1、生物制藥工程主講教師： 劉 凱 liukai_山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物系第八章 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝8.1 制藥動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)與特征8.2 基因工程動(dòng)物細(xì)胞系的構(gòu)建8.3 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的制備8.4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)8.5 培養(yǎng)過程檢測(cè)與工藝控制動(dòng)物細(xì)胞體積大，無細(xì)胞壁，細(xì)胞倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，易受污染；培養(yǎng)過程需氧量少，對(duì)機(jī)械攪拌或剪切力敏感；細(xì)胞間主要以聚集體形成存在；原代細(xì)胞一般繁殖50代左右即退化死亡。動(dòng)物細(xì)胞群體生長(zhǎng)特點(diǎn)8.5 細(xì)胞培養(yǎng)過程的檢測(cè)與工藝控制生長(zhǎng)環(huán)境參數(shù)：溫度、pH、溶氧、轉(zhuǎn)速、液流量培養(yǎng)基成分變化參數(shù)：葡萄糖消耗率、乳酸生成率、銨離子濃度生長(zhǎng)狀態(tài)參數(shù)：形態(tài)

2、變化、活性高低、密度大小目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)率：產(chǎn)物的合成與積累速度，分泌情況微生物的污染參數(shù)8.5.1 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)檢測(cè)與控制1、細(xì)胞數(shù)目與活性檢測(cè)離線分析：用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，或進(jìn)行分光光度計(jì)比色分析，確定反應(yīng)器中細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞活性：組織化學(xué)染色法和細(xì)胞形態(tài)的觀察測(cè)細(xì)胞活性。臺(tái)盼藍(lán)染色排除法（死細(xì)胞質(zhì)膜不完整，成藍(lán)色），MTT比色分析（增殖細(xì)胞能量代謝中，琥珀酸脫氫酶能將四甲基偶氮唑鹽(MTT)還原為不溶的藍(lán)色的甲臜結(jié)晶物質(zhì)；死細(xì)胞該酶已失活。 ）在線分析：近紅外線傳感器，可把細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性的控制結(jié)合在一起。2、細(xì)胞凋亡檢測(cè)凋亡細(xì)胞排斥活體染料，臺(tái)盼藍(lán)不能檢測(cè)。光學(xué)顯微鏡：直接形態(tài)觀察，凋亡小體熒光

3、顯微鏡：熒光染料（Hoechst，Hoechst/PI，吖啶橙/溴化乙錠）染色，觀察細(xì)胞核的形態(tài)。Hoechst33258染色DNA粘性3-OH末端被熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記A0-EB雙重染色法2、細(xì)胞凋亡檢測(cè)凋亡的主要生化特征是激活一種Ca2+/Mg2+依賴型的核酸內(nèi)切酶，將核DNA切割成200bp或更大的片段，而壞死細(xì)胞不會(huì)出現(xiàn)DNA斷裂片段。細(xì)胞凋亡控制細(xì)胞凋亡的化學(xué)抑制劑乙酰半胱氨酸NAC吡咯烷二硫氨基甲酸酯PDTC 半胱天冬蛋白酶Caspase抑制劑（參與誘導(dǎo)凋亡的Caspase分成兩大類：?jiǎn)?dòng)酶（inititaor）和效應(yīng)酶（effector）它們分別在死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游

4、和下游發(fā)揮作用。 ）Z-VAD-FMK（泛Caspase抑制劑/凋亡抑制劑 ），YVANCaspase盡管有許多信號(hào)可以誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡，但它們有一些共同的特征，其中之一是凋亡時(shí)一系列細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶Caspase的活化。Caspase具有催化活性，“C”代表具有半胱氨酸水解酶功能，“aspase”代表具有切斷天冬氨酸末端的功能。在對(duì)哺乳動(dòng)物同源基因ced-3（線蟲C. Elegans的細(xì)胞死亡基因）的研究中，首次發(fā)現(xiàn)了具有半胱氨酸水解酶活性的Caspase家族。 8.5.2 微生物污染檢測(cè)與防治1、污染的檢測(cè)細(xì)菌污染：肉湯培養(yǎng)基于37恒溫培養(yǎng)，檢查。支原體污染：染色、培養(yǎng)、DNA雜交和共培養(yǎng)

