1、生化(shn hu)分離工程第二章 生化分離(fnl)技術(shù)共三十六頁(yè)破碎(p su)緩沖液一般為0.1-0.2mol/L，pH為78的磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液（與細(xì)胞(xbo)內(nèi)環(huán)境相似）抗氧化劑：含二硫鍵的蛋白質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)：高度還原；外界氧化環(huán)境。eg.二硫蘇糖醇DTT，2-巰基乙醇 2-BME，半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH （還原型）酶抑制劑：針對(duì)性添加，絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF、巰基蛋白酶抑制劑碘乙酸、金屬蛋白酶EDTA，etcPVP：植物組織的破碎過程化中常用聚乙烯吡咯烷酮PVP吸收酚類物質(zhì)（酚類物質(zhì)會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合形成沉淀）共三十六頁(yè) 細(xì)胞(xbo)破碎（Cell disrupt

2、ion）細(xì)胞的結(jié)構(gòu)動(dòng)物/植物和微生物：前者沒有細(xì)胞壁，只有脂質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成的柔軟的細(xì)胞膜，易于破碎細(xì)菌：革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁比陰性菌的細(xì)胞壁堅(jiān)固Why？較難破碎。酵母或其他真菌(zhnjn)：胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，比革蘭氏陽(yáng)性菌的胞壁厚共三十六頁(yè)G+：典型(dinxng)金黃色葡萄球菌，肽聚糖60-95%G-：典型E.Coli，肽聚糖10%不同類型細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分：細(xì)胞壁組成G+G-肽聚糖60-95%10%磷壁酸有0類脂質(zhì)一般無(wú)約20%蛋白質(zhì)0較高酵母菌：由甘露聚糖、蛋白質(zhì)和葡聚糖組成的“三明治”結(jié)構(gòu)(jigu)，其中葡聚糖主要維持細(xì)胞壁強(qiáng)度共三十六頁(yè)4.1 細(xì)胞破碎(

3、p su)技術(shù)細(xì)胞破碎的目的：使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同程度的破壞（增大通透性）或破碎，釋放其中(qzhng)的目標(biāo)產(chǎn)物機(jī)械法非機(jī)械法珠磨法、壓榨法高壓勻漿、超聲破碎、撞擊法固體剪切作用液體剪切作用1）酶溶法2）化學(xué)法3）物理法干燥處理溶胞作用超臨界細(xì)胞破碎共三十六頁(yè)1、機(jī)械(jxi)方法破碎1）珠磨法（bead milling） ：細(xì)胞懸浮液與極小的研磨劑如玻璃小珠、石英砂等一起高速(o s)攪拌，細(xì)胞與研磨劑之間相互碰撞、剪切，使細(xì)胞達(dá)到某種程度破碎，釋放內(nèi)含物可采用間歇式或連續(xù)操作珠磨機(jī)增加裝珠量、延長(zhǎng)破碎時(shí)間、提高轉(zhuǎn)速等手段可提高破碎率總能耗增加且須注意換熱適用于多數(shù)微生物細(xì)胞，esp.

4、有大量菌絲體的微生物（藻類和真菌菌絲）和質(zhì)地堅(jiān)硬（亞細(xì)胞器）的微生物細(xì)胞共三十六頁(yè)2）高壓(goy)勻漿法（ high-pressure homogenization ）破碎原理：利用高壓使懸浮液通過針形閥，從閥座與閥之間的環(huán)隙高速(o s)噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速(o s)撞擊后，急劇釋放到低壓環(huán)境破碎作用力：突然減壓和高速?zèng)_撞閥座閥撞擊環(huán)操作參數(shù)少且易于確定，實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)生產(chǎn)中均可適用于酵母和多數(shù)細(xì)胞的破碎對(duì)易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌及一些易損傷勻漿閥、質(zhì)地堅(jiān)硬的亞細(xì)胞器一般不適用共三十六頁(yè)3）超聲波破碎(p su)（ultrasonication）機(jī)理(j l)：高于20kH

