1、單個精子轉錄組學、基因組學特征及在男性不育診斷中的應用1申 請 人： 喬中東依托單位：上海交通大學 生命科學技術學院協(xié)作單位：上海交通大學 醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院 上海人類基因組研究中心匯報提綱課題的背景及意義研究內容工作基礎社會效益和經濟效益2匯報提綱課題的背景及意義研究內容工作基礎社會效益和經濟效益31、社會需求WHO統(tǒng)計表明： 約10的育齡夫婦患有不育癥，其中：男性不育占50男性不育中，約有不到15%的原因是明確的，如輸精管梗阻、無精、少精、精子發(fā)育不良等現(xiàn)行的男性不育的診斷是精液的質量標準超過85%的男性不育原因不明42、指南要求2. 醫(yī)學科技2.2 單細胞操縱、測序與實時成像技術應用研究

2、2.2.3 單細胞精確操縱與基因組測序新方法在生殖醫(yī)學領域的應用研究 建立單細胞水平上的精確操縱和控制技術，全基因組完整染色體的單倍型解析，單個生殖細胞 (精子，卵細胞)及胚胎單細胞的全基因組測序及定量分析，應用于遺傳疾病的診斷和篩查。53、技術成熟Illumina公司的HiSeq 2500測序平臺，測序通量高達600-1000 Gb，可同時完成6-10個樣本、測序覆蓋度達30倍的人全基因組深度測序測序樣品都是大量細胞的混合DNA/RNA樣本。微克級甚至毫克級樣本量無法滿足測序對樣品量的需求細胞之間的基因組序列和基因表達存在很大的異質性和差異性，對群體樣品或混合樣品進行研究得到的結果只是一群細

3、胞中信號的平均值，或者只代表其中占優(yōu)勢數(shù)量的細胞信息63.1 單細胞測序新方法的誕生2012年發(fā)明單細胞全基因組擴增技術美國科學院院士,哈佛大學謝曉亮教授73.2 單細胞全基因組測序的應用8追蹤癌細胞2012年，Nature protocol紐約冷泉港實驗室與MD 安德森癌癥中心單個人精子基因組測序2013年，Cell斯坦福大學單個人卵子基因組測序2013年，Cell北京大學與北醫(yī)三院人早期胚胎細胞轉錄組測序2013年，Nature北京大學與北醫(yī)三院3.3 精子中保留著RNA9成熟哺乳動物精子中RNA的種類和數(shù)量基因芯片，第一次獲得較完整的人精子轉錄組序列2002年，Lancet美國韋恩州立大

4、學SAGE技術，對人精子轉錄組序列進行研究2006年，Human Reproduction上海交通大學RNA-Seq技術，對小鼠精子中的mRNA進行測序2014年，Biology of Reproduction上海交通大學精子中保留下的mRNA可能功能父系染色體組裝精子成熟 介導遺傳印跡 維持胚胎發(fā)育3.4 精子中保留的RNA的可能功能3.5 精子中保留的RNA在胚胎早期發(fā)育中的作用11精子RNA潛在的功能部分精子mRNA進入了受精卵2004，Nature美國韋恩州立大學精子中microRNA-34c是受精卵早期發(fā)育必需的2012，PNAS香港大學精子傳遞的Wnt4在受精卵中被翻譯2014年，

5、Biology of Reproduction上海交通大學精子中Dby影響受精卵早期發(fā)育2010，Asian Journal of Andrology上海交通大學精子中的非編碼RNA影響后代的精神狀況2014年，Nature日內瓦大學父親傳遞給后代的絕不僅僅是基因組DNA那么，男性不育是否與精子中保留的RNA有關？12匯報提綱課題的背景及意義研究內容工作基礎社會效益和經濟效益131、問題的提出如何從分子水平上診斷男性不育(有需求)是否可以借助單細胞測序技術對單精子進行轉錄組測序分析(有技術)是否可以根據轉錄組的測序結果提出診斷男性不育的分子標記(有想法)142、總體目標 對男性不育的精子，進行

6、單個精子的轉錄組測序并通過生物信息方法，構建正常和不育精子的統(tǒng)一參考數(shù)據庫；將發(fā)現(xiàn)的重要標記物，用于男性不育的診斷和篩查。153、研究內容A 男性不育個體的篩選和小鼠模型的建立 1) 自然環(huán)境下男性不育精子標本的篩選; 2) 自然環(huán)境下不孕不育小 鼠的篩選; 3) 體外受精; 4) 受精卵體外發(fā)育B 單個精子轉錄組測序C 單個精子的轉錄組分析 1) 基因表達譜分析; 2) 表達差異基因的功能分析D 單個精子轉錄組數(shù)據的比對分析E 生物標記物在小鼠和患者中的驗證F 單個精子轉錄組圖譜在其他遺傳病中的應用164、技術路線5、技術難點單個細胞中全部轉錄本進行非選擇性的、均勻的反轉錄，是實現(xiàn)獲得基因表

