1、. ZJNSF 浙江省自然科學基金懇求書( 2006版) 第 PAGE 4頁：.；懇求書版本號：23310772 同行評議組別藥物化學與生化藥學工程編號Z206510浙江省自然科學基金申 請 書申報類別:重點、艱苦工程工程稱號:天然來源新型抗腫瘤藥物先導的快速識別研討申 請 者:潘遠江電 話托單位:浙江大學/理學院通訊地址:浙江大學化學系郵政編碼:310027 :申報日期:2006-5-25浙江省自然科學基金委員會二OO六年制根本信息懇求者信息姓 名潘遠江性別男出生日期1966年09月19日最終學位博士獲學位年份1994職稱教

2、授主要研討領(lǐng)域天然藥物化學與有機波譜學電 人網(wǎng)頁/bnpc依托單位浙江大學/理學院證件類型身份證證件號碼620212660919533懇求者能否近三年調(diào)入在浙單位任務否調(diào)入時間 懇求者曾主持的浙江省自然科學基金資助工程編號:298017,R00042懇求者正在主持的國家和省部資助經(jīng)費在20萬元及以上的研討工程稱號、來源和研討期限:抗氧化植物多酚的新型逆流色譜分別方法研討 國家自然科學基金 23 2005.12007.12 質(zhì)譜在天然來源抗腫瘤活性成分靶向挑選中運用 國家自然科學基金 23 2005.120

3、06.12 工程根本信息工程稱號天然來源新型抗腫瘤藥物先導的快速識別研討申報類別重點、艱苦工程研討屬性前瞻性運用根底研討同行評議組別醫(yī)藥科學/藥物化學與生化藥學依托基地稱號 估計研討年限2007年01月2021年12月總經(jīng)費預算20.0萬元懇求經(jīng)費20.0萬元工程研討目的、內(nèi)容和意義簡介(限400字)選擇浙江產(chǎn)幾種抗腫瘤藥用植物-蘭科植物石豆蘭屬和石斛屬植物廣東石豆蘭Bulbophyllum kwangtungense Schlecht與細莖石斛Dendrobium.moniliforme為研討對象，對其中的抗腫瘤生物活性成分進展研討,重點關(guān)注這些植物中含量低微，構(gòu)造新穎的有效成分的研討。本工

4、程擬以基因工程獲得的具有激酶活性的病毒癌基因表達蛋白v-Src作為蛋白質(zhì)靶標分子, 在分子程度上對藥用植物中的假設干含量低微的新的抗腫瘤活性分子進展靶向挑選, 經(jīng)過高分辨質(zhì)譜以及液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析手段進展這些成分的分析確定，開展并建立微量程度上的天然來源新型抗腫瘤藥物先導的快速識別新途徑，并在此根底上，結(jié)合其他波譜手段結(jié)合體外藥理驗證，獲得一系列具有新穎構(gòu)造與良好抗腫瘤活性、具有運用前景的新型藥物先導,為創(chuàng)制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗癌新藥的研討提供科學根據(jù).關(guān)鍵詞不超越4個v-Src;抗腫瘤藥物先導；快速識別；質(zhì)譜分析同行評議分組闡明天然藥物化學 重點資助方向創(chuàng)新藥物的根底與藥物資源學研討工程

5、組主要成員編號姓名出生日期性別職稱學位單位稱號工程分工每年任務時間月(月)1潘遠江1966年09月19日男教授博士浙江大學/理學任人82吳曉丹1971.07.16女高級工程師碩士浙江大驗研討93王丹華1966.05.31男博士后博士浙江大驗研討84何山1982.01.12男博士生學士浙江大驗研討95胡楠1982.10.10女博士生學士浙江大驗研討96萬結(jié)平1982.01.17男碩士生學士浙江大驗研討97 總?cè)藬?shù)高級中

6、級初級博士后博士生碩士生參與單位數(shù)62001211闡明：1.個人引見部分懇求者必需填寫，其他人員可以不填寫；2.高級、中級、初級、博士后、博士生、碩士生及參與單位數(shù)由懇求者擔任填報，總?cè)藬?shù)自動生成；3.第一人必需是懇求者，信息從前面自動讀入，但每年任務時間必需手工錄入。ZJNSF 浙江省自然科學基金懇求書2006版 第 PAGE 18頁懇求書版本號：23310772個人引見：潘遠江：學 歷： 1984.91988.6 蘭州大學化學系 理學學士 1988.91991.6 蘭州大學化學系 理學碩士 西北產(chǎn)藏藥翠雀花中二萜生物堿研討 導師：陳耀租 院士 1991.91994.6 蘭州大學化學系 理學

