1、學(xué)院 組織培養(yǎng)實驗室 撰寫人簽名:課程名稱：植物組織培養(yǎng)技術(shù)英文名稱：Plant Tissue Culture Technology課程總學(xué)時 36學(xué)時實驗總學(xué)時20學(xué)時開設(shè)實驗項目數(shù) 5 個本大綱屬 1.統(tǒng)編 2.自編 3.借用實驗教材或指導(dǎo)書;1.統(tǒng)編 2.自編實驗者類別: 1.本科 2.?？?3.研究生 4.進(jìn)修生 5.其它課程類型; 1.獨(dú)立設(shè)課 2.非獨(dú)立設(shè)課實驗考試考核方式：操作 實驗成績占課程成績比例：50%面向?qū)I(yè); 生物科學(xué)、生物技術(shù)1開出實驗項目名稱、實驗類型及學(xué)時1.植物組織培養(yǎng)實驗室的基本設(shè)備和一般技術(shù)（綜合性） 4學(xué)時2.植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的制備（綜合性） 4學(xué)時3.

2、外植體無菌系的建立（綜合性） 4學(xué)時4.植物材料初代培養(yǎng)與繼代培養(yǎng)及培養(yǎng)物的觀察與統(tǒng)計 （綜合性） 4學(xué)時5.試管苗的生根，移栽及苗期管理（綜合性） 4學(xué)時2實驗一.植物組織培養(yǎng)實驗室的基本設(shè)備和一般技術(shù)實驗的目的： 了解植物組織培養(yǎng)實驗室的設(shè)置及基本設(shè)備，學(xué)習(xí)基本儀器設(shè)備的使用原理與方法，掌握植物組織培養(yǎng)的基本技術(shù)。實驗的內(nèi)容： 一、組培實驗室的設(shè)置 二、組培實驗室基本設(shè)備 三、必要的器皿 四、植物組織培養(yǎng)的基本技術(shù) 1.洗滌技術(shù) 2.滅菌技術(shù)3 一、組培實驗室的設(shè)置1.1 基本實驗室包括準(zhǔn)備室、接種室和培養(yǎng)室，是組織培養(yǎng)實驗所必須具備的基本條件。 1.1.1 準(zhǔn)備室 其功能是進(jìn)行一切與實驗

3、有關(guān)的準(zhǔn)備工作。 主要包括器具的洗滌、干燥和保存；藥品的稱量、溶解、配制；培養(yǎng)基的分裝、包扎和滅菌；植物材料的預(yù)處理等。1.1.2 接種室 其功能是進(jìn)行材料的離體無菌操作。 主要包括植物材料的接種、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移、試管苗的繼代等。1.1.3 培養(yǎng)室 其功能是對離體材料進(jìn)行控制條件下的培養(yǎng)。 換句話就是人工條件下培養(yǎng)接種物及試管苗的場所.41.2 輔助實驗室 輔助實驗室是根據(jù)研究或生產(chǎn)的需要而配套設(shè)置的專門實驗室，主要用于細(xì)胞學(xué)觀察和生理生化分析等。1.2.1 細(xì)胞學(xué)實驗室 其功能是對培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究。 細(xì)胞學(xué)實驗室由制片室和顯微觀察室組成。 制片是獲取顯微觀察數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)，制片室一般配

4、備有切片機(jī)、磨刀機(jī)、溫箱以及樣品處理和切片染色的設(shè)備等，由于制片過程中所用藥品常常是一些具有一定危害的苯、醛類物質(zhì)，制片室應(yīng)安裝通風(fēng)櫥，并有相應(yīng)的廢液處理設(shè)施。 顯微觀察室放置各種顯微鏡和圖像拍攝、處理設(shè)備，便于對實驗材料進(jìn)行認(rèn)真觀察、分析和照相。因而要求房間清潔、明亮、干燥，防止潮濕和灰塵污染。51.2.2 生化分析實驗室 在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實驗室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗實驗室，以便于對培養(yǎng)物的有效成分隨時進(jìn)行取樣檢查。對于一些大型的次生產(chǎn)物生產(chǎn)實驗室，還應(yīng)建立有效物質(zhì)分離實驗室。因此，生化分析實驗室的規(guī)模和性質(zhì)需根據(jù)整體研究或生產(chǎn)的需要而定。6 1.3 實驗室的布局 植物組織培養(yǎng)

5、實驗室的布局是非常重要的，布局是否合理不僅影響到是否經(jīng)濟(jì)，更重要的是會影響到是否能滿足實驗要求。實驗室布局應(yīng)在實驗室建筑設(shè)計時確定，其基本要求是：便于隔離，便于操作，便于滅菌和便于觀察。 為了滿足這幾個要求，實驗室的布局可根據(jù)組織培養(yǎng)實驗的操作程序安排實驗室排列。接種室、培養(yǎng)室應(yīng)放在與外界環(huán)境隔離的區(qū)域，使之能較長時間保持無菌狀態(tài)，從而免除頻繁消毒的麻煩。滅菌室應(yīng)與接種室相鄰，以便于將滅菌后的培養(yǎng)基及用品直接放置于接種室，盡可能免除再污染。其他實驗室的布局可根據(jù)條件，以方便實用為宜。71.4 溫室 試管苗移栽必須要有溫室，如用鋼架、玻璃架制造溫室成本太高，可用單坡塑料大棚代替，這種大棚在向陽面

6、搭棚，其余三面打墻，以防風(fēng)保溫。成本僅相當(dāng)與鋼架玻璃溫室的1/8-1/5.8A 準(zhǔn)備室 準(zhǔn)備室要求寬敞明亮，以便于放置多個實驗臺和相關(guān)設(shè)備，便于多人同時工作。 準(zhǔn)備室要求通風(fēng)條件好，便于氣體交換，同時實驗室地面應(yīng)便于清潔，并應(yīng)進(jìn)行防滑處理。 根據(jù)需要和條件，準(zhǔn)備室可設(shè)計為分體式或通間式。一般用作研究性質(zhì)的實驗室，可設(shè)計成分體式，由分開的若干房間將準(zhǔn)備室分解為藥品儲藏室、培養(yǎng)基配制與洗滌室和滅菌室等。重點(diǎn)介紹幾個內(nèi)容：9 B. 接種室 接種室也叫無菌操作室，是進(jìn)行試管苗接種繼代的場所，是試管苗生產(chǎn)中最關(guān)鍵的地方，它關(guān)系到試管苗的污染率、接種工作效率等。設(shè)計技術(shù)要求：接種室宜?。好荛]光滑，配置拉動

