1、 第二節(jié) 肽蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結(jié)合而成的生物大分子。蛋白質(zhì)與多肽并無(wú)嚴(yán)格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大, 從大約6000到106道爾頓甚至更大 一. 基本問(wèn)題-肽 一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。 由兩個(gè)氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個(gè)氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。 1.多肽在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序通常在多肽鏈的一端含有一個(gè)游離的-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一

2、個(gè)游離的-羧基，稱為羧基端或C-端。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開(kāi)始，以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)的排列順序。如上述五肽可表示為： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 2.肽鍵 肽鍵的特點(diǎn)是氮原子上的孤對(duì)電子與羰基具有明顯的共軛作用。組成肽鍵的原子處于同一平面。肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。3 肽的化學(xué)性質(zhì) 肽鍵中的亞氨基雖然不能解離，但肽鏈帶有游離的N-端-NH2和C端-COOH，加上部分氨基酸可解離的R基團(tuán)，因而與氨基酸一樣具有兩性解離的性質(zhì)。 肽的化學(xué)反應(yīng)與氨基酸一樣，游離的-氨基、 -羧基、R基團(tuán)可發(fā)生與氨基酸中相應(yīng)基團(tuán)類似的反應(yīng)

3、，如茚三酮三酮反應(yīng)、sanger反應(yīng)、Edman反應(yīng)等。 含有兩個(gè)以上肽鍵的化合物在堿性溶液中與Cu2+生成紫紅色到藍(lán)紫色的絡(luò)合物，稱為雙縮脈反應(yīng)，可用以測(cè)定多肽和蛋白質(zhì)含量。 4.天然存在的重要多肽 在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。肽類激素：如促甲狀腺素釋放激素（TRH） 谷胱甘肽(glutathione, GSH)谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽谷氨酸的-羧基形成肽鍵SH為活性基團(tuán)為酸性肽是體內(nèi)重要的還原劑谷胱甘

4、肽是某些氧化還原酶的輔酶，對(duì)巰基酶的-SH基有保護(hù)作用，且有防止過(guò)氧化物積累的功能-2H+2H2GSH GSSG-2H+2H參與氧化還原反應(yīng)傳遞氫GSH的作用解毒作用：與毒物或藥物結(jié)合，消除其毒性作用；參與氧化還原反應(yīng)：作為重要的還原劑，參與體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)；保護(hù)巰基酶的活性：使巰基酶的活性基團(tuán)-SH維持還原狀態(tài)； 維持紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定：消除氧化劑對(duì)紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞作用。一種抗菌素1 N-端（氨基端、NH2-端）C-端（羧基端、COOH-端）氨基酸殘基 （110或108）2 肽的結(jié)構(gòu)和命名習(xí)慣：按數(shù)量的多少、按來(lái)源、按功能 二肽、三肽、四肽等、多肽 系統(tǒng)：某氨基酰某氨基酰某氨基酸 重要

5、的肽（生物活性肽）介紹保健品行業(yè)的熱點(diǎn)。3 肽鏈表達(dá)式 從N(OH)到C (H) ，具方向性三字母符號(hào)或單字母符號(hào)表示，中間用“”或“-”表示。一級(jí)結(jié)構(gòu)中的相關(guān)術(shù)語(yǔ) 第三節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) 一. 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 1. 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)(Primary structure)： 即多肽鏈內(nèi)氨基酸殘基從N末端到c末端的排列順序，或稱氨基酸序列，是蛋白質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)。共價(jià)結(jié)構(gòu)包括： (1)組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目， (2)多肽鏈的氨基酸順序， (3)多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。 其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。2 一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定基本戰(zhàn)略：片段重疊法氨基酸順序直測(cè)法 要