7、博士 生物活性分子的質(zhì)譜研討 導師：陳耀租 院士任務閱歷：1994.91996.5 浙江大學化學系 博士后1996.71997.10 瑞士伯爾尼大學化學與生物化學系 博士后1995年11月 浙江大學化學系有機與藥物化學研討所 副教授1999年11月 浙江大學化學系有機與藥物化學研討所 教 授 兼任浙江大學藥學院 教 授2000.11 浙江大學化學系 教授, 博導主要學術(shù)兼職： 中國化學會有機分析與生物分析專業(yè)委員會副主任 中國化學會,編委, 中國藥學會高級會員 杭州師范學院兼職教授主持的主要研討工程有：1質(zhì)譜在天然來源抗腫瘤活性成分快速挑選中的分析研討 11.5 萬元 2000-2002，擔任

8、人 已完成2冠心II號組成原理根底研討 38 萬元 2001-2003，化學擔任，已完成3質(zhì)譜在天然抗腫瘤活性成分靶向挑選與分析中的運用 23 萬元 2003-2005，擔任人，在研4生物活性植物多酚的逆流色譜分別新方法研討 23 萬元 2003-2005，擔任人，在研5中藥活性成分快速挑選的現(xiàn)代組合化學研討-省自然科學基金委人才基金 30萬元，2001-2003，擔任人，已完成6浙江傳統(tǒng)中藥抗癌生物活性成分快速挑選與構(gòu)造測定-省自然科學基金工程 4萬元，1999-2001，擔任人， 已完成。已發(fā)表學術(shù)論文120多篇，被SCI收錄100余篇，作為通訊作者的代表性SCI論文有：1. Lu, Xi

9、ngguo Gong, Yuwen Lu, Jianjun Guo, Chenhui Wang, And Yuanjiang PanMolecular Cloning And Functional Characterization Of A Cell-Permeable Superoxide Dismutase Targeted To Lung Adenocarcinoma Cells: J. Biol. Chem., May 2006; 281: 20 272.Cao Xj, Tal Yp, Li Xy, Pan YJ Screening For Pregnane Glycosides Wi

10、th Immunological Activities From The Stems Of Stephanotis Mucronata By High-Performance Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry Rapid Communications In Mass Spectrometry 2006, 20 (3): 403-411 3.Wang Kw, Sun Cr, Wu Xd,Pan YJ Novel Bioactive Dammarane Caffeoyl Esters From Celastrus Rosthornianu

11、s Planta Medica 2006,72 (4): 370-372 4. Huang SL, Pan YJ, Zhu WL, Wu AX A Novel Three-Component One-Pot Reaction Involving Alkynes, Urea Or Thiourea, And Aldehydes Orgnaic Letters 2005,7 (17):3797-3799 5. Lu YB, Sun CR, Wang Y, Pan YJ.Preparative Isolation And Purification Of Two Phenylbutenoids Fro

12、m The Rhizomes Of Zingiber Cassumunar By Upright Counter-Current Chromatography Journal Of Chromatography A 2005,1089 (1-2): 258-262 6. Wu SH, Sun CR, Pan YJ Preparative Counter-Current Chromatography Purification Of Valrubicin (AD-32) From Crude Synthetic Drug Using Upright Coil Planet Centrifuge W

13、ith Four Multilayer Coils Connected In Series Journal of Chromatography A 2005,1076 (1-2): 207-211 7. Zhu YL， Huang Sl, Wan JP, Yan L And Pan YJ Two Novel Diastereoselective Three-Component Reactions Of Alkenes Or 3,4-Dihydro-(2H)-Pyran With Urea/Thiourea - Aldehyde Mixtures: 4+2-Cycloaddition Vs Bi

14、ginelli-Type Reaction Org. Lett., 2006, ASAS Article.8. Wu SH, Sun CR, Pei SF, Pan YJ Preparative Isolation And Purification Of Amides From The Fruits Of Piper Longum L. By Upright Counter-Current Chromatography And Reversed-Phase Liquid Chromatography Journal of Chromatography A 2004 1040 (2): 193-

