1、ICS67.080.01CCSX1015內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)DB15/T 25542022發(fā)酵番茄渣中益生性乳酸菌的分離與鑒定技術(shù)規(guī)程Technical regulation for the isolation and identification of probiotic lactic acid bacteria derived from fermented tomato pomace2022-04-25 發(fā)布2022-05-25 實(shí)施內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā) 布DB15/T 25542022I前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定

2、起草。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC 19）歸口。本文件起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院、內(nèi)蒙古大學(xué)。本文件主要起草人：杜瑞平、王瀟、特日格勒、張興夫、武晶晶、宋利文、云伏雨、張春華、羿靜、康長(zhǎng)清。DB15/T 25542022DB15/T 25542022番茄渣來源來自工廠的新鮮番茄渣。發(fā)酵番茄渣的制備與保存每個(gè)聚乙烯塑料袋中稱取100 g番茄渣，用真空包裝機(jī)抽成真空并封口。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，于戶外進(jìn)行為期30 d、 60 d和90 d的厭氧發(fā)酵，在第30 d、60 d和90 d分別取樣，將樣品裝在無菌袋中， 放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室盡快進(jìn)行乳酸菌的分離。 PAGE

3、3 PAGE 2發(fā)酵番茄渣中益生性乳酸菌的分離與鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了發(fā)酵番茄渣中益生性乳酸菌分離與鑒定的規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)與定義、材料及操作規(guī)程等技術(shù)要求與規(guī)范。本文件適用于發(fā)酵番茄渣中益生性乳酸菌的分離與鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 4789.35食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。益生性乳酸菌lactic acid bacteria (LAB）能利用可發(fā)

4、酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸、無芽孢且具有益生性能的革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱。發(fā)酵番茄渣tomato pomace生產(chǎn)番茄醬(汁)后的番茄渣（主要由果皮、種子和少量的殘余果肉組成）經(jīng)微生物發(fā)酵后的產(chǎn)物。序列比對(duì)sequence alignment為確定兩個(gè)或多個(gè)序列之間的相似性或同源性，而將它們按照一定的規(guī)律排列，檢測(cè)序列之間的相似性，從而發(fā)現(xiàn)生物序列中的功能、結(jié)構(gòu)和進(jìn)化信息的一種生物信息學(xué)方法。進(jìn)化樹evolutionary trees通過系統(tǒng)發(fā)育分析所推斷出來的進(jìn)化關(guān)系一般用分枝圖表即進(jìn)化樹來描述，這個(gè)進(jìn)化樹就描述了同一譜系的進(jìn)化關(guān)系，包括了分子進(jìn)化、物種進(jìn)化以及分子進(jìn)化和物種進(jìn)化的綜合。材料

5、操作規(guī)程 菌株和細(xì)胞菌株指示菌：致病性的大腸桿菌（Escherichia coli ATCC25922），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923），購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。試驗(yàn)菌：從發(fā)酵番茄渣中分離出的乳酸菌。細(xì)胞Caco-2細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。 儀器設(shè)備電子天平（感量0.01 g），超純水系統(tǒng)，高壓蒸汽滅菌鍋（137 ，0.25 MPa），超低溫冰箱（-50 -86 ），恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱，厭氧培養(yǎng)箱，普通離心機(jī)，紫外分光光度計(jì)，渦旋振蕩儀， 倒置熒光顯微鏡（40 x640 x），pH計(jì)，PCR儀，電泳儀，凝膠

6、成像儀，低溫高速離心機(jī)（20000 g， 8 10 ）。 試劑與耗材試劑MRS瓊脂培養(yǎng)基，MRS肉湯，MEM培養(yǎng)液，腦心浸出液培養(yǎng)基，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，Agarose Gel DNA Extraction Kit，EcoT14 digest DNA Marker，DL2000 DNA Marker，Taq DNA聚合酶，瓊脂糖，胎牛血清，青鏈霉素雙抗，PBS緩沖液，胃蛋白酶，胰蛋白酶，膽鹽，甘油、過氧化氫、氯化鈉、濃鹽酸、巰基乙酸鈉、丙酮酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、甲醇等均為分析純。耗材T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，90 mm培養(yǎng)皿，15 mL/50 mL離心管，500 mL/25