6、點(diǎn)：a.測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量及其氨基酸組分 b. 測(cè)定肽鍵的N末端和C末端 c. 應(yīng)用兩種或兩種以上的肽鍵內(nèi)切酶分別在多肽鍵的專一位點(diǎn)上斷裂肽鍵；也可用溴化氰法專一性地?cái)嗔鸭琢虬彼嵛稽c(diǎn)，從而得到一系列大小不等的肽段。 d. 分離提純所產(chǎn)生的肽段，并分別測(cè)定它們的氨基酸順序 e. 將這些肽段的順序進(jìn)行跨切口重疊，進(jìn)行比較分析，推斷出蛋白質(zhì)分子的全部氨基酸序列。蛋白質(zhì)順序測(cè)定基本戰(zhàn)略將肽段順序進(jìn)行疊聯(lián)以確定完整的順序 將肽段分離并測(cè)出順序?qū)Ｒ恍粤呀饽┒税被釡y(cè)定二硫鍵拆開(kāi)純蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)研究測(cè)序前提：樣品必須是均一的(純度大于97%)必須知道它的相對(duì)分子量，其誤差允許在10%以內(nèi)過(guò)程： 1.測(cè)定蛋白

7、質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 2.拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈 3.斷開(kāi)鏈內(nèi)二硫鍵 4.分析每條多肽鏈的氨基酸組成比及數(shù)目 5.鑒定多肽鏈的N、C瑞殘基 6.裂解多肽成小的肽段 7.測(cè)各肽段的氨基酸序列 8.重建完整多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu) 9.確定二硫鍵的位置二、 蛋白質(zhì)的構(gòu)象和維持構(gòu)象的作用力1 構(gòu)型與構(gòu)象 構(gòu)型：立體異構(gòu)體分子中取代原子或基團(tuán)在空間的取向，如幾何異構(gòu)體和光學(xué)異構(gòu)體。構(gòu)型互變需要共價(jià)鍵的斷裂。 構(gòu)象：取代基團(tuán)當(dāng)單鍵旋轉(zhuǎn)時(shí)形成不同的立體結(jié)構(gòu)這種空間位置的改變不涉及共價(jià)鍵的斷裂。2 維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力 蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的穩(wěn)定性主要是靠一系列弱作用力維持的，這些弱作用力主要有氫鍵、鹽鍵、疏水作用、范

8、德華力，此外還有共價(jià)二硫鍵、酯鍵和配位鍵。 1氫鍵 多發(fā)生在多肽鏈中負(fù)電性很強(qiáng)的氮原子或氧原子與NH或OH的氫原子之間。另一方面，水分子的氫原于和羥基基團(tuán)也能和多肽鏈的有關(guān)原子或基團(tuán)形成氫鍵，蛋白質(zhì)表面的側(cè)鏈通常傾向于形成這類氫鍵。2范德華力 一般是指范德華吸引力。3疏水作用 疏水作用實(shí)際上不是疏水基團(tuán)之間相互吸引，主要是介質(zhì)水分子對(duì)疏水基團(tuán)的推斥所致，或者說(shuō)是由于疏水基團(tuán)為了避開(kāi)水分子而被迫靠近。4鹽鍵 又稱離子鍵，蛋白質(zhì)分子中的某些氨基酸，其側(cè)鏈?zhǔn)菐щ姾苫鶊F(tuán)，它們之間可以形成離子鍵。 5二硫鍵 多肽鏈內(nèi)或不同鏈間的兩個(gè)Cys殘基的巰基，在氧化條件下形成二硫鍵。 6配位鍵 兩個(gè)原子之間由單方

9、面提供共用電子對(duì)形成的共價(jià)鍵稱為配位鍵。疏水相互作用力范德華力離子鍵氫鍵維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的作用力a.鹽鍵 b.氫鍵 c.疏水鍵 d.范得華力 e.二硫鍵多肽鏈三. 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的二級(jí)(Secondary)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對(duì)空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象 。（1）肽單元 (peptide unit) 參與組成肽鍵的6個(gè)原子位于同一平面，又叫酰胺平面或肽鍵平面。它是蛋白質(zhì)構(gòu)象的基本結(jié)構(gòu)單位。 繞CN旋轉(zhuǎn)的角稱，而繞CC旋轉(zhuǎn)的角稱。這兩個(gè)角稱為C原子的二面角肽單元HHHH完全伸展的多肽主鏈構(gòu)象-碳原子酰胺平面=1800，=