15、204 9. Wu SH, Sun CR, Wang KW, Pan YJ Preparative Isolation And Purification Of Celastrol From Celastrus Orbiculatus Thunb. By A New Counter-Current Chromatography Method With An Upright Coil Planet Centrifuge Journal of Chromatography A 2004,1028 (1): 171-174 10. Zhang H, Gu Q, Liang Xl, Pan YJ Scr

16、eening For Topoisomerase I Binding Compounds By High-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analytical Biochemistry 2004,329 (2): 173-179 懇求經(jīng)費預算 20.0 萬元 方案開支工程稱號計算根據(jù)及理由金額萬元1信息費10000 文獻調(diào)研,聯(lián)機檢索與查新等 1.02專題學術(shù)活動費15000 出席國內(nèi)外會議1.53儀器和設備購置費15000 色譜柱與進口滲析膜等1.54能源資料費130000 藥材采集、藥品購置、正反相資料購置、玻璃易耗品

17、、化學試劑與NMR、MS等測試費13.05方案管理費10000 按規(guī)定，用于水電補貼1.06人員費20000 碩、博士生勞務補貼，發(fā)表論文補貼2.0注：開支范圍和規(guī)范參見浙財教字200220號。 懇求者承諾：我保證： 1懇求書內(nèi)容是真實的；2遵守科學品德，倫理品德的根本原那么；3工程組成員知曉懇求書內(nèi)容，并自愿參與研討任務；4已照實填報懇求者正在主持的國家和省部資助經(jīng)費在20萬元及以上的研討工程稱號、來源和研討期限；5假設獲得資助，我將履行工程擔任人職責，嚴厲遵守浙江省自然科學基金委員會的有關(guān)規(guī)定，真實保證研討任務時間，仔細開展任務，按時報送有關(guān)資料。假設填報失實或違反規(guī)定，本人將承當全部責任

18、。 簽字： 日期：工程依托單位承諾:已按規(guī)定對懇求人的資歷和懇求書內(nèi)容進展了審核。懇求工程如獲資助，我單位保證對方案實施所需求的人力、物力和任務時間等條件給予保證，嚴厲遵守浙江省自然科學基金委員會有關(guān)規(guī)定，督促工程組遵守科學品德和倫理品德的根本原那么，督促工程擔任人和本單位工程管理部門按照規(guī)定及時報送有關(guān)資料。依托單位公章 日期 .正文撰寫提綱1、工程稱號天然來源新型抗腫瘤藥物先導的快速識別研討2、研討任務對浙江經(jīng)濟、社會和科技開展的意義中草藥藥用植物有效成分研討是發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)制新藥的一條重要途徑，不斷令人關(guān)注。長期以來，該研討獲得了許多極具運用價值的新型藥物如紫杉醇等或其他藥物先導化合物如鬼臼毒

19、素等, 為人類安康做出了奉獻。數(shù)十年來，我國在中草藥有效成分的研討方面獲得了長足的提高，也積累了豐富的閱歷，為天然藥物的創(chuàng)新研討奠定了良好的根底。然而，由于中草藥化學成分普通都非常復雜，傳統(tǒng)的研討方式科技條件限制往往只關(guān)注含量較為豐富的主要化學成分，且其有效成分的分別提取與藥效驗證明驗往往是脫節(jié)的；這種方式經(jīng)常會構(gòu)成費時費力的無效分別；既大大降低了從中草藥有效成分出發(fā)創(chuàng)制新藥的效率，又往往會忽略一些含量極其低微的新型有效成分；而這些新的微量有效成分很能夠是新型藥物先導的重要源泉。因此，在中草藥有效成分的研討過程中，必需充分借用現(xiàn)代高新技術(shù)手段，開展與建立微量程度上的生物活性成分快速識別的新方法

