1、 免疫電鏡細胞化學(xué)技術(shù)第1頁，共37頁。電鏡細胞化學(xué)技術(shù) 電鏡細胞化學(xué)技術(shù)是電鏡技術(shù)與細胞化學(xué)技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的一門新技術(shù)，也稱超微結(jié)構(gòu)細胞化學(xué)。 目的：將化學(xué)研究與形態(tài)觀察相統(tǒng)一，要求在細胞超微結(jié)構(gòu)水平上研究細胞內(nèi)各種生化物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情況以及這些生化物質(zhì)在細胞內(nèi)的動態(tài)變化，用以闡明細胞、細胞器結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系。第2頁，共37頁。 免疫電鏡技術(shù) 免疫電鏡技術(shù)是免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，根據(jù)抗原抗體的高度特異性結(jié)合原理，用高電子密度的標(biāo)記物（如：金、鐵蛋白等）在超微結(jié)構(gòu)水平上檢測某些抗原性物質(zhì)的定位、定性、半定量的一種方法。 第3頁，共37頁。 目前免

2、疫電鏡技術(shù)主要包括酶免疫電鏡技術(shù)，免疫鐵蛋白技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)，此外還有抗體雜交技術(shù)、凝集素電鏡標(biāo)記技術(shù)和鐵蛋白-抗鐵蛋白電鏡復(fù)合物技術(shù)。用以標(biāo)記抗體的酶要具備以下條件：1.與抗體（或抗原）結(jié)合后，仍能保持酶和抗體（或抗原）的生物活性。2.酶的純度高、特異性強、穩(wěn)定、可溶性好、敏感、廉價。3.在體液或組織中不存在該酶的底物。酶標(biāo)技術(shù)中最常用的標(biāo)記酶是辣根過氧化物酶（HRP）第4頁，共37頁。電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù)的標(biāo)本處理原則 1、取材與固定 取材原則與常規(guī)電鏡取材相同，力求保持組織新鮮，標(biāo)本固定要求是既要保持組織成分的抗原性，又要保存細胞的超微結(jié)構(gòu)。低濃度的甲醛短時固定隊抗原性保存好，但是超

3、微結(jié)構(gòu)保存又受影響。 （1）2%多聚甲醛液 （2）2%多聚甲醛-0.01%0.05%戊二醛 （3）4%多聚甲醛-0.5%苦味酸-0.5%戊二醛 第5頁，共37頁。2通過冰凍切片或震動切片獲得厚切片。 冰凍切片 8m ，震動切片2080m。 3漂洗后的厚切片可按免疫組化步驟進行標(biāo)記染色。4DAB顯色后再進行鋨酸后固定以及電鏡包埋切片處理。5. 如果確定待測抗原的抗原性不會由于脫水包埋引起失活的前提下可在包埋切片后做標(biāo)記染色。第6頁，共37頁。三、免疫染色包埋前染色：是指在未經(jīng)包埋的預(yù)切厚片上先進行免疫染色，然后再進行脫水包埋超薄切片。 優(yōu)點：（1）切片染色前未經(jīng)四氧化鋨固定、脫水、包埋等處理，對

4、抗原性破壞較小。（2）可在定位后再進行超薄切片，提高陽性檢出率.（3）免疫染色后，用四氧化鋨后固定，有利于膜型結(jié)構(gòu)的保存。包埋后染色：是指在超薄切片上進行免疫染色。優(yōu)點：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫試劑分子穿透障礙，不需要穿透劑。第7頁，共37頁。2.免疫染色 直接法：用酶標(biāo)抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合，爾后進行酶與底物反應(yīng)，終產(chǎn)物沉淀在抗原抗體反應(yīng)部位。 間接法：依次使用兩種不同抗體，先使用未標(biāo)記的特異性抗體即第一抗體，后者與標(biāo)本中的抗原反應(yīng)。然后使用過氧化物酶標(biāo)記第二抗體，最后酶與底物反應(yīng)，生產(chǎn)沉淀。第8頁，共37頁。結(jié)果判定在已知陽性、陰性樣品成立的前提下，出現(xiàn)高電子密度的顆粒

5、，即指示抗原抗體的存在。第9頁，共37頁。（二）膠體金免疫電鏡技術(shù) 利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負電荷的性質(zhì)，使其與抗體相互吸引從而將抗體標(biāo)記。再以金標(biāo)記的抗體與待檢抗原相互結(jié)合，由于金顆粒的電子密度高，電鏡觀察到金顆粒的位置，即抗原所在。第10頁，共37頁。2、膠體金的特性 顏色：膠體金的顏色與金粒子的直徑有關(guān)，5-60nm時為紅色，95nm是為藍色，用于免疫細胞化學(xué)的膠體金呈紅葡萄酒色。 影響膠體金穩(wěn)定的因素： a.電解質(zhì)：少量有促進穩(wěn)定的作用，過量則破壞。 b.膠體金的濃度：濃度越高容易導(dǎo)致膠體金凝集。 c.溫度：長時間加熱可使穩(wěn)定性有所下降。第11頁，共37頁。 檬酸三鈉的用量與膠體金直徑

