1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)專心-專注-專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)一.安裝、啟用和維護(hù)中重點(diǎn)注意事項(xiàng) 色譜柱既是液相色譜儀的最核心部件，價(jià)格相對(duì)昂貴，請(qǐng)牢記它是高檔儀器中的高檔部件，給它以足夠的尊重和關(guān)懷。如避免強(qiáng)烈的碰撞和震動(dòng)，盡管色譜柱從1米高的實(shí)驗(yàn)臺(tái)掉落到水泥地上不至于100%會(huì)損壞，但50%的可能損壞你也承受不起。另外不要讓柱床變干，避免在嚴(yán)寒環(huán)境受凍等。 1.柱頭類型和不銹鋼毛細(xì)管接頭的匹配 色譜柱是消耗品，不是儀器原配的情況很多。上圖表明柱連接的6種不同方式（數(shù)字單位是英寸），如果兩者類型不匹配將會(huì)產(chǎn)生漏液或者死體積過(guò)大的

2、現(xiàn)象。接頭比柱頭深度長(zhǎng)，不易擰緊而漏液；接頭比柱頭深度短，柱頭內(nèi)留有空隙而產(chǎn)生死體積，使譜帶展寬和峰拖尾。2.溶劑的匹配轉(zhuǎn)換 色譜柱內(nèi)保存溶劑和儀器系統(tǒng)內(nèi)存留溶劑，如果和流動(dòng)相不匹配，使用前需進(jìn)行轉(zhuǎn)換。特別是流動(dòng)相含緩沖鹽時(shí)，如保存溶劑是純有機(jī)相或有機(jī)相比例高，直接將新柱接入使用，會(huì)導(dǎo)致緩沖鹽在柱內(nèi)結(jié)晶析出，最嚴(yán)重會(huì)將新柱永久不可逆地?fù)p壞。正相柱保存溶劑一般為正己烷，如果要轉(zhuǎn)換成HILIC柱模式使用，由于正己烷和甲醇乙腈的互溶性不好，轉(zhuǎn)換中間需用二氯甲烷或乙酸乙酯過(guò)渡。3.新柱使用前的平衡和老化 廠家出廠檢驗(yàn)時(shí)一般都已進(jìn)行過(guò)平衡，但色譜柱到最終用戶時(shí)間不一，用戶正式測(cè)定前最好對(duì)色譜柱再次平衡。

3、最好的平衡兼老化一起進(jìn)行的方法是運(yùn)行幾次完整的分析程序（包括進(jìn)樣），直到觀察到峰形、保留時(shí)間和峰面積穩(wěn)定為止。所謂“老化”是借用了氣相的術(shù)語(yǔ)，目的是達(dá)到分析物在色譜柱以及整個(gè)液相系統(tǒng)流路中的吸附飽和。對(duì)某些特定的待測(cè)物，如分子量大于1000的，因擴(kuò)散速度慢，老化時(shí)間相應(yīng)要長(zhǎng)，可采取大濃度進(jìn)樣或在同一個(gè)洗脫周期內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣多針的方式加快老化。4.pH使用范圍 一般認(rèn)為硅膠基質(zhì)柱子的pH使用范圍是2-8，這是很粗略的。硅膠類型、使用溫度、硅膠表面所鍵合的固定相類型以及緩沖鹽的不同，對(duì)此均有影響。硅膠比孔容小、鍵合密度大的填料pH耐受范圍要大一些，如月旭公司的Ultimate XB-C18色譜柱，選用

4、的是高品質(zhì)硅膠，加上高密度鍵合和雙封尾，使pH耐受范圍最大提高到10。磷酸鹽緩沖鹽滲透力強(qiáng)，有加快硅膠溶解的副作用，它的存在會(huì)降低pH使用范圍。有機(jī)雜化硅膠以及硅膠表面涂覆雜化層的硅膠填料，有機(jī)質(zhì)的存在使pH使用范圍能到12以上，月旭公司的Xtimate系列產(chǎn)品即屬此類。5. 色譜柱保存 短期保存(隔夜或隔周末)用所用的流動(dòng)相（不含緩沖鹽）保存為佳，以盡量減少下次使用的平衡時(shí)間。一般只建議在長(zhǎng)期保存反相柱的時(shí)候用純甲醇或乙腈，一方面純有機(jī)相保存有最大限度減少鍵合相水解的作用，但純甲醇（乙腈）又會(huì)將已水解而暫時(shí)吸附在柱內(nèi)的鍵合相洗脫出去，使固定相流失進(jìn)程加快，壽命縮短。純有機(jī)相保存還有易揮發(fā)使柱