7、達狀態(tài)下進行沒有序列偏好性測序的前提，轉錄本的無偏差反轉錄及擴增是單細胞轉錄組測序技術的最大難點精子中的RNA量僅占正常細胞的1/600，這是實現(xiàn)單細胞轉錄組測序的第二大難點186、年度計劃本項目計劃在3年內完成2015年：收集正常和男性不育的精子、建立單個精子的分選方法、建立單個精子測序的方法 2016年：繼續(xù)收集男性不育的精子、對單個精子進行測序、運用生物信息學對所得數(shù)據進行分析歸納2017年：將獲得的生物標記物在臨床和小鼠模型上進行驗證、總結及成果鑒定197、預期目標1) 建立并優(yōu)化單精子轉錄組序列測定方法2) 建立統(tǒng)一的正常和男性不育精子的轉錄組學學數(shù)據庫3) 篩選出2-3個可應用于臨

8、床診斷男性不孕不育的標記物，并在臨床和動物上予以驗證4) 申請國內外專利1-2項，發(fā)表SCI論文3-5篇6) 培養(yǎng)青年科學家2-3人和碩士博士研究生各2人20匯報提綱課題的背景及意義研究內容工作基礎社會效益和經濟效益21喬中東課題組長期從事精子中轉錄組學的研究發(fā)現(xiàn)精子中保留的RNA參與了胚胎早期發(fā)育發(fā)現(xiàn)精子中的microRNA對后代有影響22 2012年與仁濟醫(yī)院李錚課題組合作對一些不育的人精子樣本(符合WHO正常精子標準)進行蛋白組和轉錄組的研究232013年與上海人類基因組研究中心王升躍課題組合作對正常小鼠和人精子轉錄組進行測序，并通過數(shù)學模型估算出每條精子中可能存在的mRNA數(shù)量和種類2

9、4上海市輔助生殖與優(yōu)生重點實驗室 衛(wèi)生部行業(yè)規(guī)范化示范精子庫基地申報專利24項，發(fā)表SCI論文31篇 李錚課題組從事臨床男科學研究25不育精子癥患者病例信息采集流程26臨床資料登記（紙質）手術記錄培養(yǎng)結果樣本庫電子檔案（電子化）王升躍/李沖課題組長期從事基因組測序上海人類基因組研究中心擁有國際一流的測序技術平臺和遺傳性疾病分子分型技術平臺進行了大量的全基因組、全外顯子、目標區(qū)域基因組學和轉錄組學的研究，及DNA甲基化和miRNA等表觀遺傳學等測序工作在Nature, Science, Nature Genetic, Genome Research, PNAS等雜志發(fā)表SCI論文130多篇，申報

10、發(fā)明專利494項，獲得發(fā)明專利24項獲得國家和上海市等科技獎勵38項27南方中心高通量測序技術平臺測序技術系統(tǒng)測序通量Gb/run讀長測序時間/run454 GS FLX+0.7500-1000 bp1 天HiSeq 2500600/1002X100/2X150 bp8/1 天 PacBio RS II38.5/32 kb1天454 GS FLX 2007./2011HiSeq 2500 2011/2013PacBio RS II 2013第三代單分子實時測序技術南方中心大規(guī)?？焖贁?shù)據存儲和分析計算機系統(tǒng)計算: 300核內存: 共4T(3T為共享內存用于大規(guī)模拼接)存儲: 300T 高速磁盤陣

11、列(40Gb 高速互聯(lián))網絡: 核心節(jié)點40Gb Infiniband高速互聯(lián)和 輔助千兆以太網雙網絡三個課題組優(yōu)勢互補項目申請人及其合作者長期從事男性生殖的基礎和臨床研究工作、基因組和轉錄組序列分析及生物信息分析等工作，積累了豐富的研究經驗。我們將依托上海交通大學附屬仁濟醫(yī)院的上海人類精子庫、上海交通大學分析測試中心、上海人類基因組研究中心等具有的一流科研工作條件，充分利用三個團隊互補的優(yōu)勢，以保障本項目的順利實施。29項目分工上海交通大學喬中東課題組自然環(huán)境下不育小鼠模型建立單精子轉錄組測序測序數(shù)據分析、比對及男性不育標記物的篩選臨床上指標正常但不育精子樣本收集在不育樣本中驗證篩選出的標記物將標記物應用于男性不育的診斷上海人類基因組研究中心王升躍課題組仁濟醫(yī)院李錚課題組經費預算及分配本項目申請國家經費200萬元。依據各參與單位的研究任務，預算如下： 上海交通大學120萬元 上海人類基因組研究中心80萬元31匯報提綱課題的背景