10、1800=00，=00的多肽主鏈構(gòu)象酰胺平面=00，=00側(cè)鏈非鍵合原子接觸半徑 （2）蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式 -螺旋 ( -helix ) -折疊 ( -pleated sheet ) -轉(zhuǎn)角 ( -turn ) 無(wú)規(guī)卷曲 ( random coil ) （1）-螺旋（ - helix）H2N-端COOH-端 -螺旋結(jié)構(gòu)要點(diǎn): 多肽鏈主鏈圍繞中心軸形成右(或左)手螺旋，側(cè)鏈伸向螺旋外側(cè)。 每圈螺旋含3.6個(gè)氨基酸，螺距為0.54nm。 每個(gè)肽鍵的亞氨氫和第四個(gè)肽鍵的羰基氧形成的氫鍵保持螺旋穩(wěn)定。氫鍵與螺旋長(zhǎng)軸基本平行。多個(gè)肽鍵平面通過(guò)-碳原子旋轉(zhuǎn)，繞一條固定軸形成右手螺旋（N-端至C-端方

11、向）每3.6個(gè)氨基酸殘基上升一圈，相當(dāng)于0.54nm,每個(gè)殘基繞軸旋轉(zhuǎn)100，沿軸上升0.15nm相鄰兩圈螺旋之間借肽鍵中CO和N-H形成許多鏈內(nèi)氫健，即每一個(gè)氨基酸殘基中的NH和前面相隔三個(gè)殘基的CO之間形成氫鍵（1-5），這是穩(wěn)定-螺旋的主要鍵。肽鏈中氨基酸R側(cè)鏈，分布在螺旋外側(cè)* 影響-螺旋穩(wěn)定的因素： R基大?。狠^大的R(如苯丙氨酸、色氨酸、異亮 氨酸)、Gly空間占位很小，電荷：帶同種電荷的R基無(wú)法形成Pro存在 出現(xiàn)“拐角”。結(jié)構(gòu)要點(diǎn)如下：多肽鏈呈鋸齒狀（或扇面狀）排列成比較伸展的結(jié)構(gòu)；有平行式和反平行式兩種，相鄰兩個(gè)氨基酸殘基的軸心距離反平行為0.35nm，平行為0.325nm，

12、側(cè)鏈R基團(tuán)交替地分布在片層平面的上下方所有肽鍵的C=O和NH形成鏈間氫鍵，方向：與軸垂直；-折疊-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲-轉(zhuǎn)角：無(wú)規(guī)卷曲：沒(méi)有確定規(guī)律性的肽鏈結(jié)構(gòu)。 肽鏈內(nèi)形成180回折。 含4個(gè)氨基酸殘基，第一個(gè)氨基酸殘基與第四個(gè)形成氫鍵。 第二個(gè)氨基酸殘基常為Pro。型-轉(zhuǎn)角的第三個(gè)殘基總是Gly-轉(zhuǎn)角：無(wú)規(guī)則卷曲示意圖無(wú)規(guī)則卷曲細(xì)胞色素C的三級(jí)結(jié)構(gòu)1超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域（）超二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)中相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單位（即單個(gè)螺旋或折疊或轉(zhuǎn)角）組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的、在空間上能辯認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體稱為蛋白質(zhì)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)基本組合方式：；超二級(jí)結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)層次上高于二級(jí)結(jié)構(gòu)，但沒(méi)有聚集成具有功能的