20、，才干突破傳統(tǒng)研討方式的制約，加大尋覓與發(fā)現(xiàn)新型藥物先導的能夠性。在藥物西藥的研討中，曾開展經(jīng)過挑選化學庫組合庫、化合物庫來尋覓及優(yōu)化藥物先導(西藥)的新技術(shù)1，這一研討途徑可改動傳統(tǒng)的逐一合成或分別提取、逐一純化及逐一識別的方式，從而加快了藥物先導化合物出現(xiàn)的速度，這一技術(shù)也為中草藥有效成分天然的復雜的化合物庫中的某些特定化合物的研討提供了新思緒。在快速挑選化合物庫的新技術(shù)中，基于生物親合等分子間相互作用力分析的靶向挑選遭到了廣泛的關(guān)注2，其中一些與生命活動親密相關(guān)的酶或蛋白等經(jīng)常作為靶標分子而被研討；這種基于靶標分子與藥物分子配體或抑制劑的相互作用的體外生物活性挑選，便構(gòu)成一種非常靈敏的生

21、物活性分子的快速發(fā)現(xiàn)的途徑，這一研討方法的勝利運用除一是要選擇適宜靶標分子，二是要尋求與之匹配的活性分子定性檢測的高靈敏度的分析方法，飛速開展的現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)如電噴霧電離結(jié)合高分辨技術(shù)質(zhì)譜ESI-HRMS等因其具有快速，靈敏度高以及易與分別手段如HPLC聯(lián)用等特點正成為現(xiàn)代藥物研討最重要的分析手段之一3-4?？鼓[瘤藥物的研討與創(chuàng)制是關(guān)系到人類安康的艱苦課題之一，而從中草藥出發(fā)尋求與發(fā)現(xiàn)高效低毒的新型抗腫瘤藥物不斷是醫(yī)藥行業(yè)極為關(guān)注的熱點研討領(lǐng)域；如前所述，在傳統(tǒng)的中草藥有效成分研討根底上，盡快開展微量程度上的生物活性成分的研討，將大大豐富抗腫瘤藥物先導的新源泉，在我們前期的研討中，本課題組曾以拓

22、撲異構(gòu)酶以及微管蛋白作為靶分子，結(jié)合質(zhì)譜分析對一些抗癌藥物分子進展了勝利的挑選與分析5-6，然而由于拓撲異構(gòu)酶，微管蛋白的活性堅持較為困難，因此基于這些靶標分子的活性成分挑選的運用遭到很大的限制，為了討論并建立更具運用前景的微量新型天然來源抗腫瘤活性成分挑選與分析一體化的新途徑，適宜靶標分子的選擇與運用不斷是我們極為關(guān)注的問題。近年來癌基因蛋白產(chǎn)物Src的發(fā)現(xiàn)引起人們的廣泛興趣，由于Src蛋白含有兩種主要方式即病毒癌基因表達蛋白v-Src與細胞原癌基因表達蛋白c-Src，c-Src蛋白的表達和活性異常是某些腫瘤發(fā)生、開展的緣由之一，而v-Src蛋白本身就能誘導細胞的轉(zhuǎn)化與腫瘤的發(fā)生；因此研討開

23、發(fā)Src蛋白抑制劑作為強效腫瘤抑制劑已成為目前國際醫(yī)藥界廣為關(guān)注的亮點7-8。為此，本工程擬以基因工程獲得的具有激酶活性的病毒癌基因表達蛋白-v-Src作為蛋白質(zhì)靶標分子, 在分子程度上對中草藥中的一些新的微量抗腫瘤活性分子進展靶向挑選, 結(jié)合高分辨質(zhì)譜及液質(zhì)聯(lián)用分析手段，對這些活性分子進展分析確定，從而開展并建立微量程度上的天然來源新型抗腫瘤藥物先導的快速識別新途徑。浙江省藥用植物資源分布極其豐富，對這些藥物，除需求充分發(fā)揚傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物化學的研討方法優(yōu)勢外，還需盡快自創(chuàng)國際上先進的研討方法，開辟新的研討思緒， 將為我省研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新藥奠定扎實根底并提供一條可行的捷徑。本工程研討將

24、為尋覓發(fā)現(xiàn)新藥先導提供新途徑，為促進我省乃至我國醫(yī)藥事業(yè)的振興與開展做出奉獻，課題的實施既具有重要的學術(shù)實際價值又有寬廣的運用前景。3、本工程研討目的及與懇求者研討任務長期目的的關(guān)系；工程研討目的：本工程擬以浙江民間抗癌藥用植物體為研討對象，以v-Src蛋白作為靶分子，對天然來源抗腫瘤活性分子進展快速挑選，結(jié)合高分辨質(zhì)譜及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對這些分子進展分析確定，以建立微量天然來源抗腫瘤藥物先導的快速識別新途徑，并運用該途徑尋覓發(fā)現(xiàn)一系列具有運用前景的抗腫瘤藥物先導。與懇求者研討任務長期目的的關(guān)系：懇求者長期從事天然藥物化學研討，圍繞新的生物活性分子的尋覓與發(fā)現(xiàn)這一研討方向，進展了以下的研討任務：1