5、床變干的缺點(diǎn)，使用80%左右有機(jī)相保存也屬好的選擇，且足以避免長(zhǎng)菌。強(qiáng)烈建議在柱身上貼標(biāo)簽標(biāo)明保存溶劑。 CN基柱在有機(jī)極性溶劑中柱床不穩(wěn)定（會(huì)導(dǎo)致柱床結(jié)構(gòu)坍塌），適合在水相中低溫保存。低溫保存要確保不發(fā)生固定相凍結(jié)而損壞柱床。離子交換柱和水性SEC柱等適合保存在水溶液中的色譜柱，可加0.05%疊氮化鈉溶液防止長(zhǎng)菌。 正相柱，無(wú)論是短期還是長(zhǎng)期，都推薦保存在所用流動(dòng)相中二、柱壓?jiǎn)栴} ）以及容量因子k相關(guān)，和柱壓無(wú)關(guān)。 但柱壓（P）仍不失為 上面是基本色譜分離方程式，分離度R和柱效（N）、選擇因子（ HPLC方法中的最重要參數(shù)之一，因?yàn)橹鶋悍从沉松V柱的內(nèi)部狀況。 現(xiàn)今能承受400 bar壓力的

6、HPLC泵很常見(jiàn)，色譜柱如在遠(yuǎn)低于上限的壓力下正常運(yùn)行，不需要我們重點(diǎn)關(guān)注；當(dāng)柱壓升高接近上限或者柱壓有異常升高，往往意味著色譜柱出狀況了，需及時(shí)進(jìn)行維護(hù)和補(bǔ)救，嚴(yán)重時(shí)色譜柱就已報(bào)廢了。本節(jié)將詳細(xì)考察柱壓?jiǎn)栴}并提出可行的解決方案。柱壓方程 對(duì)填充色譜柱，柱壓與黏度 ()、柱長(zhǎng) (L)和流速 (F)成正比，與填料粒徑（d p）以及柱管半徑（r）的平方成反比。K0是比滲透性系數(shù)，對(duì)填充床，其值約為0.001。通過(guò)此公式可近似計(jì)算出給定色譜條件下的理論柱壓。只有當(dāng)新柱實(shí)際測(cè)得的柱壓和理論柱壓相差很大，才能說(shuō)柱壓存在問(wèn)題。 黏度 ()取決于流動(dòng)相溶劑的選擇，為降低柱壓，反相色譜中傾向于選擇低黏度的乙腈

7、，而不是高黏度的異丙醇。當(dāng)然選擇時(shí)還需考慮溶劑強(qiáng)度、極性、分析物的溶解度以及和分析物兼容性等。 柱長(zhǎng)（L）增加可以提高分離度（R），流速（F）提高能加快分離，但都會(huì)導(dǎo)致柱壓上升，選擇確定這些運(yùn)行參數(shù)時(shí)，需綜合平衡和折中。 填料粒徑對(duì)柱壓影響極大，d p降低一倍，柱壓將增加4倍。UHPLC中采用的sub-2 m填料，柱壓超過(guò)普通HPLC泵的400Bar上限很多。提高柱溫因可降低黏度，相應(yīng)降低柱壓。在梯度洗脫時(shí)，黏度隨流動(dòng)相組成的變化而改變，柱壓也會(huì)處在不斷變化中。對(duì)水/甲醇流動(dòng)相體系，在55：45時(shí)，黏度和柱壓有個(gè)極大值。 內(nèi)徑的影響同樣很大，根據(jù)線流速相同柱壓相同的原則，4.6mm內(nèi)徑的色譜柱

8、流速為1ml/min，約相當(dāng)于在2.1mm內(nèi)徑色譜柱上的0.2ml/min流速，在10mm半制備色譜柱上的5ml/min，計(jì)算公式為v1.0ml/min x（內(nèi)徑r/4.6）2。所以在換不同內(nèi)徑色譜柱時(shí)，請(qǐng)及時(shí)調(diào)整流速，以免因高柱壓損傷色譜系統(tǒng)。柱壓下降是儀器系統(tǒng)的連接有泄漏，柱壓不穩(wěn)定一般認(rèn)為是流路中有氣泡或空穴，和色譜柱相關(guān)的柱壓?jiǎn)栴}是柱壓上升。色譜柱結(jié)構(gòu): 和柱壓相關(guān)最大的是進(jìn)口端篩板（inlet frit）以及其后面1-2cm長(zhǎng)度的柱頭填料。篩板上有比填料粒徑小的小孔，篩板上的小孔或柱頭填料的間隙被部分堵塞，是柱壓上升的主要原因。有以下幾類情況：1.填料破碎和使用后有填料粉末生成填料破

