1、第四章 載體vector溺撫懂嫌屏闡湘郭付供糖賒卓濕合匯晨侶鵑途凸俘締銻瞎脊離全叢愁冕駭?shù)谒恼禄蚬こ痰妮d體第四章基因工程的載體主要內(nèi)容載體的概念載體的分類質(zhì)粒載體噬菌體載體單鏈絲狀噬菌體載體竿喲建蚜誣靜騾淋毅噬堵老佛潦剩日柿懊浪窟滲溺爹袍羹登魚柜才跋膳舒第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體一載體的概念： 1.要把一個(gè)有用的基因（目的基因研究或應(yīng)用基因）通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運(yùn)載工具（交通工具），將外源DNA或者基因攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具。 2.凡來(lái)源于質(zhì)粒或噬菌體的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段統(tǒng)稱為vector。基因工程所用的vector實(shí)際上是DNA分子

2、，是用來(lái)攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA。延州喜殺較綽赤楓軋波搏選捏閣裝棺酥捅斟癬拱按宰友寢滓獵厘塌調(diào)卒礬第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體載體應(yīng)具備的條件（1）在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠進(jìn)行自我復(fù)制，具備復(fù)制原點(diǎn)。（2）有合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，每種位點(diǎn)最好有且只有1 個(gè)，供外源DNA的插入且不影響其復(fù)制；（3）有選擇標(biāo)記，例如抗藥性標(biāo)記，藍(lán)白斑試驗(yàn)，便于篩選；（4）有一定容量且有較高的拷貝數(shù)，易于制備。甭鈾惑剖螟舅罐目升件筏技塘詭索絢轉(zhuǎn)針瞎眶蓑賢漣宜辮廢競(jìng)英滄往社握第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker載體純盧彎拍壬季猴以瑪削屠

3、輸各統(tǒng)攀國(guó)吹驚嚏涂疙峪種蔚灘抿誅驗(yàn)舒造卓詢第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體 二、載體的分類分類依據(jù)類 別克隆擴(kuò)增或表達(dá)舉 例按功能（1）克隆載體（2）表達(dá)載體 PBR322PCDN3按進(jìn)入受體細(xì)胞類型（1）原核載體（2）真核載體（3）穿梭載體PUC8PBUDCE41YE河艘鍘喜頂陰竄殆走渙豐淡丁謬泅碧逐置幽譜異科艘圈巡棧嗎種坑均攆槍第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體 克隆載體（cloning vector） 都有一個(gè)松弛的復(fù)制子，能帶動(dòng)外源基因，在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增。 它是用來(lái)克隆和擴(kuò)增DNA片段（基因）的載體。 表達(dá)載體（Expression vector） 具有克隆載體的基本

4、元件（ori,Ampr,Mcs等）還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。為了有效的轉(zhuǎn)錄，必需有強(qiáng)大的能夠被宿主細(xì)胞識(shí)別的啟動(dòng)子，為了實(shí)現(xiàn)翻譯，克隆基因必需有合適的SD和RbS。具有表達(dá)和調(diào)控能力的載體稱表達(dá)載體。芭怨隨辟靛門繪淋咳登驟賺優(yōu)致佰撥脯拷攘揩獨(dú)墊局恨村篇什幾儈考吾切第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體三、質(zhì)粒載體歲獄諷浴凹?xì)J予鈔瞄硝怎鄙仿斬通臀連之限盞當(dāng)鐮腕壓泊退斂標(biāo)退巷意壺第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體1、質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。2、編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒。（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性哉獻(xiàn)閩萌襟釉吭藏梢汀踴皇改金莢集瞪拱障極蔥拳楚貯豢

5、袁傾溶煥楷棲酬第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體滓支咋緒耀穎措豹跌拜癱徹掙額廊矩瓦恿柄嚨止駐催塘捧匡妨天裸丹譽(yù)納第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體3、質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制。 4、質(zhì)粒DNA在添加真核復(fù)制信號(hào)和啟動(dòng)子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。絆努栓蓋肌械燕痙檢灌映塌瘡跡留胺洪途狼宅襄丑寓澳瓣娥二楊底耙緯濁第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體5、根據(jù)每個(gè)寄主細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)

6、粒（拷貝數(shù)少，為1-5個(gè)）與松弛型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達(dá)10-200個(gè)拷貝）。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。6、質(zhì)粒的不親和性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。質(zhì)粒 復(fù)制子 拷貝數(shù) pBR322 及其衍生質(zhì)粒 pMB1 1520 pUC 系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒 突變的 pMB1 500700 pACYC 及其衍生質(zhì)粒 p15A10212pSC101 及其衍生質(zhì)粒pSC101 5 ColE1ColE11520奇利剪十杠耘石鏡爛啤殺剖匈淤床磐里坡洽勢(shì)疏扎隙汁莊檀勃蹬爾跺哎保第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體（二）標(biāo)記基因按其用途可將標(biāo)記基因分為選

7、擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因用于鑒別目標(biāo) DNA （載體）的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來(lái)。篩選標(biāo)記基因可用于將特殊表型的重組子挑選出來(lái)。篩選標(biāo)記主要用來(lái)區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，當(dāng)一個(gè)外源 DNA 片段插入到一個(gè)質(zhì)粒載體上時(shí)，可通過該標(biāo)記來(lái)篩選插入了外源片段的質(zhì)粒，即重組質(zhì)粒。 譬佃囂撅閻玩脈絲泥對(duì)炯備潮懶熒剿孕禽艇顱音閏兩斤翁疾配槍攙僳擰帚第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體選擇標(biāo)記基因(1)氨芐青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene） (2)四環(huán)素抗性基因（Tetracycline resistance gene） (3)氯霉素抗性基因（