25、近幾年經(jīng)過10余種藥用植物的植化研討，分別得到80多種新化合物，其中10余種是具有運用前景的新的生物活性分子，在國際知名專業(yè)學術(shù)期刊、， (影響因子均大于2.0) 以及上發(fā)表了多篇論文；2在天然來源生物活性成分分別與分析研討中進展大量的積累：進展了新的逆流色譜技術(shù)研討與開發(fā)并運用于天然藥物有效成分的分別純化的研討中，其成果在 (影響因子：IF為3.35)發(fā)表了論文6篇；擔任承當了一項國家自然科學基金 “抗氧化植物多酚的逆流色譜分別方法研討2005-2007工程；運用質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)開展了生物活性分子挑選與分析研討等一系列探求任務，分別在, 等雜志上發(fā)表論文多篇；3開展與建立了生物活性分子在線分

26、別分析的新途徑，進展了抗癌藥物分子的靶向挑選與快速鑒定等研討探求，其研討成果已在, ，等雜志上發(fā)表，目前有一篇論文已遞交美國(影響因子：IF為5.45); 擔任承當了兩項國家自然科學基金 “質(zhì)譜在天然抗腫瘤活性成分快速挑選與分析中的運用1999-2001與“天然來源抗腫瘤活性成分靶向挑選與質(zhì)譜分析2004-2006工程。4課題組經(jīng)過綠色合成途徑開展了天然活性分子的合成與衍生以及目的生物活性分子的藥物合成等研討任務，迄今已在(影響因子：IF為4.19)發(fā)表論文3篇；在、(影響因子均大于2.0)等其他雜志上發(fā)表論文多篇。5基于靶向挑選必需擁有高效的新型蛋白靶標的原那么，近期與從事生命科學研討的相關(guān)

27、課題組開展了協(xié)作研討，并于2006年在國際著名雜志(影響因子：IF為6.35)發(fā)表論文一篇?？傊瑢ひ捙c發(fā)現(xiàn)新的藥物先導是我們研討的重要課題，為了順利實施該課題，開展與建立新的研討途徑與方法，歸納總結(jié)科學規(guī)律并促進學科開展，不斷是我們研討任務的長期目的。天然來源抗腫瘤化合物是我們在長期的天然藥物研討中極為關(guān)注的一類活性成分，這不僅是由于抗腫瘤活性成分在天然藥用植物中分布較廣泛，具有復雜的構(gòu)造多樣性，對其研討必將大大促進天然藥物化學有機構(gòu)造分析研討技術(shù)與方法的開展與更新，既可豐富天然有機藥物化學實際內(nèi)容，更重要的是對這類活性成分的深化研討可大大豐富抗癌藥物先導的源泉為藥物合成提供靶標從而為創(chuàng)制新

28、藥奠定良好根底，為我省、我國的醫(yī)藥事業(yè)做出奉獻。在我們近期的相關(guān)研討中，我們從一些藥用植物中得到的一系列具有抗腫瘤活性化合物，并申報了專利，這些化合物擁有多類構(gòu)造骨架如萜類、糖苷以及黃酮等，多數(shù)新構(gòu)造含量甚微，其分別分析頗為困難，常規(guī)的正反相層析與高效液相制備要么效果不佳要么代價太大，因此開展微量程度上新的抗腫瘤活性成分分析的新途徑具有極其重要的意義。鑒于此，本工程擬以v-Src 蛋白作為靶標分子，基于該靶分子與抗腫瘤活性分子的相互作用進展中草藥中抗腫瘤活性成分的靶向挑選，結(jié)合高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對上述挑選出的成分進展在線分別分析與鑒定，從而開展與建立關(guān)于天然來源抗腫瘤活性成分快速識別的

