1、產(chǎn)漆酶真菌以及漆酶的研究摘要：漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，在細(xì)菌、真菌、放線菌、植物中都有報(bào)道，但報(bào)道最多的為真菌，尤其是白腐真菌。漆酶能夠降解環(huán)境中的木質(zhì)素，在紙漿漂白、廢水處理中意義重大。漆酶通常情況下漆酶含有4個(gè)銅原子結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)電子在這四個(gè)銅原子間相互傳遞達(dá)到分解底物的目的。漆酶基因的異源表達(dá)已經(jīng)吸引了廣大學(xué)者的目光，至今為止，數(shù)十種真菌的漆酶基因已經(jīng)成功在酵母等異源表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，我們可以預(yù)見(jiàn)漆酶在人類(lèi)未來(lái)的生活中將發(fā)揮重要作用。關(guān)鍵詞：漆酶，白腐真菌，銅原子結(jié)合，異源表達(dá)現(xiàn)如今，環(huán)境污染已嚴(yán)重影響了人類(lèi)的生存，造紙廠、紡織廠排出的廢水則是重要的污染源之一。木質(zhì)素是使廢水顏色發(fā)黑的

2、主要原因1，倘若在工廠排出廢水前先將木質(zhì)素出去，將會(huì)大大降低廢水的毒性。木質(zhì)素是由聚合的芳香醇構(gòu)成的一類(lèi)物質(zhì)，存在于木質(zhì)組織中，是世界上僅次于纖維素的第二位最豐富的有機(jī)物。木質(zhì)素作為纖維素的粘合劑，能增強(qiáng)植物體的機(jī)械強(qiáng)度，利于輸導(dǎo)組織的水分運(yùn)輸和抵抗不良外界環(huán)境的侵襲。木質(zhì)素外觀上是一種白色或接近無(wú)色的物質(zhì)，相對(duì)密度大約在1.351.50之間，非常堅(jiān)硬，難溶于各種無(wú)機(jī)或有機(jī)溶劑2。木質(zhì)素屬天然芳香族高分子聚合物，是一類(lèi)在自然界存在量很大但是又較難降解的可再生資源，木質(zhì)素不含易水解的重復(fù)單元，因而不受水解酶的攻擊，不僅如此，它還和半纖維素以共價(jià)鍵形式結(jié)合，將纖維素分子包埋在其中，形成一種天然屏障

3、，使纖維素酶不易與纖維素分子接觸，給纖維素的降解也造成了困難3。因此去木質(zhì)素成為目前人們面臨的一大難題。白腐真菌降解木質(zhì)素研究表明，在自然界中，木質(zhì)素的完全降解是真菌、細(xì)菌、放線菌及相應(yīng)微生物群落共同作用的結(jié)果。其中，真菌起主導(dǎo)作用4，某些真菌能夠有效的降解木質(zhì)素，尤其是白腐真菌(white-rotfungus)可通過(guò)一系列的酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)素的徹底降解。白腐真菌是一類(lèi)絲狀真菌，分類(lèi)學(xué)上屬于真菌門(mén)，絕大多數(shù)為擔(dān)子菌綱，少數(shù)為子囊菌綱。目前，研究最多的是黃孢原毛平革菌、彩絨草蓋菌、變色栓菌、射脈菌、鳳尾菇等。其中，黃孢原毛平革菌是典型菌種，是研究木質(zhì)素降解的模式菌，普遍分布于北美，我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)

4、。白腐真菌木質(zhì)素酶系統(tǒng)包括兩類(lèi)三種4,一類(lèi)是是能利用H202作電子受體的過(guò)氧化物酶類(lèi)，這類(lèi)酶包括木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(EC1.11.1.13LigninPeroxidase,簡(jiǎn)稱(chēng)Lip)和錳依賴(lài)過(guò)氧化物酶(EC1.11.1.14ManganesePeroxidase,簡(jiǎn)稱(chēng)MnP)；另一類(lèi)是利用02作為電子受體的多酚氧化酶類(lèi)，這類(lèi)酶稱(chēng)為漆酶(EC1.10.3.2laccase,簡(jiǎn)稱(chēng)Lac)。以上三種酶各自代表一系列同工酶。木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳依賴(lài)過(guò)氧化物酶都是含亞鐵血紅素的糖蛋白，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶分子量大約為40kD，錳依賴(lài)過(guò)氧化物酶的分子量一般在3862.5kD之間，它們的血紅素輔基埋在蛋白質(zhì)內(nèi)構(gòu)