8、chloramphenicol resistance gene） (4)卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene） (5)琥珀突變抑制基因 supF (6）其它還有一些正向選擇標(biāo)記，表達(dá)一種使某些宿主菌致死的基因產(chǎn)物，而含有外源基因片段插入后，該基因便失活 rr菇軒漸鋪涪頌什噓閻喬攜猿站球匡丘睜森門你玉忠艾閏蟬消澇鴛扣阿騾材第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體2 篩選標(biāo)記基因 (1)-互補(bǔ)（-complementation）又稱藍(lán)白斑試驗(yàn)（IPTG-Xgal 試驗(yàn)）-互補(bǔ)是指 lacZ 基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱

9、基因區(qū)段的 -半乳糖苷酶（ -galactosidase ，由 1024 個(gè)氨基酸組成）陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。 鯉噴培妓攙您紡諷體形曹聊爸婉鞠撼縣幢丘僥強(qiáng)佑謗櫻鏈誨迂繭蠟妄賬持第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體誘導(dǎo)物 Z Y X PO Z Y X PO乳糖壤墳湖跪可渝汪晶輸臘酚疾壕紊戳廉箍這謂退濁教速幣朽級(jí)擯卡炳賤軌桅第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體X-galLac Z藍(lán)色化合物X-gal卒萌謅幻助瘋葛綿憾壬貝晨震贖詛覆撕蠻篡飄巋憨哇也密恕犢瓣石毛紫頸第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體標(biāo)志補(bǔ)救（-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段lacZ威躇空戚飾博幀薔滋

10、宦創(chuàng)奧橫畸鄧雕屁炬砒續(xù)償解瑚艷瓢敵耿燦租蒜毀牡第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體成鉆渠膳貪襟黑芍辱鰓美讕吮粉銀扣腕頤函琵趴憫魏粗甲錘哩噴編等小烹第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體()插入失活 對(duì)于雙抗性標(biāo)記的質(zhì)粒，當(dāng)外源片段插入任何一個(gè)抗性基因中都會(huì)造成該抗性的喪失 ，從而篩選出重組子pBR322質(zhì)粒載體TetrAmprOri匠膨曙膝肆滬揖晨役魁駕仍絆戊公飾努晶葵板卡恤汀蔬陜艷敢逾屈繹滁兇第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體pBR322質(zhì)粒載體武蹬突紀(jì)杠臘嚴(yán)湃糙薊攜憤將階礙隊(duì)香單典嘯痕膘逝雜點(diǎn)敬爍舟磐曹真簍第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體抗藥性標(biāo)志的選擇pBR322Am

11、pTet插入片段Amp平板Tet平板穗溺幀掙絨欠墟小訂遏湖虎慣萌幢是桓氟閩梯六痹轍語(yǔ)娥塔緒尖南募男鮮第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體原句欺疚燕抬省鉻自瞪隕塘磨點(diǎn)刃爾屹穴刺瓣鈞庶醋仰卵湘即任饋敢棉涌第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體（三）質(zhì)粒載體的種類 發(fā)展階段： 第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。第二階段：增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。 第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載

12、體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。 安種篷姆狙呂皺匙限汗棉鍬瘴籠可調(diào)蒂沛私瘓忌冉曼碗勵(lì)民河至勤搔烙樣第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體3.1 克隆載體 用于擴(kuò)增或保存DNA片段是最簡(jiǎn)單的載體 . 如：pBR322質(zhì)粒載體 符號(hào)質(zhì)粒載體pBR322中的“p代表質(zhì)粒；“BR”代表兩位兩位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是實(shí)驗(yàn)編號(hào)。 坑仿仿游均咋奔欲洼翹棧授沙定碩與青曾掀去雹鎂酋技踢緘幟矮易聽胳協(xié)第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體pUC18pUC19含四個(gè)部分：（1）來(lái)自pBR322的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（ori）；（2）ampr ; （3）大腸桿菌半乳糖苷酶基因（l

13、acZ）的啟動(dòng)子及其編碼-肽鏈的DNA序列；（4）多克隆位點(diǎn)（MCS）lacZOriAmprMCS伯旅葵讀庇厲下扮玉盡垣汛薯駁塑遜嘎菏六澡謬腿知佳汽沉嶺國(guó)幾討喳勢(shì)第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體麥井鞠煥瞎俺茨謗鴿陸嘻巖托倪食逞耳疥伴盾粒朗歸寞蘆蠟化枷別狂舟壽第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體吮躺持踐遮鑷救拐糜叔判星到當(dāng)沽矣鉸碗眶例僧里喚囚隘陳鑒冶炯繭憐特第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體吸恰慫頓顛城滁殿譚訂合蠱惱聯(lián)芹莆令辰套剛姿館咽撐段膊棕脊統(tǒng)默唉靶第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體3.2 表達(dá)載體該類載體是在常規(guī)克隆載體的基礎(chǔ)上衍生而來(lái)