5、，至少同時(shí)使用兩種方法。熒光染色在熒光顯微鏡下觀察。2、污染的防治使用抗生素，以避免輕度污染。注意在傳代及種子培養(yǎng)階段不應(yīng)使用抗生素，否則會(huì)掩蓋早期污染。對(duì)于支原體污染，常用卡那霉素、金霉素處理培養(yǎng)物?？敲顾貙?duì)細(xì)胞無毒性，金霉素有較大毒性。注意一旦支原體被消除后，就要及時(shí)終止抗生素的使用，以免產(chǎn)生新的抗藥性的支原體。特異性的支原體血清、高溫（如41，支原體對(duì)熱敏感）、支原體去除劑。8.5.3 培養(yǎng)基成分檢測(cè)與代謝控制1、基質(zhì)消耗的檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)的消耗：葡萄糖和谷氨酰胺的減少為指示；副產(chǎn)物的積累：乳酸和銨離子的增加；近紅外測(cè)量技術(shù)可實(shí)現(xiàn)葡萄糖的在線測(cè)定?？刂其@離子濃度低于24 mmol/L，乳酸低于

6、60 mmol/L。2、代謝控制如果存在過量的葡萄糖，細(xì)胞將消耗90%以上葡萄糖作為乳酸分泌到培養(yǎng)液，即使在完全有氧條件下也如此。流加過量谷氨酰胺會(huì)導(dǎo)致銨離子、丙氨酸或天門冬氨酸的積累。限制葡萄糖的流加量，將減少乳酸的總量，增加葡萄糖的產(chǎn)量系數(shù)。限制谷氨酰胺的流加量，可減少銨鹽和氨基酸的生成。如果進(jìn)行雙控制（同時(shí)控制葡萄糖和谷氨酰胺），乳酸和銨離子將同時(shí)減少，使細(xì)胞代謝編的更有效。生產(chǎn)工藝中，優(yōu)化二者之間關(guān)系，使之協(xié)調(diào)。把細(xì)胞活力、ATP、DNA和蛋白質(zhì)的含量，與生物量或細(xì)胞計(jì)數(shù)、底物和產(chǎn)物代謝變化相結(jié)合，評(píng)價(jià)代謝過程，建立調(diào)控模型，進(jìn)行有效控制。對(duì)于生長(zhǎng)速率恒定的連續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)ATP含量與

7、生長(zhǎng)速率相關(guān)。氨基酸的比吸收速率和比生成速率、細(xì)胞內(nèi)酶（如乳酸脫氫酶，谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶）的比釋放速率，都可作為培養(yǎng)過程的瞬間參數(shù)和控制節(jié)點(diǎn)的閾值。如果能自動(dòng)檢測(cè)產(chǎn)物并計(jì)算產(chǎn)率，通過計(jì)算程序可使過程自動(dòng)優(yōu)化。多元參數(shù)分析的計(jì)算程序，能改變所有的相關(guān)參數(shù)，最終找到一個(gè)最佳的生產(chǎn)條件。8.5.4 攪拌剪切的檢測(cè)與控制1、攪拌剪切的檢測(cè)攪拌混合為生物反應(yīng)器提供了均相環(huán)境，提高了氧及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞速率。但攪拌產(chǎn)生剪切力會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞造成損傷。對(duì)細(xì)胞損傷可用懸浮培養(yǎng)中的胞外蛋白濃度來表征，它決定了細(xì)胞的裂解程度。最常用的是細(xì)胞質(zhì)中的乳酸脫氫酶（LDH），在指數(shù)生長(zhǎng)階段為一常數(shù)。通過監(jiān)測(cè)LDH釋放

