。靜止期(stationary phase)培養(yǎng)時間培養(yǎng)細胞數(shù)目123455小結(jié)： （1）滯后期的長短主要取決于在繼代時原種培養(yǎng)細胞所處的生長期和轉(zhuǎn)入細胞數(shù)量的多少。（2）加入條件培養(yǎng)基可以縮短滯后期。 （3）縮短兩次繼代時間間隔，則可使懸浮培養(yǎng)的細胞一直保持指數(shù)生長期。（4）如果使處在靜

7、止期的細胞懸浮液保持時間太長，則會引起細胞的大量死亡和解體。操作注意事項： 對懸浮培養(yǎng)細胞繼代時，進液口的孔徑要小，只能通過單細胞或小細胞團（24個細胞），使用吸管或注射器。 繼代前，培養(yǎng)容器靜置短時間，大細胞團沉降，再吸上層懸浮液。依此，多次，可建立良好的細胞懸浮培養(yǎng)物。 連續(xù)培養(yǎng)（Continuous culture）加入培養(yǎng)基排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物 二者體積相等 開放式連續(xù)培養(yǎng) 封閉式連續(xù)培養(yǎng)開放式和封閉式區(qū)別封閉式中： 排出液中的細胞用機械方法收集后，又放入原培養(yǎng)基，所以其培養(yǎng)細胞數(shù)目不斷增加；開放式中： 在注入新鮮培養(yǎng)基的同時，培養(yǎng)細胞隨同培養(yǎng)液一起流出 。連續(xù)培養(yǎng)意義： a. 植物細

8、胞代謝調(diào)節(jié)的研究 b. 某種生長限制因子對細胞生長的影響 c. 次生物質(zhì)的大量生產(chǎn) 紫杉醇是獲得美國FDA(1992)認證的優(yōu)良抗腫瘤藥物。紅豆杉樹皮中紫杉醇的含量為萬分之二，其在國際市場上售價為20萬美元/kg 3 由懸浮細胞再生植株的途徑由懸浮細胞直接形成體細胞胚先將懸浮細胞在半固體培養(yǎng)基上誘導形成愈傷組織，然后再由愈傷組織分化植株4 細胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基4 .1 懸浮培養(yǎng)對培養(yǎng)基的要求 能用來建立生長快、易散碎的愈傷組織的培養(yǎng)基，一般也適用于建立該物種的懸浮培養(yǎng)。 在活躍生長的懸浮培養(yǎng)物中，無機磷酸鹽的消耗很快，不久成為限制因子。 Noguchi等(1977)證明，把煙草懸浮培養(yǎng)物保存在

9、一種含有標準的MS無機鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)開始3d之內(nèi)無機磷酸鹽的濃度就幾乎下降為零，即使把培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度提高到原來的水平的3倍，5d之內(nèi)也會被細胞全部用完。 高等植物的懸浮培養(yǎng)，B5和ER培養(yǎng)基。4.2 條件培養(yǎng)基 把在液體培養(yǎng)基里 培養(yǎng)46周的高濃度細胞濾掉，而用它的培養(yǎng)基制成懸滴或薄層來培養(yǎng)單細胞或低密度細胞群體。4.3 培養(yǎng)基的振蕩原因： 防止細胞缺氧死亡 防止大的細胞團的形成4.4 懸浮培養(yǎng)細胞的同步化 同步培養(yǎng)： 指在培養(yǎng)中大多數(shù)細胞都能同時通過細胞周期的各個階段。 應用：為了便于研究細胞分裂和細胞代謝4.4.1 物理方法A 按細胞團的大小 通過對細胞物理特性（細胞或小細胞團的大

10、?。┑目刂?，以實現(xiàn)高度的同步化B 低溫休克法 通過對生長環(huán)境條件（光照、溫度等）的控制，以實現(xiàn) 高度的同步化4.4.2 化學方法A 饑餓法 先對細胞斷絕一種細胞分裂所必須的營養(yǎng)物質(zhì)成分或激素，使細胞停滯在G1或G2期，經(jīng)過一段時間的饑餓后，當重新在培養(yǎng)基中加入這種限制因子時，靜止細胞就會同步進入分裂。 細胞周期（cell cycle)是指細胞從第一次分裂結(jié)束產(chǎn)生新細胞到第二次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段。 間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。 細胞分裂期：前期，中期，后期，末期 4.4.2 化學方法B 抑制法 使用DN

11、A合成抑制劑，如5-氨基尿嘧啶、羥基尿和胸腺嘧啶脫氧核苷 當細胞受到化學藥物抑制時，細胞周期只能進行到G1，細胞滯留在G1期S期的邊界上。5 懸浮培養(yǎng)中細胞生長量的計算細胞計數(shù)細胞密實體積（PCV）5鉻酸或0.25果膠酶使懸浮細胞團分散用血球計數(shù)板進行。將體積已知、均勻分散的懸浮液放入一個1.5ml 的離心管中，3000rpm離心，用每毫升培養(yǎng)液中細胞總體積的毫升數(shù)表示。細胞鮮重細胞干重細胞鮮重： 細胞培養(yǎng)物過濾，洗去培養(yǎng)基，真空抽濾，稱重。細胞干重： 60干燥12h，稱重。 以每毫升培養(yǎng)物或106個細胞的重量表示。6 培養(yǎng)細胞活力的測定相差顯微術(shù)法 TTC法（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）FDA法（熒光素雙醋酸酯法）伊凡藍法(Evans blue)（FDA的互補法） 根據(jù)細胞質(zhì)環(huán)流和細胞核存在與否，鑒別細胞的死活。 環(huán)流正常、核存在表明有活力； 在活細胞中，TTC被還原成紅色甲鐟，提取甲鐟用分光光度計檢測。 活力受損的細胞能夠攝取這種染料，完整的活細胞則不能，凡染藍色的細胞是不具有活力的細胞FDA法的原理FDA本身不具有極性，不能發(fā)出熒光，可以自由出入細胞膜。在活細胞中，F(xiàn)DA被酯酶裂解