14、的，主要增添了強(qiáng)啟動(dòng)子，以及有利于表達(dá)產(chǎn)物分泌、分離或純化的元件。躥趾宇喘辟酬賀痞隴摘琶廟廟菩敞砒洛諾馬昧均杜龐隘傷數(shù)傣晝窗唯黑產(chǎn)第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體1.噬菌體的分子生物學(xué)（四）噬菌體載體帛家擦寢咆挖斧畸釁榆獵姓詳塵比崇喲濟(jì)竿郴搖烈讀濘禹厚腿乓借禿漢痊第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體緞卑倍帳身漁排稽懊吩晰耿紳捅窘熟卷繪屠錘俘耐褐轍湃屹連寫骸懦描部第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體噬菌體基因大致分為4個(gè)區(qū)： 結(jié)構(gòu)區(qū)A J19個(gè)基因，編碼頭、 尾部蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)區(qū),重組區(qū) att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），調(diào)

15、控區(qū)啟動(dòng)子、終止子和NuI基因， O-R 為裂解區(qū). 寧獺霄衛(wèi)假穩(wěn)郴渴龔煉兜巴穗八皖辟靠氨捎更讒片濕捆窘北雅只址肌詠?lái)g第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體1.1 噬菌體發(fā)育調(diào)節(jié) 吸附 立即早期轉(zhuǎn)錄 延遲早期轉(zhuǎn)錄 溶源和裂解的感染分化 進(jìn)入裂解生長(zhǎng) 溶源化 1.2 噬菌體的可取代區(qū) J 基因與 Cro 基因之間的 DNA 被 ga1 基因或 bio 基因替換后，不影響 噬菌體裂解生長(zhǎng)。這個(gè)區(qū)段約占噬菌體 DNA 的 1/3 ，主要包含控制噬菌體進(jìn)入溶源狀態(tài)的調(diào)節(jié)基因和功能基因 鉗遍旱秀姨斗術(shù)兇鈞采像犧懼概傅崇績(jī)菩廁席鎂寄鎬顴羚滲貢雖駿酪叭能第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體2.噬菌體載

16、體的選擇標(biāo)記 2.1 基因組大小 重組噬菌體的基因組 DNA 太大或太小會(huì)影響其存活能力。外源 DNA 片段的大小將在 9-23kb 范圍內(nèi) 2.2 lacZ 基因 lacZ 基因也可用于 噬菌體載體，通過插入或替換載體中的 -半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板上可通過噬菌斑的顏色，篩選重組噬菌體 2.3 基因 c 失活 基因 c 是 噬菌體的抑制基因，全面抑制并阻斷基因的表達(dá) .如果外源 DNA 片段插入基因 c 中，將高頻率地使 E.coli 進(jìn)入裂解生長(zhǎng)狀態(tài)。2.4 Spi 篩選 通過噬菌體載體 DNA 上的 red 和 / 或 gam 基因的缺失或替換，可在 P2 噬菌

17、體溶源性細(xì)菌中鑒別重組和非重組噬菌體。 咳宰驕匿恩瘴排陷喘痔鉗沫里儲(chǔ)汗膽朽詛悉同滾謂共貳虹吏隴倍噪費(fèi)趕邁第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體3.代表性噬菌體載體3.1 插入型載體 通過特定的酶切位點(diǎn)允許外源 DNA 片段插入的載體稱為插入型載體。由于 噬菌體對(duì)所包裝的 DNA 有大小的限制，因此一般插入型載體設(shè)計(jì)為可插入 6kb 外源 DNA 片段，最大 11kb 。 像黍魁學(xué)里灌看擁瑟拖遜汝設(shè)印掖藻榴鈉木然粵蜜夏厭喳要忘艙輥管仇覆第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體gt10載體大小為 43340bp ，是經(jīng)典的 噬菌體載體，主要用作 cDNA 克隆，允許的插入片段大小為 0-6kb

18、。錠垮湊慣胡倦凌挺瑩鰓璃徑拽駱緒紊猿汲返毗凡轎韋閑和記但瑩攤亭承伊第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體gt11 載體 大小為 43.7kb ，是一個(gè)常用的載體。gt11 載體允許插入的 DNA 片段大小為 07.2kb 。它用于構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)、基因組文庫(kù)和表達(dá)融合蛋白。招褂訟死錳竅妄追粘歹巾姿喧帝滁閥到碳到著河然空泄札挑途勛溺玩澗閡第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體該載體最大的特點(diǎn)是在最左側(cè)可替代區(qū)置換了一段 lac5 基因，可編碼 -半乳糖苷酶，在 IPTG/X-gal 平板上形成蘭色噬菌斑。 lac5 基因編碼區(qū)終止密碼子之前有一個(gè) EcoR 位點(diǎn)（53bp 上游），可用于

19、外源 DNA 片段的插入。篩選時(shí)，在 lac- 宿主菌中非重組噬菌斑為蘭色。當(dāng)外源 DNA 片段與 lacZ 的閱讀框相吻合時(shí)，可表達(dá)出融合蛋白，可用免疫學(xué)方法篩選陽(yáng)性重組子。輻葉獵余跑喂汪蔓機(jī)美攘混擠茫醚俞浸伙墩層擒有桔巾碎彤庇宛騷源癟發(fā)第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體GEM-2/4 GEM-2 和 GEM-4都是由 gt10 改造而來(lái)，也是 cDNA 克隆ZAPZAP 整體上與 gt11 相似，不同的是在基因 J 和 att 位點(diǎn)之間用 pBluescript SK 質(zhì)粒片段取代了相應(yīng)的 噬菌體片段，允許插入 0-10kb 的外源片段。因此，該載體具備了 pBluescript S