7、門；接種室要求干爽，吊裝紫外線滅菌燈，最好安裝一小型空調(diào)；接種室應(yīng)設(shè)有緩沖間，面積2m2為宜。10C. 培養(yǎng)室培養(yǎng)室大小依規(guī)模決定。培養(yǎng)架規(guī)格：培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設(shè)層，最低一層離地高100cm，其它每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架即高2m左右。培養(yǎng)架長度都是根據(jù)日光燈的長度而設(shè)計，如采用40W日光燈，則長1.2m左右，寬度一般為60cm。培養(yǎng)條件控制：1.溫度：一般保持在20-27左右，由空調(diào)機(jī)調(diào)節(jié)。2.室內(nèi)濕度也要求恒定，相對濕度以保持在70-80%為好；可安裝加濕器。3.光照：安裝日光燈和安裝定時器，一般需要每天光照10-16h。可白天開燈，也可晚間開燈。 11二、組培實驗室基本設(shè)備

8、2.1 常規(guī)設(shè)備1.電子天平 精度高，稱量快，但價格較高。 DT200精度0.1g Max 200g用于稱取蔗糖和瓊脂等 FA1004精度0.1mg Max 100g 用于稱取微量元素和植物激素及微量附加物。注意事項：放置天平的地方，要平穩(wěn)、干燥，避免腐蝕性藥品和水氣。藥品的稱量、溶解和保存注意事項： a.藥品稱取要精確，根據(jù)要求使用不同精度的天平稱取。 b.稱好的藥品分別放于小燒杯中，先用少量蒸餾水完全溶解，最后倒入容量瓶，定容到規(guī)定的體積；另外,溶解各種藥品時要注意混合的順序,以免發(fā)生沉淀,氧化等。 c.容量瓶中的母液應(yīng)倒入棕色試劑瓶，貼上標(biāo)簽，放入冰箱保存。母液應(yīng)勤配快用，若放置日久，發(fā)

9、現(xiàn)渾濁、絮狀沉淀，則失效不能再使用。 12常規(guī)設(shè)備2. 冰箱各種維生素和激素類藥品以及培養(yǎng)基母液均需低溫保存，某些實驗還需對植物材料進(jìn)行低溫處理，在一般情況下均可利用普通冰箱完成。實驗一般配備冰箱1-2個。一個用于藥品的貯藏，一個用于保存培養(yǎng)基母液以及用作某些植物材料的低溫處理。本實驗室配置的是：廣東科龍 SC-280WLP/H立式冷藏陳列柜3. 酸度計 用于測定培養(yǎng)基以及其它溶液如酶制劑等的pH值，其精度要求因?qū)嶒炐枰?，一般要求可測定pH范圍在1-14之間，精度0.01即可。 一般用小型酸度測定儀，即可在配制培養(yǎng)基時使用,也可測定培養(yǎng)過程中pH 值的變化.若不做研究，僅用于生產(chǎn)，也可用p

10、H值為4-7的精密試紙來代替。測定培養(yǎng)基pH值時，應(yīng)注意攪拌均勻后再測。13常規(guī)設(shè)備4.離心機(jī) 用于細(xì)胞、原生質(zhì)體等活細(xì)胞分離，亦用于培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞器、核酸以及蛋白質(zhì)的分離提取。根據(jù)分離物質(zhì)不同配置不同類型的離心機(jī)，如用于細(xì)胞、原生質(zhì)體等活細(xì)胞的分離，一般選用低速離心機(jī)，而核酸、蛋白質(zhì)的分離則要選擇高速冷凍離心機(jī)。以規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)次生產(chǎn)物的實驗室，還應(yīng)選擇大型離心分離設(shè)備。5.加熱器 用于培養(yǎng)基的配制。研究性實驗室一般選用帶磁力攪拌器的加熱器，規(guī)?；笮蛯嶒炇覄t應(yīng)選用大功率加熱和電動攪拌系統(tǒng)。有時，亦可用電爐代替加熱器，但必須選用適當(dāng)功率和安全性能好的電爐。對于一些少量培養(yǎng)基的配制也可用微波爐

11、溶化蔗糖和瓊脂，但分裝前必須充分?jǐn)嚢杈鶆颉?. 純水器 離體培養(yǎng)應(yīng)使用符合要求的的純水或蒸餾水。用于一般培養(yǎng)，可使用4級過濾的反滲透純水器，也可使用蒸餾水器。對于一些精確培養(yǎng)試驗，有時需要使用雙蒸水或超純水，應(yīng)配備更高一級的純水設(shè)備。7.分裝設(shè)備 用于培養(yǎng)基的分裝，可以采用手工分裝和自動分裝。14 2.2 滅菌設(shè)備 維持相對的無菌環(huán)境是組培實驗室的基本要求，因此，與消毒滅菌有關(guān)的設(shè)備是必不可少的。滅菌設(shè)備包括高壓蒸汽滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器和紫外燈等。1.高壓蒸汽滅菌鍋 是常用的主要滅菌設(shè)備，一般用于培養(yǎng)基、玻璃器皿以及其它可高溫滅菌用品的滅菌，根據(jù)實驗室規(guī)模大小可選用手提

12、式、立式、臥式等不同規(guī)格的產(chǎn)品。本實驗室配置的是：上海申安 LDZX-40BI 立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋。2.干熱消毒柜 用于一些金屬工具如剪刀、鑷子、解剖刀等的滅菌，亦可用于玻璃器皿的滅菌，一般可選擇溫度200 左右的普通或遠(yuǎn)紅外消毒柜。3.過濾滅菌器 用于一些酶制品、激素以及某些維生素等不能高溫滅菌試劑的滅菌。根據(jù)試劑量的大小可選擇不同體積和類型的過濾滅菌器，主要有真空抽濾式和注射器式兩大類。4.紫外燈 是方便、經(jīng)濟(jì)的控制無菌環(huán)境的裝置，一般安裝在實驗室的各個房間，特別是接種室和培養(yǎng)室必須安裝，緩沖區(qū)一般也應(yīng)安裝紫外燈。15 2.3 無菌操作設(shè)備超凈工作臺最常用、最普及的無菌操作裝置工作