9、碎一般在裝柱過(guò)程中發(fā)生，裝柱壓力過(guò)大或所選硅膠機(jī)械強(qiáng)度過(guò)低所至，設(shè)定柱壓出廠標(biāo)準(zhǔn)可解決；流動(dòng)相中高pH值緩沖鹽使硅膠溶解并重新形成填料粉末，堵塞出口端篩板，這種情況下反沖不起作用，只有更換后篩板，不過(guò)打開(kāi)承壓的后篩板，對(duì)柱床會(huì)有不好影響。2. 顆粒物堵塞引起柱壓上升和對(duì)策 可能堵塞進(jìn)口端篩板（前篩板）和柱頭填料間隙的顆粒物來(lái)源有：樣品（制樣時(shí)灰塵和濾紙等帶入）、進(jìn)樣閥密封圈磨損、流動(dòng)相（溶劑本身含有和配制過(guò)程進(jìn)入）、液相儀器中泵閥密封圈的磨損、緩沖鹽析出（一般在梯度運(yùn)行和進(jìn)樣時(shí)鹽的溶劑環(huán)境改變導(dǎo)致）。 水和緩沖鹽流動(dòng)相內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)菌，也是顆粒物來(lái)源的一種，可堵塞篩板和填料間隙。應(yīng)避免將這類流動(dòng)相

10、在室溫下久放，可放入冰箱存放。1) 預(yù)防措施 樣品（甚至標(biāo)準(zhǔn)品）和流動(dòng)相過(guò)濾，既預(yù)防了篩板、柱頭和毛細(xì)管堵塞，又能減少進(jìn)樣閥、活塞桿和截止閥等儀器關(guān)鍵部件的磨損。普通用0.45um孔徑濾膜過(guò)濾樣品和流動(dòng)相，對(duì)使用2um以下填料的超高壓柱的，可用0.20um濾膜。濾膜材質(zhì)有再生纖維素、聚四氟乙烯、尼龍、硝酸纖維和醋酸纖維等，須根據(jù)和樣品溶劑及分析物的適應(yīng)性慎重選擇。 使用保護(hù)柱或在線過(guò)濾器，具體安裝位置見(jiàn)下圖：在線過(guò)濾器內(nèi)裝有可更換的濾片，濾片孔徑一般有2um和0.5um兩種。安裝位置有兩個(gè)可選擇，在進(jìn)樣器和色譜柱之間時(shí)，對(duì)樣品和流動(dòng)相中的顆粒物都有效；在泵和進(jìn)樣器之間，則只對(duì)流動(dòng)相有過(guò)濾作用。

11、保護(hù)柱是縮小版的色譜柱，內(nèi)含帶填料的可更換的柱芯，安裝在進(jìn)樣閥和色譜柱之間，用于防止色譜柱的化學(xué)污染為主，也有過(guò)濾顆粒物的作用。2)故障排除 反沖色譜柱：不連接檢測(cè)器，直接將堵在前篩板上的顆粒物沖出排到廢液瓶中。開(kāi)始時(shí)反沖壓力可低于正常使用壓力，待顆粒物有沖出后，逐步提高沖洗壓力。有時(shí)顆粒物已非常牢固嵌入到篩板內(nèi)部，反沖不一定湊效，早反沖、勤反沖相對(duì)效果更好。有的廠商為避免堵塞，使用了較大孔徑（2-5um）的前篩板，這種情況反沖會(huì)將填料沖出。換篩板：一般不建議這樣做，因?yàn)閾Q篩板會(huì)帶走粘在篩板上的部分填料，使柱床的均一性受影響，導(dǎo)致柱效下降。不過(guò)如果反沖不能解決問(wèn)題，也只能不得已而為之，要不然就

12、要把色譜柱報(bào)廢了。 如果系統(tǒng)中不接色譜柱，柱壓仍然高，說(shuō)明泵出口到色譜柱之間的其它部位，包括進(jìn)樣器、在線過(guò)濾器和保護(hù)柱等有堵塞，可逐一排查。為了減少死體積，毛細(xì)管都做得盡可能的細(xì)，也可能被堵。3. 化學(xué)污染物引起柱壓上升和對(duì)策 來(lái)源同樣是樣品、流動(dòng)相和系統(tǒng)，不過(guò)來(lái)源于樣品的污染最普遍，特別是對(duì)復(fù)雜基體樣品未經(jīng)前處理或前處理不夠的時(shí)候?；瘜W(xué)污染物主要有：分子量很大的化合物、鹽類、脂質(zhì)、蠟類、油脂、腐殖酸、蛋白質(zhì)等其它生物來(lái)源的物質(zhì)。 像鹽類這樣的保留能力極小的污染物會(huì)在死體積處很快從柱中洗脫出去，檢測(cè)器一般對(duì)此類物質(zhì)響應(yīng)不大，有時(shí)表現(xiàn)為干擾峰、基線波動(dòng)、斑點(diǎn)甚至負(fù)峰。 保留能力中等的污染物，會(huì)被