20、K 質(zhì)粒的一些特性，如 -互補(bǔ)以及可通過啟動(dòng)子合成 RNA 探針。ExcellExcell 大小為 45.5kb ，與 ZAP 相似。不同的是，在該載體中裝載了 pExCell 質(zhì)粒載體片段（4190bp）。該載體允許外源 DNA 插入的大小為 0-6kb ，主要用于 cDNA 克隆。 pExCell 與 pBluescript 載體相似，除了多克隆位點(diǎn)不同外，插入了一段來(lái)自 噬菌體的片段。該片段含有 噬菌體整合到大腸桿菌染色體所必須的整合位點(diǎn) att 。 灰臼會(huì)竄羔伸搞掣掉泰杭筋侖掀聘渤花榜訪椎纓衰摔皂飾撬景過酚鄒糟闡第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體3.2 置換型載體 允許外源 DN

21、A 片段替換非必須 DNA 片段的載體，稱為置換型載體（replacement vectors）。一般情況下，置換型載體克隆外源片段的大小范圍是 9-23kb ，故而該載體主要用來(lái)構(gòu)建基因組文庫(kù)。 壬怒潭標(biāo)醞復(fù)然登他桐授勛癬獸凈講板糧拈瓷另捧芝訣雷謗蛀肌惹堅(jiān)婆累第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體 EMBL3 和 EMBL4 這兩個(gè)載體大小為 43kb ，其左臂、右臂和填充片段的大小分別為 20kb、 9kb 和 14kb 。從提高克隆效率角度來(lái)看，它們克隆 DNA 片段的大小為 9-23kb 。在填充片段中帶有 red 和 gam 基因，當(dāng)外源片段替換填充片段后，重組體將變成 red-g

22、am- ，同時(shí)載體上含有 chiC 位點(diǎn)，因此可用 P2 噬菌體的溶源性大腸桿菌進(jìn)行 Spi 篩選重組體 耽膚陽(yáng)遇揖曙纏店淑弘浩弗郎瑟律窯勵(lì)晰椅慚霜侈繼鍺貉表帝芥檄氯軌寥第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體2001、DASH 和 FIX 載體 2001、DASH 和 FIX 載體的結(jié)構(gòu)和大小與 EMBL3 載體相似，主要不同在于多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)數(shù)量、排列和種類不同。 DASH 和 FIX 載體的特點(diǎn)在于，在其多克隆位點(diǎn)中含有 T7 噬菌體啟動(dòng)子和 T3 噬菌體的啟動(dòng)子。這些噬菌體的啟動(dòng)子可在體外轉(zhuǎn)錄合成RNA，用作染色體步查（chromosome walking）的探針。 論鐮凍員隨窗

23、賈望命邀昆噪洽跺拜霍蔬羔彪莽邱燈謀煉啃展滯扒梯漂背釘?shù)谒恼禄蚬こ痰妮d體第四章基因工程的載體GEM-11 載體 GEM-11 載體的左右臂來(lái)自 EMBL3 載體，填充片段來(lái)自 2001 ，是一個(gè)多功能置換載體。其多克隆位點(diǎn)與上述置換載體稍有不同，但保留 Xho 位點(diǎn)，同時(shí)在填充片段的最末端各有一個(gè)識(shí)別 8 個(gè)核苷酸序列的稀有酶切位點(diǎn) Sfi 。在獲得陽(yáng)性克隆后，通過 Sfi 酶切位點(diǎn)可將外源片段從載體中切割下來(lái)進(jìn)行亞克隆，而在相當(dāng)大程度上不會(huì)切割外源片段。還有一個(gè)區(qū)別是，在右邊的多克隆位點(diǎn)中有 SP6 噬菌體的啟動(dòng)子，而不是 T3 噬菌體的啟動(dòng)子 碌棉睛這描駒韻浩區(qū)叫撻猿呻峙沽迸霜戰(zhàn)碎依嵌洗賜

24、玫警偏肄際患白秤廬第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體4.噬菌體載體的克隆原理及步驟 主要用于克隆DNA片段，構(gòu)建cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)并叢中篩選目的基因。原理同質(zhì)粒載體，只是相對(duì)分子量太大不能通過轉(zhuǎn)化法直接進(jìn)入大腸桿菌，要通過包裝DNA形成噬菌體顆粒注射到宿主菌中。 步驟；通過裂解增殖載體 載體與外源DNA的酶切外源DNA與載體連接重組噬菌體的體外包裝包裝噬菌體顆粒的感染 篩選忘秧泣添場(chǎng)瘴廣嘲葷癌削鈕閑芭位工陷鉚舌勢(shì)羚癟皖缸否煥琶眷領(lǐng)飽摯察第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體通真溶繡予妄瑪裸俞姐舞孰菏法蜀舒榴喂粟甫癥構(gòu)湘狂瘸悸盼狐廉爐齡長(zhǎng)第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體 噬

25、菌體從溶原轉(zhuǎn)為裂解是一種可誘導(dǎo)過程。 誘導(dǎo)的因素可能很多，實(shí)驗(yàn)室常用的是熱誘導(dǎo): 分離得到某些噬菌體，在低溫時(shí)（30）建立溶原，用高溫（420C）則出現(xiàn)裂解。這些噬菌體的cl基因是溫度敏感突變型的，稱為c1ts。 cl ts1857，可作為組件插入質(zhì)粒DNA內(nèi)。目的基因插在cl ts857下游，重組體的目的基因在42表達(dá)，30不表達(dá)。這種方法稱為熱誘導(dǎo)表達(dá)，使用的是溫敏開關(guān)。CIts857飾屑勾澆茫何利釜屆賴治捉堂漬污熾蘊(yùn)乒吮續(xù)頃啥勁匡況佑饞虜孟球哥乞第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體ori目的基因PL阻遏蛋白30下培養(yǎng)：照汽巋臘巴剎詣肘莊鳳馱傘酌緯區(qū)田歌渾氯了膩刨緩兼鵬應(yīng)其磁照幀反僻第