6、的關(guān)系0.01%氯化金 1%檸檬酸三鈉 膠體金顆粒直徑 （ml) （ml） （nm）100 3.0 19.0100 4.0 15.0100 6.0 12.5100 1.5 24.5100 1.0 41.0100 0.6 71.5（1）膠體金的制備 檸檬酸三鈉還原法（15nm） 鞣酸-檸檬酸鈉還原法（6nm） 第12頁，共37頁。 鞣酸-檸檬酸鈉還原法制備不同大小膠體金顆粒的配方1%檸檬酸三鈉 1%鞣酸 0.025 mol/L K2CO3 去離子雙蒸水 膠體金顆粒直徑 （ml) （ml） （ml） （ml） （nm） 4 0.02 0 19.98 15 4 0.1 0 19.90 10 4 0.

7、5 0.5 15.00 6.0 4 3 3 14.00 3.5第13頁，共37頁。優(yōu)點： 膠體金能穩(wěn)定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不發(fā)生明顯的變化。 金顆粒具有很高的電子密度，在電鏡下金顆粒清晰可辨，易精確定位。第14頁，共37頁。不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對細胞表面的抗原、受體進行標(biāo)記定位觀察。膠體金標(biāo)記物易于制備，而且可以根據(jù)需要制備不同大小的膠體金，因此可以進行免疫電鏡的雙重標(biāo)記。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)部分結(jié)合金顆粒數(shù)量的多少，可進行粗略的免疫細胞化學(xué)定量研究。 第15頁，共37頁。（2）電鏡包埋前免疫金染色 新鮮組織經(jīng)適當(dāng)固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲醛

8、固定0.51h），制成厚切片。 0.05mol/L TBS pH7.4漂洗3次，每次15min。 0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，滅活自由醛基。 TBS漂洗，5min3次， 1%牛血清孵育組織塊30min。第16頁，共37頁。 第一抗體4孵育過夜后室溫繼續(xù)放置2h。 TBS漂洗，5min3次， 室溫下適當(dāng)稀釋度的膠體金標(biāo)記探針（二抗膠體金探針或蛋白A膠體金探針等）孵育60min。 TBS漂洗，3min3次，后再用雙蒸水漂洗切片。 2%戊二醛-2多聚甲醛固定1h，1%鋨酸固定3060min，常規(guī)脫水，包埋，切片染色后電鏡觀察。第17頁，共37頁。（3）電鏡包埋后免疫金染色法 超薄切片507

9、0nm，置于鎳網(wǎng)或金網(wǎng)中。1% H2O2蝕刻，使試劑能穿透標(biāo)本。EPON包埋的組織蝕刻時間約10min，而LRWhite、LR Gold包埋的組織蝕刻時間則常小于5min.第18頁，共37頁。 雙蒸水漂洗3次，每次10min。 1%牛血清孵育切片15min。 載網(wǎng)不沖洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室溫孵育12h或41824h。 TBS漂洗，3min3次。 室溫下適當(dāng)稀釋度的膠體金標(biāo)記探針（二抗膠體金探針或蛋白A膠體金探針等）孵育3060min。 TBS漂洗，3min3次，后在用雙蒸水漂洗切片。 醋酸鈾和硝酸鉛輕微染色后電鏡觀察。第19頁，共37頁。2.電鏡免疫金染色 用于電鏡的免疫金法可以采

10、用包埋前染色和包埋后染色，可根據(jù)抗原的性質(zhì)加以選擇。 染色方法也有直接法和間接法。第20頁，共37頁。(5)染色結(jié)果判斷假陽性染色和假陰性染色可以通過調(diào)整固定液種類、濃度、固定時間，改變一抗和二抗膠體金探針濃度、孵育時間、溫度等減少假陽性和假陰性染色。第21頁，共37頁。雙標(biāo)記菌毛上兩種抗原，膠體金5nm, 20nm第22頁，共37頁。圖7-11 血小板表面膠體金標(biāo)記GPIb單抗 9000第23頁，共37頁。鐵蛋白標(biāo)記電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù) 鐵蛋白標(biāo)記抗體是由Singer（1959）首創(chuàng)的一種免疫細胞化學(xué)技術(shù)。這技術(shù)曾廣泛應(yīng)用于病毒和細胞表面抗原的檢測。鐵蛋白作為電鏡觀察的標(biāo)記物，具有顆粒大、分