13、優(yōu)點(diǎn)：操作方便自如，比較舒適，工作效率高，準(zhǔn)備時間短?？砷L時間使用。工作原理：鼓風(fēng)機(jī)將外界空氣從低效過濾器粗濾塵埃，再將空氣通過特制的微孔泡沫塑料片層疊組成的高效過濾器過濾消毒，它能除去直徑0.3微米的塵埃、細(xì)菌和真菌孢子，吹出的氣體形成連續(xù)不斷的無塵無菌的空氣層流，以0.35-0.55米秒的流速送到操作臺面，用無菌氣流將臺面帶菌氣體驅(qū)走，使超凈臺操作室成為無菌空間。超凈臺使用時間長了過濾器會堵塞，一般低效過濾器每半年清洗一次，高效過濾器視情況34年更新一次。每周開紫外燈2小時殺菌一次超凈工作臺應(yīng)放置在空氣干凈，地面無灰塵的地方種類：水平式和垂直式兩種型號，有單人、雙人及三人式的，也有開放和密

14、封式的區(qū)別.本實驗室配置的是：蘇州凈化設(shè)備有限公司 sw-cJ-1cu 雙人單面凈化工作臺162.4 培養(yǎng)設(shè)備 培養(yǎng)設(shè)備是根據(jù)需要所選用的不同規(guī)格和控制精度的用于植物細(xì)胞、組織或器官培養(yǎng)的設(shè)施和設(shè)備，包括培養(yǎng)架、培養(yǎng)箱、搖床、生物反應(yīng)器等。1.培養(yǎng)架：成本低、設(shè)計靈活，可充分利用培養(yǎng)室空間，是植物繁殖培養(yǎng)的通用設(shè)施。2.光照培養(yǎng)箱及生化培養(yǎng)箱、CO2培養(yǎng)箱 用于植物材料的特定培養(yǎng)。本實驗室配置的是:上海精宏實驗設(shè)備有限公司 GZP-250光照培養(yǎng)箱、SHP-250生化培養(yǎng)箱等。3. 振蕩培養(yǎng)箱、搖床 在進(jìn)行液體培養(yǎng)時，為了改善通氣狀況，可選擇使用振蕩培養(yǎng)箱或搖床 。選擇此類設(shè)備時，應(yīng)注意根據(jù)植

15、物細(xì)胞特點(diǎn)選擇適宜的振蕩頻率。4. 生物反應(yīng)器 利用植物細(xì)胞生產(chǎn)次生產(chǎn)物，需根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模選用適宜的生物反應(yīng)器。172.5 其它設(shè)備1.培養(yǎng)室需安裝時間程序控制器、溫度控制系統(tǒng)等，以控制光照時間和溫度.比較小型的實驗室，溫度控制亦可選擇使用空調(diào)。2.根據(jù)實驗需要選擇配置相關(guān)顯微鏡，包括實體顯微鏡、倒置顯微鏡以及其它顯微鏡等。為了獲取圖像資料和數(shù)據(jù)，一般還需配置與顯微鏡配套的攝影、錄像和圖像處理設(shè)備。3.根據(jù)實際需要，實驗室還應(yīng)配備有用于物質(zhì)分析的提取、純化和含量分析設(shè)備，如離心機(jī)、電泳儀、萃取和層析設(shè)備、紫外分光光度計、高效液相色譜儀、氣相色譜儀和酶聯(lián)免疫吸附測定儀等。18 顯微鏡顯微鏡包括雙目

16、實體顯微鏡（解剖鏡）、生物顯微鏡、倒置顯微鏡，還有相差顯微鏡、干涉顯微鏡和電子顯微鏡。顯微鏡上要求能安裝或帶有照相裝置，以對所需材料進(jìn)行攝影記錄。（1）雙目實體顯微鏡 雙目實體顯微鏡下可進(jìn)行培養(yǎng)材料（如莖尖分生組織、胚等）的分離，解剖和觀察植物的器官、組織，也可以從培養(yǎng)器皿的外部觀察細(xì)胞和組織的生長情況。（2）生物顯微鏡 生物顯微鏡可用于觀察花粉發(fā)育時期以及培養(yǎng)過程中細(xì)胞核的變化。（3）倒置顯微鏡 倒置顯微鏡物鏡在鏡臺下面，可以從培養(yǎng)皿的底部觀察培養(yǎng)物。19 三. 必要的器皿3.1 玻璃器皿1.三角瓶規(guī)格：有100、250、500ml等，一般使用100ml三角瓶；優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)面積大，利于組織生長

17、，受光也比試管好，由于瓶口較小，也不易污染。2.培養(yǎng)皿規(guī)格：常用9、12cm直徑，要求上下能密切吻合；適于：游離細(xì)胞、原生質(zhì)體、花粉等的靜置培養(yǎng)，看護(hù)培養(yǎng)、無菌種子的發(fā)芽、植物材料的分離等。3.試管規(guī)格：常用18180mm或20200mm；特點(diǎn)：可用于培養(yǎng)較高的試管苗，不易污染，但培養(yǎng)量較少。4.代用廣口的200ml罐頭瓶，加蓋半透明的塑料蓋；特點(diǎn)：成本較低，操作方便，也減少了培養(yǎng)材料的損傷，但缺點(diǎn)是易引起污染。5.代用塑料器皿特點(diǎn)：具有質(zhì)輕、透明、不易破碎，成本低等特點(diǎn)，但必須采用聚丙烯材料制成，能耐高溫，缺點(diǎn)透明度不好，不能國貨灼燒。206.瓶口封塞要求：要具有一定的透氣性和密閉性，以防止

18、培養(yǎng)基干燥和雜菌污染。1）以前用棉塞，但這種封口辦法夏季極易污染，且不易保持培養(yǎng)基濕度。2）有聚丙烯塑料薄膜，以線繩結(jié)扎或橡皮筋箍扎。為了增加透氣性，可襯一層硫酸紙。3）也可采用專用的封口膜。7.其他器皿用處：配制培養(yǎng)基，貯藏母液，材料的消毒等需要各種化學(xué)實驗用的玻璃器皿。種類：包括100、250、500、1000ml燒杯；10、100、1000ml量筒；100、1000ml試劑瓶（棕色）等等。21必要的器皿3.2 金屬器械組織培養(yǎng)常用的金屬器械，可選用醫(yī)療器械或微生物實驗所用的器械。1).鑷子類 包括小型尖頭鑷子。16cm-25cm長的槍狀鑷子等。2).剪刀類 常用的有眼科剪、手術(shù)剪、彎頭剪