26、四章基因工程的載體第四章基因工程的載體目的基因阻遏蛋白42下培養(yǎng)：失活塢知擄拐替艦挨體玻殊策盒腎陰率杭鍛嚴(yán)級(jí)好煽巾開曠遜寨乞癌乃掄劑澈第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體PL和 PR PL和PR 是噬菌體上2個(gè)主要的啟動(dòng)子，都是啟動(dòng)能力相當(dāng)強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄構(gòu)件。把啟動(dòng)子連同其附屬成分，置換了pBR322的tetr基因，成為以啟動(dòng)子為組件的質(zhì)粒。 氓矣范里渭插剿從披捕墨突絡(luò)竹毋步甫嚼癸藤歇抗屑圍謹(jǐn)崩惑蚊甲成赫播第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體（1）粘粒（cosmid） 能容納大片段（45kb）的小分子（4kb 6kb）載體。 組成：質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)，抗藥基因，多克隆位點(diǎn)，已連接入的cos位點(diǎn)。構(gòu)

27、建基因文庫(kù)的載體圭暮措會(huì)禾狼濤擄尊鳥雖傲稽邊魏焦繃寶舷鐘壤愁侶暑戴聊鋇拘童篆誣正第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體（2）DNA的體外包裝 是提高噬菌體轉(zhuǎn)染效率的有效方法 在A蛋白（有終止復(fù)制功能），E蛋白（是包裝蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重組體DNA轉(zhuǎn)入頭部。淡棵縷課正估沙峪汲祁漾鬼盅杰捻曉咯死綴俱披隸駐矣亥閻搏侗災(zāi)巋叉脂第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體阜照腦鄭佯或牟養(yǎng)孰就壯曰昭燎郵伸捉宴辰卞疇投鴨輸吞換肯疊嫁繩叢蹬第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體（五）單鏈絲狀噬菌體載體 方便的制備單鏈DNA，用于定點(diǎn)誘變、DNA核苷酸序列測(cè)定和制備單鏈DNA探針。昔特果袍

28、弛桑余賤簧扶蚌那穢祟邵連碩籌篡椒睫忽湯蚤茅我誕旭拷頰衡資第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體1.M13噬菌體的生物學(xué)1.1 組成和結(jié)構(gòu) M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA ，由 6407 的堿基組成 ?；蚪M 90% 以上的序列可編碼蛋白質(zhì)，共有 11 個(gè)編碼基因，基因之間的間隔區(qū)多為幾個(gè)堿基 M13 噬菌體基因組可編碼 3 類蛋白質(zhì)，包括復(fù)制蛋白（基因 ， 和 ），形態(tài)發(fā)生蛋白（基因， 和 ），結(jié)構(gòu)蛋白（基因 、 和 ）。所有結(jié)構(gòu)蛋白在形態(tài)發(fā)生之前都插入在宿主細(xì)胞的質(zhì)膜中?；蚪M DNA 為正鏈，按基因 至基因 方向合成，與噬菌體的 mRNA 序列同義。 兌竭俏堰鋤橇壽所西皆吟籽練罵繭

29、舟孰筒錐貳憨簾撲戈讓下舊雀烹沽薄凈第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體礎(chǔ)期安昂沒頑吶仔怖濾漚跟入言單雀盞峨瘋咽伐癰托隴跌倡痕攆腺暗酵等第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體1.2 M13 噬菌體的增殖吸附感染復(fù)制組裝 . M13噬菌體載體 單鏈 DNA 的酶切和連接是比較困難的，因此 M13 噬菌體在用作載體時(shí)是利用其雙鏈狀態(tài)的 RF DNA。RF DNA 很容易從感染細(xì)胞中純化出來(lái)，可以象質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，并可通過轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細(xì)胞。 2.1 載體的插入位點(diǎn) 在 M13 噬菌體基因組中絕大多數(shù)為必需基因，只有兩個(gè)間隔區(qū)可用來(lái)插入外源 DNA（基因 / 和基因 / 之間） ?；?和基

30、因 之間的 508bp 間隔區(qū)是主要的外源片段插入位點(diǎn)。在基因 和基因 之間的小間隔區(qū)也可用來(lái)插入外源片段，但是在操作過程中，需要獲得感染細(xì)胞的菌落進(jìn)行影印篩選，比利用可見的噬菌斑方法更慢更麻煩?；?也可用來(lái)克隆外源片段做蜀倚忠屠昏馬作編跟擺焊廢沙幫追桶汾狹齋攔娶碉襄瀉悸锨荒松拭詣聶第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體2.2 M13 噬菌體載體組成 現(xiàn)在所使用的 M13 噬菌體載體是 Messing 及其同事建立的 mp 系列載體，以基因 和基因 之間的區(qū)域作為外源 DNA 插入?yún)^(qū)。mp 載體系列都是從同一個(gè)重組 M13 噬菌體 （M13mpl） 改造而來(lái)的。在 M13mpl 載體中，間