13、結(jié)構(gòu)域 四、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)（）結(jié)構(gòu)域 在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽進(jìn)一步卷曲折疊成幾個(gè)相對(duì)獨(dú)立、近似球形的三維實(shí)體，再由兩個(gè)或兩個(gè)以上這樣的三維實(shí)體締合成三級(jí)結(jié)構(gòu)，這種相對(duì)獨(dú)立的三維實(shí)體稱為結(jié)構(gòu)域。 形成意義： 動(dòng)力學(xué)上更為合理 蛋白質(zhì)（酶）活性部位往往位于結(jié)構(gòu)域之間，使其更具柔性 結(jié)構(gòu)域與功能域的關(guān)系： 有時(shí)一個(gè)結(jié)構(gòu)域就是蛋白質(zhì)的功能域，但不總是包含一個(gè)但通常是多個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域Triose phosphate isomerase卵溶菌酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域-螺旋-轉(zhuǎn)角-折疊二硫鍵結(jié)構(gòu)域1結(jié)構(gòu)域22、 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu) 多肽鍵在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過(guò)側(cè)鏈基團(tuán)的相互作用進(jìn)一步卷曲折疊，借助次級(jí)

14、鍵維系使螺旋、折疊片、轉(zhuǎn)角等二級(jí)結(jié)構(gòu)相互配置而形成特定的構(gòu)象。三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成使肽鏈中所有的原子都達(dá)到空間上的重新排布。 實(shí)例：肌紅蛋白 核糖核酸酶核糖核酸酶三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖 N His12CHis119Lys41 肌紅蛋白 (Mb) N 端 C端五、蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)是指由相同或不同的稱作亞基（subunit）的亞單位按照一定排布方式聚合而成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，維持四級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用力是疏水鍵、離子鍵、氫鍵、范得華力。亞基本身都具有球狀三級(jí)結(jié)構(gòu)，一般只包含一條多肽鏈，也有的由二條或二條以上由二硫鍵連接的肽鏈組成。 實(shí)例：血紅蛋白 煙草花葉病毒的外殼蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)煙草花葉病毒外殼蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)的自我組

15、裝血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu) 從一級(jí)結(jié)構(gòu)到四級(jí)結(jié)構(gòu)血紅蛋白蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是它的氨基酸序列蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是由氫鍵導(dǎo)致的肽鏈卷曲與折疊PrimarystructureSecondarystructure蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈自然形成的三維結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)是亞基的空間排列Polypeptide(single subunitof transthyretin)Transthyretin, with fouridentical polypeptide subunitsTertiarystructureQuaternarystructure維系蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)：肽鍵、二硫鍵維系蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)：氫

16、鍵維系蛋白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)：疏水相互作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵維系蛋白質(zhì)分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵 a鹽鍵（離子鍵 ） b氫鍵 c疏水相互作用力 d 范德華力 e二硫鍵 f 酯鍵氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、鹽鍵，均為次級(jí)鍵氫鍵、范德華力雖然鍵能小，但數(shù)量大疏水相互作用力對(duì)維持三級(jí)結(jié)構(gòu)特別重要鹽鍵數(shù)量小二硫鍵對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象很重要，二硫鍵越多，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象越穩(wěn)定離子鍵氫鍵范德華力疏水相互作用力離子鍵氫鍵范德華力離子鍵氫鍵疏水相互作用力范德華力離子鍵氫鍵氫鍵范德華力氫鍵疏水相互作用力范德華力氫鍵第四節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能二、 蛋白質(zhì)高級(jí)構(gòu)象與功能 蛋

17、白質(zhì)復(fù)雜的組成和結(jié)構(gòu)是其多種多樣生物學(xué)功能的基礎(chǔ)；而蛋白質(zhì)獨(dú)特的性質(zhì)和功能則是其結(jié)構(gòu)的反映。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)包含了其分子的所有信息，并決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)和其功能密切相關(guān)。 一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)，也決定蛋白質(zhì)的功能1、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與同源性 實(shí)例：細(xì)胞色素2、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病 實(shí)例：血紅蛋白質(zhì)異常病變鐮刀型貧血病3、蛋白質(zhì)前體的激活與一級(jí)結(jié)構(gòu) 實(shí)例：胰島素原的激活不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目生物 與人不同的AA數(shù)目黑猩猩 0恒河猴 1兔 9袋鼠 10牛、豬、羊、狗 11馬 12雞、火雞 13響尾蛇 14海龜 15金槍魚(yú) 21角餃 23小蠅 25蛾 31小麥 35