19、等。3).分離器械 植物材料的分離、切割和嫁接、需使用解剖刀和芽接刀。前者可用眼科刀和菱形刀代替。刀具也可用雙面刀片，舊鋼鋸條等自制。4).過濾器械 有些不耐高溫的物質(zhì)，如玉米素等，以及某些維生素類，可使用5號、6號過濾器來除菌，但這種漏斗洗滌麻煩?？捎媒饘俾┒?，內(nèi)墊滅過菌的微濾孔膜，使用方便。5).接種針 用來轉(zhuǎn)移細(xì)胞和愈傷組織。22四、植物組織培養(yǎng)的基本技術(shù)4.1 洗滌技術(shù) 培養(yǎng)器皿和用具的洗滌時保證培養(yǎng)物正常生長的重要環(huán)節(jié)。使用不潔的培養(yǎng)器皿和用具可能影響培養(yǎng)基的組成成分，甚至導(dǎo)致實驗的失敗。培養(yǎng)器皿和用具的洗滌應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)南礈靹?，采用科學(xué)的洗滌方法。 最常用的洗滌劑分為兩類，一是合成洗

20、滌劑，二是鉻酸-硫酸洗滌劑。 洗滌方法：新的玻璃器皿洗滌方法是：用1%HCl溶液浸泡一晝夜，再用合成洗滌劑洗刷，然后用清水反復(fù)沖洗，最后用蒸餾水沖洗1-2次，干燥后即可使用。吸管、滴管等玻璃制品，先放入鉻酸洗滌液浸泡2小時以上，取出后用流水沖洗0.5小時左右，再用蒸餾水沖洗1-2次。塑料用品洗滌一般選用合成洗滌劑。金屬用品一般不宜用各種洗滌劑洗滌，一般用酒精擦洗，并保持干燥。23 4.2 滅菌技術(shù)滅菌是指殺滅培養(yǎng)物、培養(yǎng)基、培養(yǎng)用具及培養(yǎng)環(huán)境的雜菌，是防止微生物污染的最重要、最基本的環(huán)節(jié)，是植物組織培養(yǎng)技術(shù)中首先必須注意的問題。所用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿、各種操作工具及培養(yǎng)材料都要進(jìn)行滅菌。滅菌一

21、般有物理方法和化學(xué)方法兩種：物理方法是利用高溫、射線等殺死微生物或通過過濾、離心沉淀等去除微生物。化學(xué)方法主要是使用消毒劑、抗菌素殺滅微生物。在實際工作中，需根據(jù)不同的材料和要求選用相應(yīng)的滅菌處理方法。具體說明如下：1.培養(yǎng)基滅菌：一般采用高溫高壓滅菌或過濾滅菌。2.玻璃器皿滅菌：可選用濕熱和干熱滅菌方法滅菌。3.金屬器具滅菌：使用前干熱滅菌，使用過程中70%酒精浸泡，酒精燈火焰灼燒，冷卻后使用。4.操作環(huán)境滅菌: 氣體熏蒸或紫外線照射。24 實驗二.植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的制備實驗的目的： 掌握MS培養(yǎng)基的配制方法。實驗的內(nèi)容： 一、母液的配制 二、培養(yǎng)基的制備 1.培養(yǎng)基制備程序 2.培養(yǎng)基的

22、高壓滅菌25 1.母液的配制配制母液有兩個好處：可減少每次配制稱量藥品的麻煩；減少極微量藥品稱量時造成的誤差。以MS培養(yǎng)基為例，一般需要準(zhǔn)備四種母液： a.大量元素母液：可配成10倍母液，用時按比例吸取。配制母液時應(yīng)注意：分別稱量；充分溶解；注意混合秩序：Ca2+應(yīng)最后加入，與SO42-和HPO42-錯開，以免產(chǎn)生沉淀；混合時要緩慢，邊攪拌邊混合。 b.微量元素母液：因含量低，一般配成100倍甚至1000倍，用時按比例吸取。注意的原則同大量元素。 c. Fe鹽母液：必須單獨(dú)配制，一般擴(kuò)大200倍，用時按比例吸取。在配制時，EDTA鈉鹽需用溫水溶解，然后與FeSO4液混合，在75-80之間使其螯

23、合1小時。使用螯合鐵的目的：避免沉淀；緩慢不斷地供應(yīng)鐵。 26 母液的配制d. 有機(jī)化合物母液：主要是維生素和氨基酸類物質(zhì)，一般配成50-100倍的母 液，用時按比例吸取。e. 激素：每種激素必須單獨(dú)配成母液，其濃度為0.1、0.5或1mg/ml，多數(shù)激素 難溶于水，配法如下： IAA、 IBA、 GA3先溶于少量酒精，再加水定容； NAA 可溶于熱水或少量酒精中，再加水定容； 2,4-D 不溶于水，可用1mol/L的 NaOH溶解后再定容； KT 和 6-BA 先溶于1 mol/LHCl中，再加水定容; 玉米素ZT先溶于少量95%酒精中，再加水定容. 27 MS培養(yǎng)基大量元素母液用量表序號

24、成 分 規(guī)定量(mg/L)擴(kuò)大倍數(shù)稱取量 (mg)母液體積 每升培養(yǎng)基 (ml) 吸取量(ml) 1KNO3 1900 10 19000 1000 100 2NH4NO3 1650 10 16500 3MgSO47H2O 370 10 3700 4KH2PO4 170 10 1700 5CaCl22H2O 440 10 440028MS培養(yǎng)基微量元素母液用量表序號 成分 規(guī)定量 (mg/L)擴(kuò)大倍數(shù)稱取量 (mg)母液體積 (ml)每升培養(yǎng)基 吸取量(ml) 1MnSO44H2O22.3 1002230 1000 10 2ZnSO4 7H2O8.6860 3H3BO36.2620 4KI0.8

25、383 5Na2MoO42H2O0.2525 6CuSO45H2O0.0252.5 7CoCl26H2O0.0252.529 MS培養(yǎng)基鐵鹽母液用量表 序號 成分 規(guī)定量 (mg/L)擴(kuò)大倍數(shù)稱取量 (mg)母液體積 (ml)每升培養(yǎng)基 吸取量(ml) 1Na2 EDTA 37.3 100 3730 1000 10 2FeSO4 7H2O 27.8 278030MS培養(yǎng)基有機(jī)物母液用量表序號 成分 規(guī)定量 (mg/L)擴(kuò)大倍數(shù)稱取量 (mg)母液體積 (ml)每升培養(yǎng)基 吸取量(ml) 1甘氨酸2.0 50100 500 10 2鹽酸硫胺素VB10.1 5 3鹽酸吡哆醇VB60.5 25 4煙