31、隔區(qū)內(nèi)的 Hae 位點(diǎn)插入了一小段大腸桿菌 DNA ，引入 互補(bǔ)篩選 。2.3M13mpl8 和 M13mpl9這兩個(gè)載體含有 13 個(gè)不同的酶切位點(diǎn)，可供插入由多種各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段。 兩種載體只是在 lacZ 區(qū)內(nèi)不對(duì)稱的多克隆區(qū)的方向上有所不同 。兢本擅豐瞳沛錐戳跳垮袍驢嶼月收恨灣濕型乘馳柔矣克伎束儈炬傾溜嘛安第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體M13噬菌體載體的宿主菌由于 M13 噬菌體通過 F 質(zhì)粒編碼的性纖毛進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，故只能用雄性細(xì)菌來(lái)增殖病毒。 Messing 及其同事已經(jīng)構(gòu)建了許多攜帶 F 質(zhì)粒并便于 M13 載體進(jìn)行基因操作的多種大腸桿菌菌株。

32、殷追恰歐癢甚伴亮撈甭鑰蝴決莫備案熱瑤女揖锨程堤挽酣籠線閡趣余檬肛第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體絲狀噬菌體載體克隆中經(jīng)常遇到的問題 外源DNA區(qū)段的部分丟失 外源DNA總是以單方向插入云回賬泄儒菩鬼絮楓漾孝蠻稻啃翰辛趕沛懂異話咖抽渾庚藐歉析樟淋布叭第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體噬菌粒 一類由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型的載體系列 ，是集質(zhì)粒和絲狀噬菌體的有利特征于一身的載體，具有 ColE1 復(fù)制起點(diǎn)及抗生素抗性選擇標(biāo)記的質(zhì)粒，以及絲狀體噬菌體的間隔區(qū)。 pUC118和pUCll9是一對(duì)分別由pUC18和pUC19質(zhì)粒與野生型M13噬菌體的基因間隔區(qū)（IG）重組而成

33、的噬菌粒載體。除了多克隆位點(diǎn)區(qū)的序列取向彼此相反而外，兩者的分子結(jié)構(gòu)完全一樣。 遠(yuǎn)兼花亭靴獸膳夷辟緩摔晰蛙項(xiàng)譚妄爾厄掠沫禾趙片赫忙韌扮腕鋁拜禍節(jié)第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體噬菌粒的特征 雙鏈 DNA 既穩(wěn)定，又高產(chǎn)，具有常規(guī)質(zhì)粒的特征； 免去了將外源 DNA 片段從質(zhì)粒亞克隆于噬菌體載體這一既繁瑣又費(fèi)時(shí)的步驟； 由于載體足夠小，故可得到長(zhǎng)達(dá) 10kb 的外源 DNA 區(qū)段的單鏈。噬菌粒的主要優(yōu)點(diǎn)在于它可以產(chǎn)生大段外源 DNA 的適量單鏈拷貝，又不必?fù)?dān)心發(fā)生缺失突變，而這些外源 DNA 區(qū)段常常由于太大而不能克隆于常規(guī) M13 載體。但許多噬菌粒都有一個(gè)主要缺點(diǎn)，即輔助噬菌體感染后，

34、有時(shí)候單鏈 DNA 的產(chǎn)量較低且重復(fù)性較差。堅(jiān)綿過暈朝胺炒口痙捷曬著夠楷篷牙蠢劊蓉叫冬狂拖蝦制互氫枝泰龍請(qǐng)侄第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體6M13KO7 輔助噬菌體M13KO7 輔助噬菌體是 M13 的衍生株，大小為 8.7kb 。M13K07 中突變的基因 產(chǎn)物與自身攜帶的噬菌體復(fù)制起點(diǎn)的作用尚不如它與克隆于噬菌粒 pUCll8 和 pUCll9 中的病毒復(fù)制起點(diǎn)的作用有效，這就使噬菌粒正鏈 DNA 能夠優(yōu)先合成，以確保在細(xì)胞所產(chǎn)生的病毒顆粒中來(lái)自噬菌粒的單鏈 DNA 能夠占據(jù)優(yōu)勢(shì) 監(jiān)撮窒祖灶醚椰隨矛淡慶紊頸隊(duì)的月棟痞竣煌佬電柑墳楞巒深尚臟離妓捎第四章基因工程的載體第四章基因工程的

35、載體載體的元件及性質(zhì) 克隆載體 ori Amp Mcs E.coli表達(dá)載體元件 P Rbs/SDs Mcs terms 真核表達(dá)元件 P/E Mcs terms 加poly（A）信號(hào)克隆載體元件以及性質(zhì)Ecoli表達(dá)載體哺乳動(dòng)物質(zhì)粒細(xì)胞表達(dá)載體1. Ori 能在受體細(xì)胞中復(fù)制， 含有復(fù)制位點(diǎn)（起點(diǎn)）2. Ampr 抗生素抗性基因可以便 利加以檢測(cè)3. MCS 多克隆位點(diǎn)，克隆攜帶 外源基因片段 4. 載體可導(dǎo)入宿主細(xì)胞 （生物學(xué)/非生物學(xué)方法）1. Ori2.Ampr3.Mcs4. Promoter5. SDs Rbs 6.Terms7.可導(dǎo)入E.coli 1.orip 在E.coli中能作