18、粗早鏈孢霉 43酵母 44 不同生物來(lái)源的細(xì)胞色素c中不變的AA殘基14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血紅素細(xì)胞色素c分子的空間結(jié)構(gòu)不變的AA殘基 35個(gè)不變的AA殘基，是Cyt C 的生物功能所不可缺少的。其中有的可能參加維持分子構(gòu)象；有的可能參與電子傳遞；有的可能參與“識(shí)別”并結(jié)合細(xì)胞色素還原酶和氧化

19、酶。正常紅細(xì)胞與鐮刀形紅細(xì)胞的掃描電鏡圖鐮刀形紅細(xì)胞正常紅細(xì)胞-鏈N端氨基酸排列順序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys 這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”。豬胰島素原激活成形成胰島素示意圖 高級(jí)構(gòu)象決定蛋白質(zhì)的功能1 、蛋白質(zhì)高級(jí)構(gòu)象破壞，功能喪失 實(shí)例：核糖核酸酶的變性與復(fù)性2 、蛋白質(zhì)在表現(xiàn)生物功能時(shí)，構(gòu)象發(fā)生一定變化（變構(gòu)效應(yīng)） 實(shí)例：血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)和輸氧功能核糖核酸酶變性與復(fù)性作用Native rib

20、onucleaseDenative reduced ribonucleaseNative ribonuclease8 M urea and -mercapotoethanolDialysis變性復(fù)性血紅蛋白輸氧功能和構(gòu)象變化O2HbHb- O2O2血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線活動(dòng)肌肉毛細(xì)血管中的PO20 20 40 60 80 100肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin瘋牛病瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組人和動(dòng)物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為-折疊的PrPsc，從而致病。

21、PrPc-螺旋PrPsc-折疊正常瘋牛病 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)一.蛋白質(zhì)的分子大小蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子，相對(duì)分子質(zhì)量大于10 000.最高可達(dá)40 000 000（煙草花葉病毒） 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定方法1.根據(jù)化學(xué)成分測(cè)定最小相對(duì)分子質(zhì)量 此法首先利用化學(xué)分析方法測(cè)定蛋白質(zhì)分子中某一特殊成分的百分含量，然后，假定蛋白質(zhì)分子中該成分只有一個(gè)，據(jù)其百分含量可計(jì)算出最低相對(duì)分子質(zhì)量： 最小相對(duì)分子質(zhì)量（已知成分的相對(duì)分子、原子質(zhì)量）/已知成分的百分含量 如果蛋白質(zhì)分子中所含已知成分不是一個(gè)單位，則真實(shí)相對(duì)分子質(zhì)量等于最小相對(duì)分子質(zhì)量的倍數(shù)。2. 超離心法 在60 00080 000

22、r/min的高速離心力作用下，蛋白質(zhì)分子會(huì)沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動(dòng)，用光學(xué)方法測(cè)定界面移動(dòng)的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降速度，蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān)。 沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場(chǎng)中的沉降速度，用S表示。 一個(gè)S單位，為110-13秒 相對(duì)分子質(zhì)量越大，S值越大 蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)：1200S 由沉降系數(shù)S可根據(jù)斯維得貝格Svedberg方程計(jì)算蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量： M=RST/D1i R：氣體常數(shù) T：絕對(duì)溫度 D：擴(kuò)散系數(shù) ：溶劑的密度3.凝膠過(guò)濾法 凝膠過(guò)濾所用介質(zhì)為凝膠珠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)一定型號(hào)的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排

23、阻在外。洗脫時(shí)大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來(lái)，洗脫液體積??；小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來(lái)穿去，歷程長(zhǎng)，后洗脫下來(lái)，洗脫體積大。 測(cè)定蛋白質(zhì)分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex 測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積Ve 以相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)（logM）對(duì)Ve作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線 再測(cè)出未知樣品洗脫體積Ve 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法SDS:十二烷基硫酸鈉，變性劑普通蛋白質(zhì)電泳的泳動(dòng)速率取決于荷質(zhì)比（凈電荷、大小、形狀）。用SDS和巰基乙醇（打開(kāi)二硫鍵）處理，蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與SDS結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物；不同蛋白質(zhì)分子的均帶負(fù)電（SDS帶負(fù)