11、辨率高、散射力強的特點，可用于細胞膜表面抗原的準確定位。所以，雖然40年后的今天已發(fā)展了多種免疫電鏡細胞化學(xué)技術(shù)，但鐵蛋白標(biāo)記法仍然是一種基本技術(shù)。 第24頁，共37頁。基本原理： 鐵蛋白是一種直徑1012nm的球形的蛋白質(zhì)（分子量450kD）,它含有致密的鐵膠粒核心（直徑約7.5nm），該核心含20005000個鐵原子，分布于四個區(qū)域，形成四個圓形致密區(qū)，具有很高的電子密度，因此可用于電鏡觀察?？贵w與鐵蛋白通過低分子量的偶聯(lián)劑形成抗體-鐵蛋白復(fù)合物，此復(fù)合物既保留抗體的免疫活性，同時因為鐵蛋白含有高電子密度的鐵膠粒核心，便于電鏡觀察。 第25頁，共37頁。 病毒免疫電鏡技術(shù)第26頁，共37頁

12、。5. 影響因素：1）樣品的純度： 負染色樣品純度要求不是很高，最好進行適當(dāng)純化；樣品雜質(zhì)太多，如大量的細胞碎片、培養(yǎng)基殘渣、糖類、各種鹽類結(jié)晶均會干擾染色效果及電鏡觀察。2）樣品的濃度： 被檢查的樣品要有適當(dāng)?shù)臐舛?。太?太稀均影響電鏡觀察。第27頁，共37頁。 3）樣品與染液的均勻分散度為促進樣品與染料的均勻分散提高染色效果，可以采用某些分散劑 4）懸液與染液的酸堿度 一般以中性或略偏酸性（PH 6.47）為宜。 5）染色時機的把握 吸去過多樣品懸液后盡快滴加負染色液第28頁，共37頁。1、標(biāo)本染液混合染色法：病毒懸液和2的磷鎢酸染液等量混合用毛細管滴到有膜的載網(wǎng)上（吸去過多的病毒染液混合

13、物），待干后進行電鏡觀察。一般認為病毒濃度在105以上時不難發(fā)現(xiàn)病毒。第29頁，共37頁。 2、瓊脂擴散技術(shù)： 檢測的材料中病毒含量不足時，為了達到濃縮病毒的目的，并去除材料中所含鹽分，可采用瓊脂擴散法。 用0.8%瓊脂鋪好的瓊脂塊，把含病毒的懸液滴到瓊脂塊上，然后把載網(wǎng)倒懸在這滴懸液上。瓊脂塊把水分吸收，濃縮的病毒沾附在載網(wǎng)上，再經(jīng)過負染色后進行電鏡觀察。第30頁，共37頁。3、假復(fù)型技術(shù)：瓊脂或瓊脂糖表面上粘附的病毒顆粒，以假復(fù)型的形式轉(zhuǎn)移到火棉膠膜上或Formvar膜上。此種方法：能去除標(biāo)本中的鹽分、濃縮病毒；減少不必要的雜質(zhì)；比較費時。第31頁，共37頁。方法：1）將20%的瓊脂糖塊放

14、到載玻片上，滴上含病毒的懸液，將它放到紫外燈下照射消毒，直到懸液被瓊脂吸干。2）在瓊脂塊的表面加一滴0.5%Formvar溶液，把多余的Formvar用濾紙片吸走。3）用刀片將瓊脂塊的邊緣切除（為便于剝離）輕輕將載有瓊脂塊的載玻片浸入PTA或醋酸鈾溶液中，并把Formvar膜剝離和漂浮到染液水面上。 4）將銅網(wǎng)放到剝離到水面上的 Formvar膜上。5）用不銹鋼小柱把銅網(wǎng)膜同F(xiàn)ormvar膜一起打撈出來，即可進行電鏡觀察。第32頁，共37頁。第33頁，共37頁。4、病毒顆粒免疫電鏡技術(shù)：病毒顆粒與其外周相伴隨的結(jié)構(gòu)成分雜質(zhì)或人工損傷產(chǎn)物混淆不清。 特別是腸道病毒與糞便中成分難以分辨。這種情況需要借助特異性的抗血清（抗體），把病毒顆粒包被、凝聚起來。病毒顆粒經(jīng)過特異性的抗體結(jié)合并凝聚成團之后，在負染色下顯示出病毒結(jié)構(gòu)， 或包被在病毒顆粒表面的抗體，形成抗體橋，這種電鏡技術(shù)稱作免疫電鏡