26、酸0.5 25 5肌醇1005000312、培養(yǎng)基的制備程序培養(yǎng)基配制程序如下： (水、藥、糖、瓊脂) 混合 pH調(diào)整 加熱溶解 分裝 玻璃器皿 水洗 干燥 加棉塞 高壓蒸汽滅菌 冷卻 凝固 接種32培養(yǎng)基的配制及高壓滅菌1.稱出規(guī)定數(shù)量的瓊脂和蔗糖,加水直到培養(yǎng)基最終容積的3/4，在電爐上加熱溶解，在配制液體培養(yǎng)基時無需加熱，因為蔗糖在微溫的水中也可以溶解。2. 分別按配方逐個加入各種母液，包括生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他的特殊添加物。3. 加蒸餾水直至培養(yǎng)基的最終體積。4. 充分混合之后，用0.1mol/LNaOH和0.1mol/LHCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。一般來說，植物組織培養(yǎng)適合的pH值為5.8，

27、當(dāng)pH高于6.0時，培養(yǎng)基將會變硬，低于5.0時，瓊脂就不能很好的凝固。5. 把培養(yǎng)基分裝到所選用的培養(yǎng)容器中，每個25150mm的試管約裝15ml；每個150ml三角瓶約裝50ml。6. 用合適的材料封住瓶口。7. 把裝入培養(yǎng)基并封口的培養(yǎng)容器放入高壓鍋，開始高壓滅菌，121，保持15-20min8. 滅菌結(jié)束后，切斷電源，待壓力指針回零后，取出培養(yǎng)基，在室溫下冷卻后，置于溫度低且無強(qiáng)光照射的防塵櫥暫時保存待用。33實驗重點(diǎn)：1、pH值的調(diào)整 培養(yǎng)基的pH值(培養(yǎng)基的酸堿度)，直接影響到培養(yǎng)物對離子的吸收，所以過酸或過堿都對植物材料的生長有很大影響，此外，瓊脂培養(yǎng)基的pH值還影響到凝固情況。

28、當(dāng)培養(yǎng)基配制好以后，應(yīng)隨即進(jìn)行pH值的調(diào)整。最好用酸度計測試，既快又準(zhǔn)，如無此設(shè)備也可用精密pH試紙(應(yīng)在干燥器中保存)，培養(yǎng)基p值調(diào)整可用0.mol HCl或0.1mol NaOH。經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，由于某些成分的分解，如蔗糖的分解或氧化，酸度會增加，即pH值可降低0.2。2、分裝： 培養(yǎng)基合成后要趁熱分裝，100ml的容器約裝入30-40ml培養(yǎng)基，即1L培養(yǎng)基約裝35瓶左右。太多則浪費(fèi)培養(yǎng)基，太少不易接種和影響生長。但要根據(jù)培養(yǎng)對象來決定。如果培養(yǎng)時間較長時，應(yīng)適當(dāng)多裝培養(yǎng)基，生根等短期培養(yǎng)時，可適當(dāng)少加培養(yǎng)基。分裝時不要把培養(yǎng)基弄到管壁上，以免日后污染。34 實驗重點(diǎn)：3、加塞(封口)

29、： 培養(yǎng)基分裝好以后，在試管口或燒瓶口上應(yīng)加上一只棉塞。棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)，防止由此而引起的污染；另一方面保證優(yōu)良的通氣性能，使微生物能不斷地獲得無菌空氣。因此棉塞質(zhì)量的好壞對實驗的結(jié)果有著很大的影響。一只好的棉塞，外形與未開傘的蘑菇相似，其大小、松緊都應(yīng)適當(dāng)。加塞時，棉塞總長度的3/5應(yīng)在口內(nèi)，2/5應(yīng)在口外。作棉塞的棉花要選用纖維較長的，一般不用脫脂棉作棉塞，因為它容易吸水變濕，造成污染，而且價格也較貴。在微生物實驗或科研工作中，常常要用到通氣塞。所謂的通氣塞就是用幾層紗布（一般是六至八層）做成的、通氣性能更加良好的塞子。通氣塞加在裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶瓶口

30、上，放在搖床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，可獲得更多的氧氣來促進(jìn)菌體生長或進(jìn)行發(fā)酵。注意: 棉塞塞好以后，試管用棉繩扎成捆。在棉塞的外面包上一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水的沾濕和滅菌后的灰塵侵入。然后再用棉繩扎好，掛上標(biāo)簽，注明培養(yǎng)基的名稱及配制日期。寫上培養(yǎng)基種類，準(zhǔn)備滅菌。注意不能放置時間過長，以免產(chǎn)生污染。35 實驗重點(diǎn)：4、培養(yǎng)基的配制及高壓滅菌 培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。 高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下,鍋內(nèi)溫度達(dá)121。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。 注意

31、：完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到0.1MPa時，開始計時，維持壓力0.1-0.15MPa，20min。36實驗重點(diǎn)：5、高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法a. 加水：直接往滅菌鍋內(nèi)加水至高水位 ；b. 裝料：將待滅菌的物品放在滅菌桶內(nèi)。包于包之間留有適當(dāng)?shù)目障叮岳羝牧魍?。c. 密封： 上下對齊，擰緊螺栓，切勿滴漏氣。d. 升壓： 接通電源加熱 ，排盡鍋

32、內(nèi)空氣；壓力、溫度都上升，e. 滅菌： 待壓力表上升達(dá)到0.1MPa時，鍋內(nèi)溫度達(dá)121，開始計時，20min。f. 降壓： 達(dá)到規(guī)定的滅菌時間后， 切斷電源，讓其自然降壓冷卻。g. 取料：待壓力完全降至“零”后，打開放氣閥，再松動螺栓，拿掉蓋子，從滅菌筒內(nèi)取出滅過菌的材料。h. 倒水：滅菌鍋用好以后，將鍋內(nèi)剩余的水倒掉，以免日久腐蝕。37 討論：如何選擇合適的培養(yǎng)基選擇合適的培養(yǎng)基主要從以下兩個方面考慮：一是基本培養(yǎng)基；二是各種激素的濃度及相對比例。在選擇一種新的植物材料進(jìn)行組織培養(yǎng)時，為了能盡快建立起再生體系，最好選擇一種基本培養(yǎng)基。當(dāng)通過一系列初試之后，可再根據(jù)實際情況對其中的某些成分做

33、小范圍調(diào)整。在進(jìn)行調(diào)整時，以下情況可供參考：一是當(dāng)用一種化合物作為氮源時，硝酸鹽的作用比銨鹽好，但單獨(dú)使用硝酸鹽會使培養(yǎng)基的pH向堿性方向漂移，若同時加入硝酸鹽和少量銨鹽，會使這種漂移得到克服；二是當(dāng)某些元素供應(yīng)不足時，培養(yǎng)的植物會表現(xiàn)出一些癥狀，可根據(jù)癥狀加以調(diào)整.培養(yǎng)基外源激素的作用也會使培養(yǎng)物出現(xiàn)上述一些類似的情況，所以應(yīng)仔細(xì)分析，不可輕易下結(jié)論。38 實驗三.外植體無菌系的建立實驗的目的： 學(xué)習(xí)外植體無菌系的建立過程及操作。實驗的內(nèi)容： 一、外植體材料的選取，以葡萄等嫩莖段做材料 二、外植體消毒器皿、消毒劑的準(zhǔn)備 三、外植體材料的消毒 四、外植體材料的接種39一、外植體材料的選取 外植