24、電）；且荷質(zhì)比相同（蛋白質(zhì)分子大，結(jié)合SDS多；分子小，結(jié)合SDS少）；不同蛋白質(zhì)分子具有相似的構(gòu)象用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值對(duì)它們的遷移率作圖；測(cè)出待測(cè)樣品的遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的相對(duì)分子質(zhì)量 影響遷移率的主要因素凝膠的分子篩效應(yīng)對(duì)長(zhǎng)短不同的棒形分子會(huì) 產(chǎn) 生不同的阻力主要因素凝膠的濃度和交聯(lián)度同一電泳條件下，分子小，受阻小，游動(dòng)快，遷移率大。相對(duì)分子質(zhì)量大者，遷移率小 優(yōu)點(diǎn)：快速，樣品用量少，可同時(shí)測(cè)幾個(gè)樣品 缺點(diǎn)：誤差大，約為10（誤差主要來(lái)源于遷移距離的測(cè)量誤差） 此方法只能測(cè)得 亞基肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量（一）蛋白質(zhì)的兩性電離 蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸

25、殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。 二. 蛋白質(zhì)的兩性解離和電泳現(xiàn)象 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)( isoelectric point, pI) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。利用蛋白質(zhì)兩性電離的性質(zhì)，可通過(guò)電泳、離子交換層析、等電聚焦等技術(shù)分離蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。 蛋白質(zhì)在溶液中解離成帶電顆粒，在電場(chǎng)中可以向電荷相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。（二）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)屬于生物大分子之

26、一，分子量可自1萬(wàn)至100萬(wàn)之巨，其分子的直徑可達(dá)1100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素膠體溶液是指一定大小的固體顆?；蚧衔锓稚⒃谌苊街兴纬傻娜芤骸?顆粒表面電荷水化膜 由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動(dòng)等。 由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉（三）蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固 * 蛋白質(zhì)的變性(den

27、aturation)在某些物理和化學(xué)因素作用下，蛋白質(zhì)分子的特定空間構(gòu)象被破壞，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。 造成變性的因素：如加熱、乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試劑等 。 變性的本質(zhì)： 破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。 應(yīng)用舉例臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來(lái)消毒及滅菌。防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。 蛋白質(zhì)變性后的性質(zhì)改變：溶解度降低、粘度增加、結(jié)晶能力消失、生物活性喪失及易受蛋白酶水解。若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性。復(fù)性(renaturation) 天然狀

28、態(tài)，有催化活性尿素、-巰基乙醇 去除尿素、-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無(wú)活性* 蛋白質(zhì)沉淀在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會(huì)相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。 * 蛋白質(zhì)的凝固作用(protein coagulation) 蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅(jiān)固的凝塊，此凝塊不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中。 1.可逆沉淀(1)在溫和條件下，通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。(2) 在沉淀過(guò)程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒(méi)有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。(3)可逆沉淀是分離和純化蛋白

29、質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。2.不可逆沉淀(1)在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。(2)由于沉淀過(guò)程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。(3)加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。（四）.蛋白質(zhì)的紫外吸收 大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 這三種氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm 附近顯示強(qiáng)的吸收。 利用這個(gè)性質(zhì)，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定。(五)蛋白質(zhì)主要呈色反應(yīng) 雙縮脲反應(yīng) 酚試

30、劑反應(yīng) 蛋白質(zhì)定量、定性 茚三酮反應(yīng) 測(cè)定常用方法 1.雙縮脲反應(yīng)： 兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成紅色的復(fù)合物。 含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣的反應(yīng)。 肽鍵的反應(yīng)，肽鍵越多顏色越深。 受蛋白質(zhì)特異性影響小。 蛋白質(zhì)定量測(cè)定；測(cè)定蛋白質(zhì)水解程度。 2.米倫氏反應(yīng)酪氨酸的顯色反應(yīng)（酚羥基反應(yīng)）米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉淀，加熱后變成紅色3.乙醛酸反應(yīng)在蛋白質(zhì)溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成色氨酸的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)）鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸明膠中不含色氨酸4.坂（