5、成活性中心(錳依賴(lài)過(guò)氧化物酶的活性中心尚需一個(gè)Mn2+和兩個(gè)起穩(wěn)定結(jié)構(gòu)作用的Ca2+)；漆酶則是一種以02作電子受體的含有4個(gè)銅離子的氧化酶，分子量在6080kD之間。漆酶催化氧化底物的基理漆酶最早由一名日本人發(fā)現(xiàn)，它并非只存在于微生物界，在細(xì)菌、植物中也有報(bào)道5。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶6，屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族，能夠氧化多種芳香化合物和其它有機(jī)化合物，且副產(chǎn)物只有水，被譽(yù)為“綠色酶”。漆酶一般以單體存在，極少情況下會(huì)有同源或異源二聚體，以及同源四聚體。通常情況下漆酶含有4個(gè)銅原子結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)其光譜和磁性特征可將其分為三類(lèi)，I型Cu2+一個(gè)，呈藍(lán)色，在紫外可見(jiàn)光譜614nm處有特征吸收，

6、II型Cu2+一個(gè)，非藍(lán)色，沒(méi)有特征吸收光譜，111型Cu24+兩個(gè)，是耦合的離子對(duì)，在紫外可見(jiàn)光譜330nm處有較寬的吸收帶。在三類(lèi)銅原子中，前兩種是單電子受體，順磁性，可用順磁共振測(cè)定，III型Cu24+是反磁性，無(wú)法用順次共振檢測(cè)。I型Cu2+中心相對(duì)獨(dú)立，并且都與兩個(gè)組氨酸(His)的N和一個(gè)半胱氨酸(Cys)的5配位，形成扭曲的四面體結(jié)構(gòu)，其中共價(jià)鍵Cu-S(Cys)的配位使漆酶呈現(xiàn)藍(lán)色。II型Cu2+和III型Cu24+中心緊密相連形成一個(gè)三核銅簇。三核銅簇與8個(gè)His配位結(jié)合，其中II型銅結(jié)合2個(gè)His，III型銅結(jié)合6個(gè)His。當(dāng)然，并不是所有的漆酶都具有四個(gè)銅原子。HisHi

7、sOHCuHisCysHisII型Cu2+和III型Cu24+I型52+漆酶催化底物氧化時(shí)刀，I型Cu2+和II型Cu2+首先分別從底物接受一個(gè)電子，由二價(jià)變?yōu)橐粌r(jià)，然后通過(guò)分子內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移，1型Cu2+和II型Cu2+將電子傳遞給III型Cu24+，它們由一價(jià)變成二價(jià)，111型Cu24+由二價(jià)變成一價(jià)。當(dāng)I型Cu2+和II型Cu2+分別再次從底物接受一個(gè)電子變成一價(jià)時(shí)，四個(gè)銅離子都是一價(jià)，這時(shí)漆酶呈還原態(tài)。在有02存在下，還原態(tài)漆酶被氧化。02從I型Cu+和III型Cu22+迅速接受三個(gè)電子，生成光活性氧中間體(Cu2O)3+，并失去一分子水，1型Cu+和III型Cu22+由一價(jià)變成二價(jià)。I

8、I型Cu+再氧化很慢，氧中間體一直與III型Cu22+相連，當(dāng)它從II型Cu+接受第四個(gè)電子還原為水時(shí)才脫離III型Cu24+，這時(shí)四個(gè)銅離子都是二價(jià)，漆酶呈氧化態(tài)。這樣，通過(guò)四個(gè)銅離子的協(xié)同作用，傳遞電子，同時(shí)發(fā)生價(jià)態(tài)變化，實(shí)現(xiàn)漆酶對(duì)底物的催化氧化。漆酶的異源表達(dá)雖然漆酶的潛在應(yīng)用價(jià)值很廣8，比如在紙張漂白、生物修復(fù)、染料脫色、果汁與酒的澄清和紡織品的清潔等，但是由于產(chǎn)量低，價(jià)格昂貴，漆酶的工業(yè)應(yīng)用受到很大的限制。漆酶屬于真菌的第二產(chǎn)物，僅在外界環(huán)境惡劣的情況下才會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生，因此僅憑野生菌生產(chǎn)的漆酶遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿(mǎn)足需求。異源表達(dá)漆酶基因是個(gè)有效的辦法，目前已有多種蛋白通過(guò)異源表達(dá)的方法投入工業(yè)生