29、新途徑。本工程的實施是我們長期研討目的的最重要內(nèi)容之一。4、工程研討內(nèi)容，研討方案和進度安排研討內(nèi)容：浙江省原生的蘭科植物石豆蘭屬和石斛屬植物廣東石豆蘭Bulbophyllum kwangtungense Schlecht與細莖石斛Dendrobium.moniliforme等幾種植物根莖的乙醇提取物在體外抗腫瘤實驗中，對人卵巢癌HO-8910細胞，人宮頸癌細胞和人早幼粒白血病HL60等細胞株呈現(xiàn)出明顯的抑制造用，在已展開的植物化學研討中，我們從幾種植物的富含成分中分別得到一系列9,10-二氫二苯并b,f氧雜卓類化合物與單體毛蘭素(Erianin)、毛蘭菲(Confusarin)等，這些化合物

30、均顯示較強的體外抗腫瘤活性。 9,10-二氫二苯并b,f氧雜卓類 毛蘭素(Erianin) 毛蘭菲(Confusarin)本工程即以這幾種植物為研討對象，重點關(guān)注這些植物中含量低微，構(gòu)造新穎的有效成分的研討，擬以基因工程獲得的具有激酶活性的病毒癌基因表達蛋白v-Src作為蛋白質(zhì)靶標分子, 在分子程度上對上述一系列新的微量抗腫瘤活性分子進展靶向挑選, 經(jīng)過高分辨質(zhì)譜分析及其聯(lián)用手段進展分析確定，開展并建立微量程度上的天然來源新型抗腫瘤藥物先導的快速識別新途徑，并在此根底上發(fā)現(xiàn)假設干具有運用前景的新型藥物先導，詳細研討內(nèi)容如下：一： 植物中的富含有效成份的分別分析常規(guī)研討途徑1運用傳統(tǒng)色譜方法得到

31、富含成分有效部位分別提取，所獲得化合物多為知構(gòu)造的化合物；對新構(gòu)造化合物，經(jīng)過現(xiàn)代波譜技術(shù)1D,2D-NMR等確定構(gòu)造，并進展抗腫瘤活性驗證。該過程可去除有效部位的富含成分，富集有效部位的微量成分。二：植物中的微量有效成份的分別分析開展新的研討途徑選擇病毒癌基因表達蛋白v-Src作為靶標分子，自行組裝生物活性快速挑選安裝，見以下圖所示：靶標分子溶液與天然混合物溶液分 別置于由關(guān)鍵膜隔離的上下兩個挑選池中，由于靶標具有親水膠體的性質(zhì)一直被截留在一個挑選池中，隔離膜對天然化合物小分子堅持良好的通透性。當液相多組分天然藥物化學成分經(jīng)過膜在兩個挑選池運動時，基于生物親協(xié)作用，具有抗腫瘤活性的藥物分子v

32、-Src的抑制劑與靶標分子結(jié)合構(gòu)成 圖一: 靶向挑選池復合物而被截留在裝有靶標分子的挑選池中，其他未發(fā)生親協(xié)作用的化合物分子那么呈游離形狀平衡分布在兩個挑選池中，隨后運用HPLC-HRMS對要研討的化合物組分在實施挑選前后分別進展分析，獲取化學成份指紋圖譜，經(jīng)過比較這兩類指紋圖譜差別后，發(fā)現(xiàn)新的活性成份。由于該研討中所運用的高分辨質(zhì)譜可給出有機分子的元素組成分子式，而多極質(zhì)譜分析能給出豐富的構(gòu)造信息，因此我們可結(jié)合在線的SCI-finder直接獲得所挑選出的有效成分能否擁有新構(gòu)造，本工程重點關(guān)注新型活性成分研討。對于上述途徑得到的一些構(gòu)造復雜的新成份，也可經(jīng)過半微量制備型HPLC制備，經(jīng)多維高

33、分辨NMR技術(shù)微量探頭進展構(gòu)造確定。研討方案1. 靶蛋白v-Src 蛋白的制備克隆v-src全基因，在pGEX-KT高效表達質(zhì)粒中誘導表達，得到GST-Src交融蛋白，用Glutaione Sepharose 4B親和層析柱進展純化，并采用Western blot和以polyGlu:Try (4:1)為底物的ELISA法鑒定其免疫原性和酪氨酸激酶活性。該實驗程序曾經(jīng)非常成熟，10天就可得到足量的GST-Src交融蛋白，且該交融蛋白具有較高的靶標蛋白v-Src的免疫原性和酪氨酸激酶活性，可以直接作為靶標蛋白。2藥用植物化學研討。一：關(guān)于植物中富含活性成份的研討與微量成分的富集。 1對廣東石豆蘭與