31、ban）口反應(yīng)精氨酸的反應(yīng)（胍基的反應(yīng)）精氨酸與-萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴酸鈉）溶液中發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物鑒定蛋白質(zhì)中是否含有精氨酸定量測(cè)定精氨酸5.福林試劑反應(yīng)酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)（還原反應(yīng)）福林試劑：磷鉬酸-磷鎢酸 與雙縮脲法結(jié)合-Lowry法在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng)蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物靈敏度提高100倍6.茚三酮反應(yīng)靈敏度差7.黃蛋白反應(yīng)濃硝酸與酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)生成黃色化合物指甲、皮膚、毛發(fā)8.考馬斯亮藍(lán)G-250本身為紅色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)呈藍(lán)色與蛋白的親和力強(qiáng)，靈敏度高1-1000微克/毫升 第六節(jié) 蛋白質(zhì)的分類一. 依據(jù)蛋白質(zhì)的

32、外形分類 按照蛋白質(zhì)的外形可分為球狀蛋白質(zhì)和纖維狀蛋白質(zhì)。1.球狀蛋白質(zhì)（globular protein）：外形接近球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結(jié)晶，大多數(shù)蛋白質(zhì)屬于這一類。2.纖維狀蛋白質(zhì)(fibrous protein)：分子類似纖維或細(xì)棒。它又可分為可溶性纖維狀蛋白質(zhì)和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)。如膠原、角蛋白、絲蛋白等。二.依據(jù)蛋白質(zhì)的組成分類 按照蛋白質(zhì)的組成，可以分為1.簡(jiǎn)單蛋白(simple protein) ：又稱為單純蛋白質(zhì)；這類蛋白質(zhì)只含由-氨基酸組成的肽鏈，不含其它成分。（1）清蛋白和球蛋白：albumin and globulin廣泛存在于動(dòng)物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋

33、白微溶于水，易溶于稀酸中。（2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于7080乙醇中。（3）精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質(zhì)，存在與細(xì)胞核中。（4）硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。2.結(jié)合蛋白(conjugated protein)：由簡(jiǎn)單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成（1）色蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與色素物質(zhì)結(jié)合而成。如血紅蛋白、葉綠蛋白和細(xì)胞色素等。（2）糖蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與糖類物質(zhì)組成。如細(xì)胞膜中的糖蛋白等。（3）脂蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與脂類結(jié)合而成。 如血清-，-脂蛋白等。（4）

34、核蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與核酸結(jié)合而成。如細(xì)胞核中的核糖核蛋白等。（5）金屬蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與金屬離子的結(jié)合物。如鐵硫蛋白、鐵氧還蛋白、細(xì)胞色素類等含鐵、銅、鋅、鉬的蛋白，肌漿鈣蛋白、嗜熱菌蛋白酶等。（6）磷蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)和磷酸組成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、彈性蛋白、絲心蛋白等。一、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則 1、前處理 2、粗分級(jí)：通常用鹽析、等電點(diǎn)沉淀、超濾、有機(jī)溶劑分級(jí)等簡(jiǎn)便、處理量大的方法從蛋白質(zhì)混合液中除去大量雜質(zhì)，得到濃縮蛋白質(zhì)溶液。 3、細(xì)分級(jí)：選用分辨率高的方法進(jìn)一步提純，如經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾、吸附層析、離子交換層析、反相高效液相層析、親和層析以及凝膠電泳、等電聚焦等。第七節(jié) 蛋白質(zhì)

35、的分離和純化（一）透析及超濾法* 透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)的方法。* 超濾法：應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。（二）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀 *使用丙酮沉淀時(shí)，必須在04低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 *鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。 *免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識(shí)別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。 （三）電泳蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移