5、z的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產(chǎn)生和閉合，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。缺點(diǎn)：A、影響因素多，細(xì)胞種類、濃度和處理時(shí)間、探頭材料和形狀；B、有效能量的利用率低；C、產(chǎn)熱大，需控溫；D、不易放大，僅應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎。共三十六頁(yè)機(jī)械(jxi)破碎法總結(jié)以上幾種(j zhn)機(jī)械破碎法的作用機(jī)理不盡相同，有各自的適用范圍（包括菌體細(xì)胞、細(xì)胞發(fā)酵液的特性）和處理規(guī)模（實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)用）方法珠磨高壓勻漿超聲破碎使用規(guī)模實(shí)驗(yàn)室、工業(yè)用實(shí)驗(yàn)室、工業(yè)用實(shí)驗(yàn)室適用對(duì)象酵母、藻類及絲狀真菌酵母菌、細(xì)菌細(xì)菌共三十六頁(yè)2、細(xì)胞物理破碎(p su)方法1）滲透壓沖擊法（osmotic sho

6、ck）最為溫和(wnh)的一類細(xì)胞破碎方法，適用于易于破碎的細(xì)胞，eg.動(dòng)物細(xì)胞和革蘭氏陰性菌。細(xì)胞于高滲介質(zhì)中？脫水達(dá)到平衡后，迅速將其轉(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖液中，水進(jìn)入細(xì)胞使胞壁和胞膜破裂2）凍結(jié)融化法（Freezing and Thawing）細(xì)胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，反復(fù)操作多次使細(xì)胞破壞，對(duì)于存在于細(xì)胞質(zhì)周圍靠近細(xì)胞膜的胞內(nèi)產(chǎn)物釋放較為有效共三十六頁(yè)3、化學(xué)法破碎(p su)用某些(mu xi)化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些(mu xi)組分酸堿、某些表面活性劑及脂溶性有機(jī)溶劑都可改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇性地滲透出來(lái)化學(xué)滲透法利用酸堿調(diào)pH；有機(jī)溶劑甲苯；

7、表面活性劑十二烷基磺酸鈉、Triton X-100；螯合劑乙二胺四乙酸EDTA等優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清A、價(jià)格昂貴，引起新的污染；B、一般只有有限的破碎，比機(jī)械破碎速度低、效率差，常需與機(jī)械法連用。共三十六頁(yè)4、生物(shngw)法破碎原理：利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大(zn d)胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性溶菌酶lysozyme適用于G的細(xì)胞壁，若配合EDTA、TritonX-100則可有效作用于G的胞壁；真核細(xì)胞需用不同的酶：酵母細(xì)胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖酶；破壞植物細(xì)胞壁需用纖維素酶優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)品釋放的選

8、擇性高、產(chǎn)品破壞少、對(duì)溫度及pH等外界條件要求低，不殘留細(xì)胞碎片等，不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)決定了需要不同的酶共三十六頁(yè)4、生物(shngw)法破碎自溶：通過調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機(jī)溶劑等激活劑，誘使細(xì)胞產(chǎn)生(chnshng)溶解自身酶的方法溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法但其高成本和有限的適用性使該法不可能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用，esp.G-的酶溶更受到了限制共三十六頁(yè)5、超臨界細(xì)胞(xbo)破碎技術(shù)超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上的流體，具有類似于氣體(qt)的性質(zhì)（低黏度）和類似于液體的高密度，具有較好的流動(dòng)性能、傳質(zhì)性能和溶解性能利用超臨界CO2做介質(zhì)，高壓CO2易于滲透到細(xì)胞內(nèi)。突然降壓后，因細(xì)

9、胞內(nèi)外較大的壓差使細(xì)胞急劇膨脹而發(fā)生破裂可破碎細(xì)胞壁較厚的細(xì)胞如酵母甚至對(duì)粘稠的酵母漿都有很好的破碎效果共三十六頁(yè)破碎(p su)方法的選擇選擇的一般原則A、提取產(chǎn)物(chnw)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，用機(jī)械法破碎B、提取產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，用化學(xué)法C、提取產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機(jī)械法結(jié)合的方法 破碎過程中應(yīng)注意的問題A、多種破碎方法相結(jié)合可產(chǎn)生很大優(yōu)勢(shì)B、對(duì)下游分離技術(shù)的影響：破碎顆粒清除，產(chǎn)物分離純化C、在上游發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過程和環(huán)境對(duì)破碎難易程度影響D、菌種的培育及改造，胞內(nèi)產(chǎn)物 胞外產(chǎn)物共三十六頁(yè) 沉淀分離法： 通過調(diào)整溶液的理化參數(shù)來(lái)改變?nèi)軇┖腿苜|(zhì)的能量平衡，產(chǎn)生沉淀，從而