34、細莖石斛等幾種植物根莖部分粉碎，用70% 酒精浸泡提取，經(jīng)過不同極性化學溶劑進展化學部位分段，體外抗腫瘤藥理實驗獲得假設干有效部位。2運用逆流色譜技術(shù)，大孔吸附樹脂及正反相柱層析對有效部位進展分段分別，得到一系列主要成分，運用現(xiàn)代波譜技術(shù)進展構(gòu)造確定，普通為知化合物。3對上述分別得到的未知構(gòu)造的單體成分進展構(gòu)造確定并進展藥理驗證。4經(jīng)過LH20凝膠柱層析對上述曾經(jīng)分出主要成分的有效部位進展微量成分的富集與分段，得到假設干含有多組分微量成分部位，體外藥理跟蹤得到系列有效部位。二：關(guān)于植物中含量低微的活性成份的快速識別研討1制備并組裝含靶標分子的挑選池，討論快速挑選的最正確條件。 2以抗腫瘤作用確

35、定的天然化合物如紫杉醇、長春新堿等假設干知抗癌成分為對照，經(jīng)過實驗調(diào)查溫度、PH值、有機溶劑、化學計量比以及相互作用時間對靶向挑選的影響, 結(jié)合HPLC色譜定量分析，確定挑選的最正確實驗條件。 3在上述實驗的根底上，對假設干含多種微量成分的有效部位進展快速識別研討，在靶向挑選平衡后，活性成分與靶標結(jié)合構(gòu)成復合物而被截留，未被挑選化合物分子游離分布在兩個挑選池中，運用HRMS或HPLC/MS對挑選前后的天然混合物溶液制備指紋圖譜，從指紋圖譜中發(fā)現(xiàn)差別，可獲得生物活性成分的信息。 4鎖定挑選出的活性成分，經(jīng)過高分辨質(zhì)譜可提供元素組成分子式的功能，結(jié)合聯(lián)機數(shù)據(jù)庫檢索，確定新成分；運用多級質(zhì)譜技術(shù)，進

36、展新化合物的構(gòu)造信息提取，初步鑒定其構(gòu)造。 5對在線分析并結(jié)合檢索確定構(gòu)造的復雜新構(gòu)呵斥分，經(jīng)過多次富集并結(jié)合半微量制備，運用微量探頭多維NMR測定其構(gòu)造。 6運用體外腫瘤細胞株培育等常規(guī)藥理方法對一些具有新穎構(gòu)造的成分進展藥理驗證。 圖二：快速挑選流程見以下圖：圖三. 抗腫瘤活性成分靶向快速識別技術(shù)道路如下：靶向挑選前多組分MS或HPLC/MS指紋圖譜-I天然來源多組分混合庫物 HPLC/MS 或MS分析 蛋白 確定抗腫瘤活性成分 靶向 對 發(fā) 挑選 照 現(xiàn) 比 差挑選后多組分化合物庫靶向挑選后多組分MS或HPLC/MS指紋圖譜-II HPLC/MS 較 異 或MS分析 進度安排本工程擬用三

37、年時間完成各項研討義務，預期進展情況如下：1 2007.12007.12 完成詳細實驗方案設計，藥用植物的采集，有效部位的提取分段，微量有效成分部位的制備。2 2021.12021.6 完成各種藥用植物中富含化學成份的分別提取與構(gòu)造確定，同時建立微量或超微量抗腫瘤有效成份的快速識別的實驗方法；完成多種的微量抗腫瘤活性成份的快速實驗。3 2021.62021.12 歸納，整理，分析總結(jié)并提交研討論文與總結(jié)報告。5、工程創(chuàng)新之處 關(guān)于天然來源的有效成分的研討, 國內(nèi)外研討人員通常還是采用常規(guī)的植物化學研討途徑結(jié)合離線的活性實驗；今年來在分別資料、高靈敏度色譜制備手段上進展大量的探求，對于一些微量成