9、產(chǎn)，比如青霉素、蔗糖酶、幾種生長(zhǎng)激素等。漆酶異源表達(dá)的前提是將其基因克隆出來(lái)910，1988年Frohman等首次利用快速擴(kuò)增cDNA技術(shù)從白腐菌Postreatus中克隆到漆酶poxI基因，后來(lái)的學(xué)者多用RT-PCR技術(shù)來(lái)獲得漆酶基因；也有學(xué)者先建立菌種的cDNA文庫(kù)，然后以已知的漆酶基因做探針進(jìn)行篩選；還有人利用漆酶銅原子結(jié)合位點(diǎn)的保守性，設(shè)計(jì)引物克隆漆酶基因。到現(xiàn)在，30種不同來(lái)源的漆酶基因已被克隆和測(cè)序。酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前研究的較為透徹的表達(dá)系統(tǒng)，它易于進(jìn)行分子遺傳操作，能夠?qū)χ亟M蛋白進(jìn)行翻譯后的加工修飾和分泌表達(dá)，具備完善的發(fā)酵方法，重組蛋白表達(dá)量高，自身滿(mǎn)足安全需要，已成功生產(chǎn)了多

10、種重組蛋白。酵母也成為重組漆酶的主要表達(dá)宿主，Trametessanguinea、Trametesversicolor、MelanocarpusAlbomyces、M.thermophila、Pleurotusostreatus、TrametesVersicolor等產(chǎn)漆酶的菌株的重組基因均被報(bào)道在酵母S.cerevisiae中表達(dá)。外源漆酶基因在酵母中表達(dá)會(huì)受很多因素影響，如啟動(dòng)子、信號(hào)肽、漆酶基因、表達(dá)菌株型號(hào)和發(fā)酵條件等。有報(bào)道表明在S.cerevisiae中表達(dá)漆酶時(shí)采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子比組成型啟動(dòng)子能獲得更高的表達(dá)量，采用a因子信號(hào)肽一般比漆酶本地信號(hào)肽得到更好的表達(dá)效果；另外，發(fā)酵方式

11、、溫度、pH值等對(duì)表達(dá)影響很大。其次，絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)是另一種用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品的工具，其優(yōu)勢(shì)在于其具有分泌大量胞外蛋白質(zhì)的能力。目前，真菌漆酶已在黑曲霉(A.niger)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)里氏木霉(T.reesei)中進(jìn)行了異源表達(dá)的研究，最高表達(dá)量可達(dá)7000U/L。但與酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，酶活相對(duì)較低，為了提高漆酶的表達(dá)量，研究者對(duì)絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)，比如選擇來(lái)源于絲狀真菌自身的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體，通過(guò)構(gòu)建融合蛋白提高漆酶的分泌水平，或抑制絲狀真菌自身的蛋白酶系統(tǒng)，以降低對(duì)異源漆酶蛋白的水解等等。結(jié)論生物降解木質(zhì)素是一種趨勢(shì)，利用生

12、物方法漂白紙漿、處理廢水、去除木質(zhì)素不僅污染小，而且使用效率高，能耗低，雖然其效率受諸多因素的影響，隨著科技的發(fā)展，人類(lèi)對(duì)木質(zhì)素降解機(jī)制的認(rèn)識(shí)越來(lái)越清楚，我們有理由相信，漆酶的研究和應(yīng)用將取得重大進(jìn)步。參考文獻(xiàn)1DeepakPantAEAlokAdholeya.ConcentrationoffungalligninolyticenzymesbyultrafiltrationandtheiruseindistilleryeffluentdecolorizationJ.WorldJMicrobiolBiotechnol,2009,25:1793-800.王紅.論白腐真菌產(chǎn)木質(zhì)素降解酶在環(huán)境治理中的

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