10、(cng r)將生化成分從溶液中分離。 具有濃縮和分離的雙重作用。 在蛋白質(zhì)、酶、多肽、核酸和其他細(xì)胞組分的回收和分離中應(yīng)用的很多。共三十六頁(yè)鹽析沉淀法有機(jī)溶劑沉淀(chndin)等電點(diǎn)沉淀法成鹽沉淀法高分子聚合物沉淀選擇性變性沉淀法共三十六頁(yè) 二、鹽析(yn x)沉淀法 鹽析法： 在高濃度中性鹽存在下，欲分離物質(zhì)在中性鹽水溶液中的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀。 早在19世紀(jì)鹽析法就被用于從血液中分離蛋白質(zhì)，目前該方法仍廣泛用來(lái)(yn li)回收或分離蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)。共三十六頁(yè)共三十六頁(yè) （一）基本原理 蛋白質(zhì)的溶解特性取決于其組成(z chn)、構(gòu)象、周圍環(huán)境的物理化學(xué)性質(zhì)以及溶劑的可

11、利用度。 這些性質(zhì)就本質(zhì)而言是水分子間的氫鍵和蛋白質(zhì)表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以易受溶液溫度、pH值、介電常數(shù)和離子強(qiáng)度等參數(shù)的影響。共三十六頁(yè) 蛋白質(zhì)在自然環(huán)境(z rn hun jn)中通常是可溶的， 表面：大部分是親水基團(tuán) 內(nèi)部：大部分是疏水基團(tuán)蛋白質(zhì)呈穩(wěn)定(wndng)的分散狀態(tài)兩性物質(zhì)，一定pH下表面帶有一定的電荷，靜電斥力作用使分子間相互排斥蛋白質(zhì)周圍的水分子有序排列，在表面形成水化膜，這一層能保護(hù)蛋白質(zhì)粒子避免因碰撞而聚沉。共三十六頁(yè) 當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液(rngy)中加入中性鹽時(shí)：低鹽-鹽溶(低鹽情況下，隨著中性鹽離子強(qiáng)度(qingd)的增加，蛋白質(zhì)溶解度增大)高鹽-鹽析

12、(高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度隨之減小)鹽離子部分中和蛋白質(zhì)的電性，使分子間排斥作用減弱中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，鹽離子在水中發(fā)生水化作用從而使蛋白質(zhì)脫去水化膜，暴露出疏水區(qū)域共三十六頁(yè) 蛋白質(zhì)在水中的溶解度不僅與中性鹽離子的濃度有關(guān)(yugun)，還與離子所帶電荷數(shù)有關(guān)，高價(jià)離子影響更顯著。 通常用離子強(qiáng)度表示對(duì)鹽析的影響。共三十六頁(yè) （三）影響(yngxing)鹽析的各種因素 無(wú)機(jī)鹽的加入量蛋白質(zhì)的濃度溫度(wnd)pH操作方式共三十六頁(yè) 6.鹽析(yn x)法的優(yōu)缺點(diǎn)（1）優(yōu)點(diǎn)(yudin)： 室溫下沉淀物在硫酸銨鹽析溶液中長(zhǎng)時(shí)間放置不會(huì)失活，且無(wú)機(jī)鹽不容易引起蛋白質(zhì)變性失活； 非蛋白的雜質(zhì)

13、很少被夾帶沉淀； 適用范圍廣，幾乎所有蛋白質(zhì)和酶都能采用 設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便。共三十六頁(yè) （2）缺點(diǎn)： 沉淀物中含有大量鹽析劑 硫酸銨容易分解產(chǎn)生(chnshng)氨的惡臭味，產(chǎn)品不能直接用于醫(yī)藥上 鹽析法可以作為(zuwi)初始的提取方法，再與多種精制手段結(jié)合起來(lái)，如采用超濾、凝膠色譜、透析等方法將無(wú)機(jī)鹽去除，就可制得高純度產(chǎn)品。共三十六頁(yè) 二、有機(jī)溶劑沉淀法 在蛋白質(zhì)等生物大分子的水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，能顯著降低蛋白質(zhì)等生物大分子的溶解度，使其沉淀析出。 不同蛋白質(zhì)沉淀時(shí)所需有機(jī)溶劑的濃度(nngd)不同，因此調(diào)節(jié)有機(jī)溶劑的濃度(nngd)，可以使混合物中的蛋白質(zhì)分段析出，達(dá)