7、0 mL錐形瓶，0.22M濾膜，牛津杯，加樣器，棉拭子等。溶液配制見附錄A。 乳酸菌的分離、純化和保藏乳酸菌的分離稱取10.0 g發(fā)酵番茄渣加入放有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床中震蕩30 min制備菌懸液并進(jìn)行十倍梯度稀釋，稀釋液涂布于MRS平板上，37 厭氧條件下培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落的大小、顏色、形狀及邊緣特征將不同的菌在MRS平板上進(jìn)行分離。純化與保藏將已經(jīng)分離的菌株在 MRS平板上反復(fù)劃線純化。將純化的單菌落接種于MRS肉湯中，37 厭氧條件下培養(yǎng)24 h，將菌液與60 %的無菌甘油以7：3的比例混勻，密封后放置在渦旋震蕩儀上震蕩混勻，-80 保存。乳酸菌鑒定形態(tài)學(xué)鑒

8、定按GB 4789.35的規(guī)定操作。分子學(xué)鑒定DNA 提取取出-80 凍存的乳酸菌菌株，室溫融化后用接種環(huán)挑取適量菌液，采用三區(qū)劃線法在MRS平板上劃線進(jìn)行活化。用接種環(huán)挑取單菌落到MRS肉湯中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37 厭氧培養(yǎng)18 h用于DNA的提取， 方法參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書。擴(kuò)增提取出的 DNA 用于 16S rDNA 序列的擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為細(xì)菌 16S rDNA 基因序列通用引物，上游引物：27F 5-GAGTTTGAT CCTGGCTCA-3；下游引物：1492R 5-TACCTTGTTACGACTT-3。PCR 反應(yīng)體系如下（50 L）：Template DNA，2 L；

9、dNTP mixture，4 L；Taq (5 U L-21) ，0.25 L；10PCR buffer (Mg2+-free) ，5 L；MgCl (25 mol L-1)，3 L；27F (10 2mol L-1)， 1 L；1492R (10 mol L-1)，1 L；ddH O，33.75 L。PCR反應(yīng)條件：94 預(yù)變性5 min；94 變性1 min，53 退火1 min，72 延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 10 min。測(cè)序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，凝膠成像儀下觀察，可以看到1500 bp左右的條帶。 PCR產(chǎn)物回收參照Agarose Gel DNA Extraction Ki

10、t說明書，回收產(chǎn)物送商業(yè)公司測(cè)序。序列比對(duì)利用Blast ( HYPERLINK /Blast /Blast. cgi) 將待測(cè)菌株的16S rDNA 序列與Genbank中已知細(xì)菌16S rDNA 序列進(jìn)行比對(duì)。將測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列導(dǎo)入到ClustalX1.83中進(jìn)行校準(zhǔn)對(duì)齊，通過MEGA5.05將待測(cè)菌與標(biāo)準(zhǔn)菌的序列進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算出進(jìn)化距離并用neighbor-joining 法建樹，Bacillus subtilis NCDO 1769作為外群，采用Bootstrap法，重復(fù)次數(shù)為1000。 益生性乳酸菌的篩選耐酸性測(cè)定將凍存乳酸菌活化后接種于MRS肉湯中。取5 mL菌液，1000

11、 g 離心10 min，棄上清。加入5 mL無菌生理鹽水混勻制成菌懸液。分別取1 mL菌懸液與9 mL人工胃液混勻，37 培養(yǎng)，在0 h、3 h取樣，梯DB15/T 25542022DB15/T 25542022 PAGE 6 PAGE 5度稀釋涂板計(jì)數(shù)計(jì)算存活率，每種菌3個(gè)重復(fù)。存活率=3 h的菌落數(shù)/0 h的菌落數(shù)100 %，存活率大于10 %即認(rèn)定為可以耐受胃酸的環(huán)境。膽鹽耐受性測(cè)定將凍存乳酸菌活化后挑單菌落接種于MRS肉湯中。將菌液按5%的接種量接種于含0.0 %、0.3 %、0.5 % 和1.0 %膽鹽的MRS-THIO培養(yǎng)基中。37 厭氧培養(yǎng)24 h，分別測(cè)定不同膽鹽濃度培養(yǎng)基的O