34、體是指植物組織培養(yǎng)中的各種接種材料。包括植物體的各種器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。 在操作時，最好將取材植株放在室內(nèi)或較為清潔的環(huán)境中生長一段時間，不要使植株遭受雨淋，應(yīng)避免用噴水的方法給植株供水。否則當(dāng)水分蒸發(fā)后，所遺留的鈣斑有時會將細(xì)菌等微生物覆蓋，在給外植體消毒時，這些細(xì)菌由于包埋在鈣斑中難以被殺死。隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，這些細(xì)菌有時會從破碎的鈣斑時進(jìn)入培養(yǎng)基，從而給以后的培養(yǎng)埋下隱患。 無論是離體培養(yǎng)繁殖種苗，還是進(jìn)行生物技術(shù)研究，培養(yǎng)材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)或特殊的基因型。對材料的選擇要有明確的目的，具有一定的代表性，以提高成功的幾率，增加其實用價值。40外植體材

35、料的選取方法1.選擇健壯的植株 組織培養(yǎng)用的材料，最好從生長健壯的無病蟲的植株上，選取發(fā)育正常的器官或組織。因為這些器官或組織代謝旺盛，再生能力強(qiáng)，培養(yǎng)后比較容易成功。此現(xiàn)象可能是由于外植體內(nèi)部的植物激素水平能夠在接種后得以維持所致。2.選擇最適的時期組織培養(yǎng)選擇材料時，要注意植物的生長季節(jié)和植物的生長發(fā)育階段。一般進(jìn)行快速繁殖時應(yīng)在植株生長的最適時期取材，如選取莖尖，這樣不僅成活率高，而且生長速度快，增殖率高，攜帶細(xì)菌數(shù)量較少，在器官建成上也更為容易，因此是花卉組織培養(yǎng)中經(jīng)常采用的部位。此外，嫩葉、花蕾等攜菌量較少，容易形成愈傷組織。相比之下，生長時間較長的塊莖、鱗莖、球莖等，往往由于攜菌量

36、較多，不易消毒而難以培養(yǎng)成功。花藥培養(yǎng)應(yīng)在花粉發(fā)育到單核期時取材，這時比較容易形成愈傷組織。3.選取適宜的大小建立無菌材料時，取材的大小根據(jù)不同植物材料而異。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活。一般選取培養(yǎng)材料的大小，在0.51.00cm之間。如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小。41 以葡萄的嫩莖為例：葡萄莖屬于莖段培養(yǎng)，莖段培養(yǎng)指不帶芽和帶1個以上定芽或不定芽的，包括塊莖、球莖在內(nèi)的幼莖切段的無菌培養(yǎng)。培養(yǎng)莖段主要的目的是快繁。其次也可探討莖細(xì)胞的生理特點(diǎn)，以及進(jìn)行育種上的篩選突變體的過程。 莖段培養(yǎng)用于快速繁殖的優(yōu)點(diǎn)在于：培養(yǎng)技術(shù)簡單易行，繁殖速度較快；

37、芽生芽方式增殖的苗木質(zhì)量好，且無病，性狀均一；解決不能用種子繁殖的無性繁殖植物的快速繁殖問題等。 具體方法如下：取生長健壯無病蟲的幼嫩莖，剪去葉片，剪成3-4cm的小段。在自來水中沖洗1-3小時，在無菌條件下用75%酒精滅菌30-60秒，再用飽和漂白粉液浸泡10-20分鐘，因材料老嫩和蠟質(zhì)多少而定時間。最后用無菌水沖洗數(shù)次，以備接種。取材時注意莖的基部比頂部切段，側(cè)芽比頂芽的成活率低，所以應(yīng)優(yōu)先利用頂部的外植體，但由于每個新梢僅一個頂芽，也可利用腋芽，莖上部的腋芽培養(yǎng)效果較好。還應(yīng)注意盡量在生長期取芽，在休眠期取外植體，成活率降低。如蘋果3-6月取材的成活率為60%，7-11月下降到10%，1

38、2-2月都下降到10%以下。舉例說明：42二、外植體消毒器皿、消毒劑的準(zhǔn)備 外植體在接種之前，須經(jīng)嚴(yán)格地滅菌。由于滅菌劑的種類不同，殺菌力不同，因此選擇消毒劑，既要考慮具有良好的消毒殺菌作用，同時又易被蒸餾水沖洗掉或能自行分解的物質(zhì)，且不會損傷或只輕微損傷組織材料而不影響生長。在使用不同的藥劑時，需要考慮使用濃度和處理時間?，F(xiàn)將常用的消毒劑列于下表中:43 常用消毒劑44三、外植體材料的消毒 污染的發(fā)生與培養(yǎng)植物的基因型、外植體來源、分離季節(jié)、組織大小及操作人員的技術(shù)水平等有關(guān)。取材組織越大越易污染，夏季取材比冬季取材帶菌多，不同年份的污染情況也有所差異。組織培養(yǎng)中要獲得無菌材料，在綜合上述情

39、況的基礎(chǔ)上，還要選擇適宜的消毒劑。由于不同植物及同一植物不同部位，有其不同的特點(diǎn)，它們對不同種類及其濃度的消毒劑敏感反應(yīng)也不同，所以開始要預(yù)備實驗，以達(dá)到最佳的消毒效果。外植體消毒的步驟如下圖所示：45外植體消毒步驟46外植體消毒的具體操作方法 一般情況下:a.如果外植體較大而且硬，可直接用消毒劑處理，如果實、葉片、莖段、種子等的消毒；b.如果是幼嫩的莖尖，一般先取較大的莖尖，表面消毒后，再在無菌條件下借助解剖顯微鏡取出需要的莖尖大小培養(yǎng)；c.如果是未成熟胚、胚珠、胚乳、花藥等，一般先把子房或胚珠、花蕾表面消毒，再在無菌條件下剝出需要的外植體；d.如果是細(xì)胞，應(yīng)按培養(yǎng)目的，選擇合適的起始材料進(jìn)