14、到分離純化的目的。 不僅適于蛋白質(zhì)的分離純化，還常用于酶、核酸、多糖等的分離純化。共三十六頁(yè) 常用于生物(shngw)大分子沉淀的有機(jī)溶劑： 甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮等， 其中乙醇是工業(yè)上最常用的共三十六頁(yè) （二）影響沉淀(chndin)效果的因素 溫度(wnd)pH濃度蛋白質(zhì)濃度共三十六頁(yè)5.有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)（1）優(yōu)點(diǎn)： 乙醇等有機(jī)溶劑易揮發(fā)除去，不會(huì)殘留于成品中，產(chǎn)品更純凈（不需要脫鹽處理）； 有機(jī)溶劑密度低，沉淀物與母液間的密度差較大，分離(fnl)容易，適于用離心分離(fnl)收集沉淀物。共三十六頁(yè)（2）缺點(diǎn)： 容易使蛋白質(zhì)變性，操作需要在低溫下進(jìn)行，使用上有一定的局限； 采用大

15、量有機(jī)溶劑，成本較高。 為節(jié)省用量，通常將蛋白質(zhì)溶液適當(dāng)濃縮，并回收溶劑。 有機(jī)溶劑易燃易爆，工業(yè)生產(chǎn)上車間和設(shè)備(shbi)都應(yīng)有防護(hù)措施。共三十六頁(yè) 1.等電點(diǎn)沉淀法 兩性物質(zhì)在pH=pI時(shí)，分子表面凈電荷為零，分子間靜電排斥作用減弱，因此吸引力增大，能相互聚集(jj)，發(fā)生沉淀。 不同的兩性物質(zhì)，pI不同，如不同蛋白質(zhì)。根據(jù)這一特性，用依次改變?nèi)芤簆H的方法可將不同的蛋白質(zhì)分別沉淀析出，達(dá)到分離純化的目的。共三十六頁(yè)H+OH-+pHpI,帶負(fù)電，有水膜，是穩(wěn)定的親水膠體_+_pH=pI時(shí), 有水膜，是不穩(wěn)定的親水膠體中性鹽破壞水膜+中性鹽破壞(phui)水膜_+_中性鹽破壞水膜_中性鹽中

16、和電荷SO42-中性鹽中和電荷NH4+或Na+蛋白質(zhì)的鹽析(yn x)機(jī)制示意圖蛋白質(zhì)沉淀共三十六頁(yè) 只適用于水化程度不大、在pI時(shí)溶解度很低的兩性物質(zhì)，如酪蛋白。 對(duì)于親水性很強(qiáng)的兩性物質(zhì)，在pI及pI附近仍有相當(dāng)?shù)娜芙舛龋迷摲ǔ恋聿煌耆?，而且許多生物(shngw)分子的pI很接近，因此很少單獨(dú)使用。 往往與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀方法結(jié)合起來(lái)。 采用該法時(shí)必須注意： 溶液pH不會(huì)影響到目的物質(zhì)的穩(wěn)定性。共三十六頁(yè) 等電點(diǎn)沉淀法可用于所需物質(zhì)的提取，也可用于沉淀除去雜蛋白及其他雜質(zhì)，實(shí)際工作中普遍采用該方法作為去雜手段。 如在工業(yè)上生產(chǎn)胰島素時(shí)： 先調(diào)pH至8.0去除堿性(jin xn)雜蛋白，再調(diào)pH至3.0去除酸性雜蛋白。粗酶液經(jīng)過這樣的處理后純度大大提高，有利于后面的操作。共三十六頁(yè)內(nèi)容摘要生化分離工程。一般為0.1-0.2mol/L，pH為78的磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液（與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相似）。PVP：植物組織