12、D值來計(jì)算菌株對(duì)膽鹽的耐受性。膽鹽的耐受性=含有不同濃度膽鹽的培養(yǎng)基的OD值/不含膽鹽培養(yǎng)基的OD值100 %， 存活率大于10 %即認(rèn)定為具有膽鹽耐受性。乳酸菌對(duì) Caco-2 細(xì)胞粘附能力的測(cè)定Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇培養(yǎng)從液氮中取出Caco-2細(xì)胞凍存管，立即放入40 的水浴中搖晃融化。將細(xì)胞懸液吸入裝有8 mL培養(yǎng)液的離心管中，300 g離心8 min，棄上清后加入12 mL的新鮮培養(yǎng)液，用移液槍吹打均勻后加到培養(yǎng)瓶中，于37 、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代消化待細(xì)胞長(zhǎng)到80 %90 %的時(shí)候進(jìn)行傳代。吸掉舊的培養(yǎng)液，用加了雙抗的PBS洗兩次，然后加入1 mL2 mL的胰酶，于3

13、7 放置2 min。顯微鏡觀察，大部分細(xì)胞變?yōu)閳A形后加血清終止消化，反復(fù)吹打直到細(xì)胞完全脫落。300 g離心8 min，棄上清后將細(xì)胞分裝到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)好后消化制成細(xì)胞懸液，加到放有蓋玻片的6孔板中(2 mL/well)，待細(xì)胞貼壁后，吸掉舊的培養(yǎng)液，用不加雙抗的PBS洗2次后用于粘附實(shí)驗(yàn)。粘附能力的測(cè)定將凍存的乳酸菌活化，挑取單菌落接入 MRS 肉湯中厭氧培養(yǎng) 24 h。1000 g 離心 10 min，用無菌的PBS 洗 3 次后，用 MEM 培養(yǎng)液懸浮至 1.0108 CFU/mL，用于后續(xù)的粘附實(shí)驗(yàn)。分別取1 mL的菌液加入.2所述6孔板中37 培養(yǎng)3 h后終止，用無菌PBS洗5

14、次，洗掉未粘附的乳酸菌，室溫晾干后加甲醇固定30 min，將蓋玻片進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察。每張蓋玻片隨機(jī)計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞上粘附的乳酸菌數(shù)量，每組3個(gè)平行。每個(gè)細(xì)胞上粘附3個(gè)以上乳酸菌即認(rèn)定為具有粘附能力。抑菌能力的檢測(cè)菌株活化培養(yǎng)乳酸菌活化培養(yǎng)將凍存乳酸菌活化后挑取單菌落接種于MRS肉湯中。37 厭氧培養(yǎng)24 h后，1000 g離心10 min后取上清。致病菌活化培養(yǎng)將凍存于-80 的Escherichia coli和Staphylococcus aureus分別在固體LB培養(yǎng)基和腦心浸出液培養(yǎng)基上劃線。37 過夜后，挑取單菌落分別接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37 培養(yǎng)24 h后備用。抑菌能力

15、檢測(cè)分別取100 L Escherichia coli和Staphylococcus aureus菌液涂布于固體LB培養(yǎng)基和腦心浸出液培養(yǎng)基上，然后將牛津杯放于平板中央，每種乳酸菌做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。在牛津杯的中央加100 L乳酸菌液，37 培養(yǎng)24 h后測(cè)定每種菌抑菌圈的直徑（mm），結(jié)果用平均差標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑大于等于5.400.20即可認(rèn)定為具有抑菌能力，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于等于15.500.10即可認(rèn)定為具有抑菌能力。AA附 錄 A（規(guī)范性） 溶液配制表A.1規(guī)定了溶液配制方法。表A.1 溶液配制溶液名稱成分制備人工胃液氯化鈉 2 g胃蛋白酶 3.5 g超純水 10