40、行相應(yīng)的外植體消毒。47 葡萄組織培養(yǎng)中對外植體的消毒方法很多。甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研究成功的綜合無傷消毒法，損失小，成功率高。其技術(shù)關(guān)鍵在于：休眠枝插入干凈沙床，潔凈室萌發(fā)。若田間取材，要在晴天取上部嫩梢，室內(nèi)或田間均按無菌操作進(jìn)行。無菌操作尖取嫩梢，除去大葉片，剪成短于廣口瓶的枝條，放在無菌的廣口瓶內(nèi)，倒入無菌睡浸泡和沖洗。倒去無菌水，加入0.1%升汞，劇烈搖晃5min-8min，無菌水沖洗3次，剪去受傷葉面，剪成但芽莖段，接入培養(yǎng)基中，一瓶接一個，登記標(biāo)號。 葡萄外植體的消毒方法48四、外植體材料的接種 外植體的接種是把經(jīng)過表面滅菌后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞，轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的全

41、部操作過程。整個接種過程均需無菌操作。 外植體接種過程如下圖所示：49 外植體接種過程 501.外植體和接種工具等消毒滅菌要徹底。2.要時刻樹立無菌觀念：接種過程中不能做撓頭、接聽手機(jī)等與接種無關(guān)的事情；已經(jīng)滅菌過的接種工具、濾紙、接種材料等不要接觸未經(jīng)滅菌的地方等。3.瓶口在打開后和扎口前均要火焰灼燒滅菌，接種室始終在酒精燈火焰無菌區(qū)內(nèi)。4.動作要準(zhǔn)確、迅速、無誤。外植體接種注意事項51實驗四. 植物材料初代培養(yǎng)與繼代培養(yǎng)及培養(yǎng)物的觀察與統(tǒng)計實驗的目的： 1. 學(xué)習(xí)和了解植物組培過程中初代培養(yǎng)及繼代培養(yǎng)植物生長分化情況和形態(tài)建成過程， 2. 掌握培養(yǎng)物的觀察和統(tǒng)計方法。實驗的內(nèi)容： 1、實驗

42、方案的設(shè)計 2、初代培養(yǎng)物的建立 3、試管苗的繼代培養(yǎng) 4、培養(yǎng)反應(yīng)的觀察與統(tǒng)計52一、實驗方案的設(shè)計1.單因子實驗設(shè)計 單因子實驗是組織培養(yǎng)中最常用的實驗方法，尤其在選擇適當(dāng)?shù)募に胤N類和濃度配比上使用最多。 所謂單因子實驗就是在實驗中保持其他因素不變，只改動其中一種因素，從而找出這一因素對實驗材料的影響及影響程度?；九囵B(yǎng)基種類，糖濃度，培養(yǎng)基的pH值，光照強(qiáng)度及時間，培養(yǎng)溫度等可以作為眾多因素中的單因子受到測試，找出最適宜值。為了排除偶然因素的干擾，各種處理必須設(shè)置一定量的重復(fù)，一提高準(zhǔn)確度。一般各種重復(fù)至少3次以上，每瓶3塊以上培養(yǎng)物，設(shè)置的重復(fù)數(shù)量越大，所取得的的結(jié)果越可靠，如果實驗材

43、料有限，也可靈活掌握。2.正交實驗設(shè)計 植物離體培養(yǎng)的成功是由多種因素決定的。正交設(shè)計是多因素分析的有力工具，它可以很方便的從眾多因素中選出主要影響因素及最佳水平，因為它可以用很少的實驗次數(shù)得到較多的信息，例如，一個7因素水平的實驗，若將每個因素水平全部組合都做一遍，需要27 =128次，而正交設(shè)計只需做8次實驗就可以了，雖然實驗次數(shù)減少了，但因為各因素水平搭配均勻，8次實驗基本代表了全部實驗的情況。53二、初代培養(yǎng)物的建立植物組織培養(yǎng)的成功，關(guān)鍵在于初代培養(yǎng)，亦即能否建立起無菌外植體。 在生產(chǎn)實踐中有些種似乎很容易解決，而有的種反復(fù)多次也難以成功。這在于是否真正了解初代培養(yǎng)的特點(diǎn)，并在操作的

44、每個環(huán)節(jié)予以認(rèn)真對待。1、保證無菌 在一個周圍嚴(yán)重污染的環(huán)境中，要千方百計保證培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基的無菌狀態(tài)及培養(yǎng)室的良好清潔環(huán)境條件，這是組織培養(yǎng)成功的基本前提。2、條件適合 要成功地建立初代培養(yǎng)，首先，一定要選擇好合適的作物種類、品種以及培養(yǎng)的部位；其次，一定要選擇合適的培養(yǎng)基，激素以及其他添加物；還要注意掌握適宜的環(huán)境條件。3、操作技術(shù)過關(guān) 要建立初代培養(yǎng)，操作技術(shù)也是十分重要的，特別是熟練的操作技術(shù)。54初代培養(yǎng)物的發(fā)育1.頂芽和腋芽的發(fā)育 采用外源的細(xì)胞分裂素，可促使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動生長，從而形成一個微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結(jié)構(gòu)。在幾個月內(nèi)可以將這種叢生苗的一個枝條轉(zhuǎn)

45、接繼代，重復(fù)芽-苗增殖的培養(yǎng)，并且迅速獲得多數(shù)的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，就能得到可種植到土壤中去的完整的小植株。一些木本植物和少數(shù)草本植物也可以通過這種方式來進(jìn)行再生繁殖，所以是最能使無性系后代保持原品種特性的一種繁殖方式。適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時，只能采用頂芽、側(cè)芽或帶有芽的莖切段，其他如種子萌發(fā)后取枝條也可以。 莖尖培養(yǎng)可看作是這方面較為特殊的一種方式。它采用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進(jìn)行接種。在實際操作中，采用包括莖尖分生組織在內(nèi)的一些組織來培養(yǎng)，這樣便保證了操作方便以及容易成活。用靠培養(yǎng)定芽得到的培養(yǎng)物一般是莖節(jié)較長，有直立向上的莖梢，擴(kuò)繁時主要用

46、切割莖段法，如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會生出不定芽，形成芽叢。552.不定芽的發(fā)育 在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，形成愈傷組織的細(xì)胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構(gòu)成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性(這與胚狀體不同)。多數(shù)情況下它先形成芽，后形成根。 另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，有些植物具有從各個器官上長出不定芽的能力如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。當(dāng)在試管培養(yǎng)的條件下，培養(yǎng)基中提供了營養(yǎng)，特別是提供了連續(xù)不斷植物激素的供應(yīng)，使植物形成不定芽的能力被大大地激發(fā)起來。許多種類的外植體表面幾乎全部為不定芽所覆蓋。在許多常規(guī)方法中不能無性繁殖