36、復(fù)制起始位點(diǎn)2.Ampr 細(xì)菌抗生素抗性基因3.Kanr 真核細(xì)胞（哺乳類）藥物抗性基因4.Orie 真核細(xì)胞復(fù)制起始位點(diǎn)5.Mcs 多克隆位點(diǎn)6. P/E 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子7. Terms 終止信號(hào)8. 加poly（A）信號(hào)9. 可導(dǎo)入真核細(xì)胞（哺乳類）（78別為轉(zhuǎn)錄翻譯終止密碼，真核細(xì)胞表達(dá)元件。）仿福瞄唁彼眺伶娃兌昧幟贅孔聾癢津宙哇懼旺借醒吊僅錐傷倚縫均嬸剪椰第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體（三）元件的類別和質(zhì)量： 基因工程前考慮的4個(gè)問題： (1)基因工程的目的 克隆擴(kuò)增/表達(dá):生產(chǎn)產(chǎn)品 基因治療 (2)克隆片段的大小運(yùn)載多大重量的車子。 (3)受體細(xì)胞類型 真核/原核/穿梭。

37、(4)載體本身及其元件的質(zhì)量 不能搞成“豆腐渣工程”，如P要“強(qiáng)大陣容”。達(dá)肘賺蝗弦按鋪迪掛仲霍八霹股仇傷俞瀾蟄擇侄世凝滾挾呻怨訓(xùn)研鼎玉靳第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體1.Ori復(fù)制起始點(diǎn)（origin，ori）（1）決定質(zhì)粒自我增殖和拷貝數(shù)的主要元件。（2）使繁殖后細(xì)胞維持一定量的拷貝數(shù)。（3）一般情況下，一個(gè)質(zhì)粒只含一個(gè)ori，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子。（4）穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物2個(gè)復(fù)制子，以確保兩類細(xì)胞中都能擴(kuò)增。（5）基因工程使用松弛復(fù)制子，以獲得更多的基因產(chǎn)品。 復(fù)制子 是一段包括復(fù)制起始位點(diǎn)，反式因子作用在內(nèi)的DNA片段，其功能是通過復(fù)制使質(zhì)粒能穩(wěn)定存在宿主菌內(nèi)（如E.c

38、oli）。松弛復(fù)制子的特點(diǎn) 拷貝數(shù)多，10200個(gè)，分子量小。 復(fù)制不受宿主細(xì)菌復(fù)制系統(tǒng)的限制，僅需DDDPI，當(dāng)宿主蛋白 質(zhì)合成受到抑制（如培養(yǎng)中加入氯霉素時(shí)）其拷貝數(shù)猛增至 10003000之多，該性質(zhì)多基因工程技術(shù)十分有利。 分子量小，不具備自傳遞能力。 基因工程使用松弛型質(zhì)粒，如含PBMI復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒。栽儉詫瀑全喪高照死鰓革袍巡律抿知渝龍拭尹扦縫入裝瀑駒姑艇搬斌粳存第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體2. 抗生素抗性基因：（genotype） 編碼產(chǎn)物 功能（phenotype）（1）Ampr 酶 水解內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。（2）tetr 1個(gè)膜蛋白 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。

39、（3）camr 乙酰轉(zhuǎn)乙酶 生成氯霉素羥乙?；苌铮怪?失去毒性。（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 使G418（長(zhǎng)那霉素衍生物） 失活（5）hygr 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 使潮霉素失活。翟斷哈涌棉警懾哎芳音娜乙琢正近翹允失尚罩蹋滄白良她栓憾逛塑尿蟬孜第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體 3. MCS多克隆位點(diǎn)（multiple cloining site，MCS） （1）MCS 是多個(gè)限制酶識(shí)別的一段DNA順序，以便克隆/插入外源基因/DNA片段，與之相關(guān)概念有： （2）多聚接頭（polyliker） 有些質(zhì)粒載體單一切點(diǎn)少，不能普遍使用。為了擴(kuò)大使用范圍，可以加一段有許多限

40、制酶識(shí)別的單一切點(diǎn)的多聚接頭。 （3）人工接頭（linker） 是用若干個(gè)bp組成的dsDNA片段，一般有一個(gè)或以上限制酶識(shí)別與切割的順序。 (2)與（3）已經(jīng)商品化，注意liker與adaptor的區(qū)別（下述）蟬鉤纏類窘段凈徘蟄宦謊羔跟竣哀捻閉莫蕉圭啤貼叉酒穿杖溶贛嗽磚牌思第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體4，啟動(dòng)子（pormoter） （1）概念： 促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄的DNA順序，又稱啟動(dòng)基因或啟動(dòng)序列。 這個(gè)DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游（upstream），RNApol結(jié)合在上面，指導(dǎo)酶朝向正確的轉(zhuǎn)錄位置。 啟動(dòng)子又稱啟動(dòng)基因，是DNA分子上可以與RNApol特異性結(jié)合并使

41、之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。 DNA分子一個(gè)與啟動(dòng)子基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)的區(qū)域，包括RNApol識(shí)別，結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始3個(gè)功能部位。新嶺穩(wěn)層澇匣蝦賞渠增膽鈣近漓弓副繳點(diǎn)恢舌鋇唉樣頹匝腦瞄跺單嶺昂潞第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體（2）原核生物啟動(dòng)子和真核生物啟動(dòng)子的比較啟動(dòng)子功能性質(zhì)：決定轉(zhuǎn)錄方向，啟動(dòng)啟動(dòng)下游（downstream）基因互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄mRNA與信息鏈一致。決定dsDNA的哪一條鏈作為模板，轉(zhuǎn)錄出RNA。決定轉(zhuǎn)錄效率，強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄效率強(qiáng)，弱次之。啟動(dòng)子是可以接受調(diào)控的，可以被改造的。原核生物E.coli啟動(dòng)子長(zhǎng)約4060bp真核生物啟動(dòng)子識(shí)別位點(diǎn)35bp（2）TAT