8、可評(píng)價(jià)不同攪拌對(duì)細(xì)胞損傷程度。2、攪拌剪切控制反應(yīng)器設(shè)計(jì)表面通氣反應(yīng)器：避免漩渦。高速攪拌，安裝擋板。填充反應(yīng)器：無頂部氣體空間，消除夾帶和氣泡破裂帶來的剪切。鼓泡反應(yīng)器：氣體應(yīng)該從生物反應(yīng)器重移走。或使用高徑比較大（至少2-3）的反應(yīng)器進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。攪拌、鼓泡、氣升反應(yīng)器：使用剪切保護(hù)劑。多空微載體：用各種攪拌/混合強(qiáng)度檢測(cè)，顯微鏡下檢查微載體的機(jī)械損傷程度。3、轉(zhuǎn)速在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，攪拌速率控制在20200 rpm為宜，所以需要更慢的驅(qū)動(dòng)器，即使是小范圍的控制。使用剪切保護(hù)劑離子表面活性劑：聚醚F-68和F-88，0.1%，首先選用。PVA（聚乙烯醇）：研究并不廣泛，但效果也很好?；旌戏肿?/p>

9、量的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）：鼓泡式反應(yīng)器內(nèi)的剪切損傷。血清：效果好，25%，但使蛋白質(zhì)純化變得復(fù)雜，可能病毒污染，避免使用。羧甲基纖維素：前景光明，需要做很多工作。蛋白胨、乳白蛋白水解產(chǎn)物、胰蛋白磷酸鹽、酵母提取物、酵母水解產(chǎn)物等。8.5.5 溶解氧檢測(cè)與控制1、溶解氧影響較大氧壓范圍（15%90% DO）內(nèi)生長(zhǎng)良好。低水平阻礙細(xì)胞代謝，過高，產(chǎn)生氧自由基，對(duì)細(xì)胞造成傷害。細(xì)胞類型、細(xì)胞密度、增殖速率、葡萄糖濃度以及谷氨酰胺濃度等都影響耗氧速率。一定溶氧范圍內(nèi)，耗氧速率可近似為一常數(shù)。耗氧比速率：0.050.5 mol/106細(xì)胞/h CHO為0.15；BHK-21為0.2；鼠雜交瘤：0.0

10、30.482、溶解氧控制必須保證氧濃度高于臨界氧濃度，提高氧傳質(zhì)系數(shù)（kL）、傳質(zhì)面積（a）、傳質(zhì)動(dòng)力（C）都能改善供氧。不同細(xì)胞類型的最適溶解氧水平不同2080%是一個(gè)可選范圍低于20%對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利高于80%的氧濃度對(duì)細(xì)胞有毒害加入不同比例的氧氣、空氣或氮?dú)饣蚨趸既苎趿康目刂瞥３ＥcpH值控制結(jié)合在一起，根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)。8.5.6 溫度和pH檢測(cè)與控制1、溫度動(dòng)物細(xì)胞對(duì)溫度變化很敏感，控制要求十分嚴(yán)格。高靈敏溫度計(jì)（0.25）在線檢測(cè)。溫度探頭（鉑100），進(jìn)行反饋控制。預(yù)熱培養(yǎng)基，或加熱水套層，是溫度恒定。哺乳動(dòng)物細(xì)胞：37；雞胚細(xì)胞：3940；昆蟲細(xì)胞25282、pH值檢測(cè)與控制開始時(shí)，pH為7.4，隨著細(xì)胞產(chǎn)生較多CO2和乳酸，pH會(huì)下降，但不能低于7.0。精確控制pH，一般為7.07.5，其波動(dòng)范圍為0.050.9。直接加HCl或NaOH不適合動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。磷酸鹽緩沖液中的磷酸及高HEPES(羥乙基哌嗪乙硫磺酸，一種非離子兩性緩沖液, pH 7.27.4） 對(duì)細(xì)胞有毒性。碳酸氫鹽緩沖劑：加入CO2可降低pH值，加入碳酸氫鹽可提高pH值。緩沖能力弱?？刂艱O：增加溶氧量會(huì)使培養(yǎng)基中CO2被置換出來，導(dǎo)致pH值升高。應(yīng)該合理配置，達(dá)到控制目的。8.5.7 目標(biāo)產(chǎn)物檢測(cè)與控制目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行跟蹤檢測(cè)：免疫方法測(cè)定活性。產(chǎn)物并非100%具有生物活性，它依賴于糖基化