38、分的研討，目前尚無通用的方法，只需采用較為經(jīng)典的多次制備的途徑, 與活性銜接也是較難的, 因此本工程擬以v-Src 蛋白作為靶蛋白，基于該靶標與抗腫瘤活性分子的相互作用進展中草藥中抗腫瘤活性成分的靶向挑選，結(jié)合高分辨質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)對上述挑選出的成分進展在線分別分析與鑒定，其創(chuàng)新之處在于：(1) 靶蛋白對藥物分子的靶向挑選以及高分辨質(zhì)譜分析均是極其靈敏的途徑，該方法適用于微量或超微量生物活性成分的分析研討，為從天然來源藥用植物中發(fā)現(xiàn)一些含量低微的抗腫瘤活性成分提供新手段，該研討未見文獻報道，豐富了有機與生物分析的實際內(nèi)容。2本工程關(guān)于生物活性成分的靶向挑選與分析鑒定可在線一體化實施，豐富了天然

39、有機藥物化學研討方法，可大大提高了天然有機化學及藥物化學研討任務的效率。3靶標與抗腫瘤活性分子的相互作用用于中草藥藥用植物中微量的抗腫瘤活性物質(zhì)的靶向挑選，可開展成為一種分子程度上的微量或超微量分別途徑，該研討無疑為分別科學增添了新的內(nèi)容。4本工程重點進展多種藥用植物中微量成分的研討，以發(fā)現(xiàn)大量的擁有新構(gòu)造的生物活性成分，該研討可大大豐富抗癌藥物先導的源泉為藥物合成提供靶標從而為創(chuàng)制新藥奠定良好根底。5上述途徑也可適用于其他天然來源生物活性微量成分的快速識別.6、任務根底與任務條件1本工程懇求人自1988年以來不斷從事具有生物活性天然有機化合物的分別提取、構(gòu)造鑒定研討，迄今已分別出80多個新化

40、合物，在國際知名專業(yè)學術(shù)期刊等上發(fā)表了多篇論文，在探求與開展天然藥物有效成份分別新技術(shù)，進展一系列研討任務，開展了新的逆流色譜儀技術(shù)的開發(fā)與運用任務，申報專利兩項，在發(fā)表論文多篇，在開展生物活性分子質(zhì)譜分析研討領(lǐng)域，進展了一系列的探求任務，分別在等雜志上發(fā)表論文多篇；在開展與建立生物活性分子在線分別分析新途徑方面，在等雜志上發(fā)表論文多篇；同時課題組也開展藥物合成的一些研討任務，迄今已在發(fā)表論文3篇；在新的蛋白靶標，與從事生命科學研討的相關(guān)課題組開展了協(xié)作研討，并于2006年在國際著名雜志發(fā)表論文一篇?？傊?，圍繞藥物化學研討，本課題組已發(fā)表學術(shù)論文120余篇，其中SCI收錄100余篇，申報專利6

41、項，獲批2項，其研討成果共獲省部級及其他部門科技獎三項。2課題懇求者近幾年來擔任承當了的三項國家自然科學基金工程，其中兩項課題“親合超濾-質(zhì)譜分析在天然來源抗腫瘤活性成分快速挑選中的運用與“質(zhì)譜在天然來源抗腫瘤活性成分靶向挑選中運用分別以拓撲異構(gòu)酶以及微管蛋白等作為靶標分子，對一些抗腫瘤活性的物質(zhì)進展了挑選分析研討，獲得的結(jié)果可為本課題的實施提供有益的閱歷，部分方法也可借用。由于酶與微管蛋白制備相對困難，活性堅持也有一定的限制，本工程基因工程獲得的v-Src 蛋白作為靶分子, 對中草藥中的潛在的抗腫瘤活性分子進展靶向挑選。該任務是本課題組前期任務延伸，已有較為扎實的根底。3我們在近期的相關(guān)研討中，從一些藥用植物中分別得到的一系列具有抗腫瘤活性化合物，這些化合物擁有多類構(gòu)造骨架如萜類、糖苷以及黃酮等，多數(shù)新構(gòu)造含量甚微，其分別分析頗為困難，常規(guī)的正反相層析與高效液相制備要么效果不佳要么代價太大，因此要獲得構(gòu)造骨架新穎的活性成分，開展微量程度上快速識別的新途徑非常必要。任務條件懇求人所在研討所擁有Bruker 電噴霧Espuire3000 plus-HPLC/MS聯(lián)用儀一臺，500M