42、A因子（TFD）先結(jié)合TATAbox，再結(jié)合RNApol結(jié)合位點(diǎn)10bp（即TATA合）25bp，富含AT稱為TATA合或Hogness合，與RNApol結(jié)合。起始位點(diǎn)120bp1bp，轉(zhuǎn)錄合成RNA第一個(gè)bp的位置（同左）劫章調(diào)罰徑遇帛魄埂渝蛇酥蝗聘達(dá)疏玩譚酌弧酵飯臃漱盲啤跨舍閱熾絕砸第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體（3）基因工程中常使用強(qiáng)啟動(dòng)子 表達(dá)系統(tǒng)常用啟動(dòng)子及備注1. Ecoli（1）Lacuv5（乳糖uv5啟動(dòng)子）（2）trp（色氨酸啟動(dòng)子）（3）Tac（乳糖色氨酸雜合啟動(dòng)子）（4）PL（phage左向啟動(dòng)子，包括CI857ts阻遏子）2. 酵母（1）己醇脫氨酶啟動(dòng)子（2）

43、酸性磷酸酶啟動(dòng)子3. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞（1）SV40啟動(dòng)子（帶有增強(qiáng)子） (2)腺病毒晚期啟動(dòng)子（3）Melallothionen基因啟動(dòng)子4. 昆蟲細(xì)胞（1）多角蛋白基因啟動(dòng)子（2）10K蛋白基因啟動(dòng)子5. 植物（1）花葉菜花葉病毒啟動(dòng)子（2）Napalin合成酶啟動(dòng)子（3）微蛋白啟動(dòng)子。（Tubulin）片毒輛鯉腆堪蒙衰握唯穢盡矗節(jié)甲汕妻惕擦票茹謊就肝摔朱訛劊偉蓋阻女第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體用于原核表達(dá)系統(tǒng)的強(qiáng)啟動(dòng)子LacLacuv5TrpTacPLT7 名 稱來(lái) 源組 成正 調(diào) 控負(fù) 調(diào) 控備 注1LacE.coli乳糖操縱子（1）Pg（啟動(dòng)基因）；（2）CAP（降解物激活蛋

44、白基因）；（3）O（操縱子）；（4）S（部分半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)基因）。分解代謝系統(tǒng)：CAPcAMP激活P（啟動(dòng)子）促進(jìn)轉(zhuǎn)錄阻遏物R調(diào)節(jié)基因R編碼產(chǎn)物產(chǎn)生阻遏蛋白結(jié)合在O上（操縱基因）阻止轉(zhuǎn)錄存在乳糖時(shí)乳糖結(jié)合阻遏蛋白解除對(duì)轉(zhuǎn)錄阻遏開始轉(zhuǎn)錄2Lacuv5是一個(gè)突變?nèi)樘遣倏v子IPIG是半乳糖苷酶底物類似物它能與阻遏蛋白結(jié)合使O成游離狀態(tài)對(duì)分解代謝抑制不敏感即使沒有CAPcAMP轉(zhuǎn)錄照常進(jìn)行據(jù)報(bào)首Lac組建載體在原核細(xì)胞表達(dá)時(shí)IPTG可提高真核基因表達(dá)水平50倍。裹窮枉著白倫狂紹揚(yáng)院蕊瑰李蚌誕諷懂耗幽侮艙縣具憫淖錢雍牌萬(wàn)麗鴛或第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體名稱來(lái)源組成正調(diào)控負(fù)調(diào)控備注3Trp從

45、E.coli色氨酸操縱子分離（1）Pg（啟動(dòng)基因）；（2）R（制動(dòng)基因）；（3）O（操縱基因）；（4）SE（色氨酸Trp部分結(jié)構(gòu)基因）。吲哚丙烯酸是Trp的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑它能與阻遏蛋白結(jié)合阻止了Trp與之結(jié)合而活化使轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生阻遏蛋白，結(jié)合Trp有活性再結(jié)合在O上阻止轉(zhuǎn)錄缺乏Trp阻遏蛋白不能活化去阻遏據(jù)報(bào)道吲哚丙烯酸在轉(zhuǎn)錄水平至少可以增強(qiáng)50倍，另外制動(dòng)基因缺乏可提高轉(zhuǎn)錄水平810倍4Tac（TrpLac）人工構(gòu)建的TrpLac雜合啟動(dòng)子（1）tac=Trp-35+ Lacuv5-20；（2）tacTrp-35一個(gè)合成的46bp片段；包括pribrow合和LacO（3）tac12Tr

46、p35Lac10區(qū)，操縱基因O部分，SD順序融合而成。IPIG誘導(dǎo)受Lac阻遏物的調(diào)控（1）比Lacuv5強(qiáng)7倍；（2）受體菌有RB791，XLblue，SB221，JM109等。5。T7噬菌體啟動(dòng)子帶有Lacuv5啟動(dòng)子控制的T7噬菌體RNA pol基因IPIG誘導(dǎo)（1）比Lacuv5強(qiáng)7倍；（2）受體菌有RB791，XLblue，SB221，JM109等?？堇窐屚顺Ρ蘧鏄O吭匹賊閏散竹隱圾稿汗幾循茶蔡鯨綿慶隋祭鴕蠕儒枚第四章基因工程的載體第四章基因工程的載體5.增強(qiáng)子/沉默子（enhancer，E/silencer（negatire enhancer） （1）概念 為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無(wú)關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下