47、的種類，在試管條件下卻能較容易地產(chǎn)生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲藏器官能強(qiáng)烈地發(fā)生不定芽，用百合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。 在不定芽培養(yǎng)時，也常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基。用靠培養(yǎng)不定芽得到的培養(yǎng)物，一般采用芽叢進(jìn)行繁殖，如非洲菊、草莓等。563.體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育 體細(xì)胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也通過球形，心形，魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時期，最終發(fā)育成小苗。但它是由體細(xì)胞產(chǎn)生的。胚狀體可以從愈傷組織表面產(chǎn)生，也可從外植體表面已分化的細(xì)胞中產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生。57初代培養(yǎng)外植體的褐變 外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時甚至?xí)?/p>

48、整個培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當(dāng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。 58褐變的主要原因如下：植物品種 研究表明，在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差異，因此，有些花卉品種的外植體在接種后較容易褐變，而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。因此，在培養(yǎng)過程中應(yīng)該有所選擇，對不同的品種分別進(jìn)行處理。 生理狀態(tài) 由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。一般來說，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外

49、植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴(yán)重。一般來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴(yán)重。培養(yǎng)基成分 濃度過高的無機(jī)鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細(xì)胞分裂素的水平過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。培養(yǎng)條件不當(dāng) 如果光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。 59防止、減輕褐變現(xiàn)象的措施選擇合適的外植體 一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。合適的培養(yǎng)條件 無機(jī)鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜溫度、及時繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。使

50、用抗氧化劑 在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外使用0.1-0.5的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。連續(xù)轉(zhuǎn)移 對容易褐變的材料可間隔12-24h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7-lOd后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大為減輕。60三、試管苗的繼代培養(yǎng)1.在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，數(shù)量都還不多，它們需要進(jìn)一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢。2.繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁培養(yǎng)過程。旨在繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，最后能達(dá)到邊繁殖邊生根的目的。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級數(shù)增加的過程

51、。3.繼代培養(yǎng)中擴(kuò)繁的方法包括：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。 切割莖段常用于有伸長的莖梢、莖節(jié)較明顯的培養(yǎng)物。這種方法簡便易行，能保持母種特性。培養(yǎng)基常是MSo基本培養(yǎng)基； 分離芽叢適于由愈傷組織生出的芽叢。培養(yǎng)基常是分化培養(yǎng)基。若芽叢的芽較小?？上惹谐裳繀残K，放入MS。培養(yǎng)基中，待到稍大時，再分離開來繼續(xù)培養(yǎng)4.增殖使用的培養(yǎng)基對于一種植物來說每次幾乎完全相同，由于培養(yǎng)物在接近最良好的環(huán)境條件，營養(yǎng)供應(yīng)和激素調(diào)控下，排除了其他生物的競爭，所以能夠按幾何級數(shù)增殖5.在快速繁殖中初代培養(yǎng)只是一個必經(jīng)的過程，而繼代培養(yǎng)則是經(jīng)常性不停的進(jìn)行過程。但在達(dá)到相當(dāng)?shù)臄?shù)量之后，則應(yīng)考慮使

52、其中一部分轉(zhuǎn)入生根階段。從某種意義上講，增殖只是貯備母株，而生根才是增殖材料的分流，生產(chǎn)出成品。61繼代培養(yǎng)時材料的玻璃化1.實踐表明，當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水跡狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會使試管苗生長緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。2.呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水平較高，細(xì)胞持水力差，植株蒸騰作用強(qiáng)，無法進(jìn)行正常移栽。其嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，因此，使繁殖系數(shù)大為降低。這種情況主要是由于培養(yǎng)容器中空氣濕度過高，透氣性較差造成的。3.在不同的種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差異。62防止玻

53、璃化的方法增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢；減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量；增加光照；增加容器通風(fēng)，最好進(jìn)行C02施肥，這對減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。63四、培養(yǎng)產(chǎn)物的觀察與統(tǒng)計 材料接種培養(yǎng)后，要經(jīng)常進(jìn)行培養(yǎng)后的觀察，及必要的調(diào)查統(tǒng)計，根據(jù)生長情況決定下一個步驟，是轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)基，還是在培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，或是培養(yǎng)成功或失敗，或是可移栽等。觀察與統(tǒng)計的主要內(nèi)容包括以下4個方面：1.愈傷組織 在離體培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)的植物細(xì)胞、組織或器官材料，由于切傷后分泌的傷源激素和

54、培養(yǎng)基中添加的外源激素共同作用下，往往會發(fā)生愈傷組織。以培養(yǎng)材料總數(shù)為分母，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織材料數(shù)為分子，可算出培養(yǎng)材料的誘導(dǎo)率。2.胚狀體 在非洲紫羅蘭葉片的培養(yǎng)中，胚狀體是很容易從形態(tài)發(fā)生數(shù)量等方面加以觀察區(qū)分出來的。以培養(yǎng)材料總數(shù)與分化產(chǎn)生胚狀體材料的數(shù)目，可以算出胚狀體的發(fā)生率。64觀察與統(tǒng)計的主要內(nèi)容3.芽 芽的產(chǎn)生有兩種情況，一種是從愈傷組織上產(chǎn)生不定芽，再一種是從莖尖、側(cè)枝等產(chǎn)生，由于培養(yǎng)基中天家高細(xì)胞分裂素的作用，促進(jìn)腋芽的萌發(fā)，培養(yǎng)中很容易用肉眼觀察到，經(jīng)一個周期的培養(yǎng)可長成一叢芽。產(chǎn)生的芽還可分離接種繼續(xù)擴(kuò)大繁殖，或分離至生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到完整植株，以培養(yǎng)的材料總數(shù)與分化產(chǎn)生芽的數(shù)目，可計算出分化率與每個材料產(chǎn)生芽數(shù)。4.根 根的培養(yǎng)發(fā)生大多所需時間較短，僅個別木本植物長些，一般較容易觀察。根的起源有兩種，一種起源與苗基切口處形成的愈傷組織上，有愈傷組織內(nèi)部形成，另一種起源于苗基切口處愈傷組織的上部，直接起源于中柱鞘細(xì)胞，由于其發(fā)生與莖的中柱相連，故利于移栽成活。最后可計算出發(fā)根率（發(fā)根芽數(shù)/培養(yǎng)芽數(shù)）與每個材料平均發(fā)根數(shù)。65實驗五、試管苗的生根、移栽及苗期管理實驗的目的： 了解試管苗的生根過程與移栽過程，掌握其原理，方法，學(xué)習(xí)試管苗移栽后的管理方法及注意事項，深刻理解“試管苗生根移栽