13、慢慢洗出色譜柱，表現(xiàn)為寬峰、基線饅頭形波動(dòng)和基線緩慢漂移。 對(duì)強(qiáng)保留的污染物，一般流動(dòng)相強(qiáng)度不足以將其從柱中洗出，會(huì)逐步在柱頭累積。有時(shí)，累積在柱頭的污染物可作為新固定相對(duì)分析物起作用，引起保留時(shí)間改變、峰拖尾和峰分叉等。污染物在柱頭累積到一定程度，如果不采取措施，會(huì)堵塞填料間隙，引起柱壓上升。最好的辦法是選用合適的溶劑沖洗溶解這些物質(zhì)，同時(shí)又不對(duì)填料本身有損害。如聚合物柱中累積的蛋白類污染物可用pH13-14的強(qiáng)堿溶液洗掉，但這種方法不適合硅膠基質(zhì)色譜柱。1）預(yù)防措施：a制樣時(shí)采用SPE固相萃取等方法，預(yù)先將色譜柱殺手類的污染物質(zhì)清除掉；b連接保護(hù)柱。保護(hù)柱是分析柱的延伸，在填料類型和粒徑上

14、應(yīng)于分析柱一致，才能最大限度起保護(hù)作用，又不影響色譜性能。一個(gè)設(shè)計(jì)和裝填良好的保護(hù)柱，還可增加分析柱的分離效率。如果因某種原因需在保護(hù)柱中用不同的填料，也應(yīng)選擇比其所保護(hù)的分析柱保留能力弱的固定相，這時(shí)的保護(hù)柱完全用于截住強(qiáng)保留物質(zhì)，類似于SPE小柱的功效。當(dāng)保護(hù)柱柱芯保護(hù)功能用盡時(shí)，也不能說(shuō)不可再清洗后復(fù)用，但價(jià)格低不值得去花這個(gè)時(shí)間。c經(jīng)常對(duì)分析柱進(jìn)行沖洗維護(hù)：2)故障排除： 已經(jīng)累積很多污染物，用甲醇或乙腈簡(jiǎn)單沖洗不奏效，推薦使用下面方法清洗反相柱100甲醇-100乙晴-75乙晴/25異丙醇-100異丙醇-100二氯甲烷-100正己烷 用每種溶劑沖洗至少10個(gè)柱體積，對(duì)于250mm4.6

15、mm的分析柱，合適的沖洗流速是12ml/min。最后用10柱體積的異丙醇過(guò)渡，然后回到原來(lái)的流動(dòng)相體系。 對(duì)受蛋白類污染的硅膠基質(zhì)反相柱，純有機(jī)溶劑如乙腈或甲醇不能溶解多肽和蛋白質(zhì)。由有機(jī)溶劑、緩沖液和酸,有時(shí)還加上離子對(duì)試劑等組成的配方清洗效果極佳，譬如用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸/丙醇溶液對(duì)柱子重復(fù)進(jìn)行梯度洗來(lái)再生；Bhadwaj和Day試驗(yàn)了在250mm46mm的柱子中注入100L的三氟乙醇，再生效果良好。 清洗硅膠、CN和Diol等正相柱建議方法：先用20柱體積50：50正己烷/氯仿沖洗，然后用甲醇、二氯甲烷或者100%醋酸乙酯沖洗。對(duì)油脂類物質(zhì)，可用異丙醇清洗。三、峰形問(wèn)題 峰形對(duì)稱性

16、的優(yōu)劣對(duì)峰面積和分離度有很大的影響，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。引起峰形異常的因素很多，柱外死體積引起峰形異常有個(gè)特點(diǎn)：對(duì)先出的峰影響大，對(duì)后出峰影響??；柱頭塌陷、柱頭和篩板污染會(huì)引起所有的峰形都異常，而硅醇基次級(jí)保留只引起部分峰拖尾。相塌陷除了引起保留下降外，也會(huì)造成峰拖尾。色譜實(shí)踐中，大部分的峰形問(wèn)題都不是色譜柱的問(wèn)題，儀器參數(shù)設(shè)定、色譜條件和方法正確與否對(duì)峰形有很大影響。1.峰后拖常見(jiàn)的3種拖尾情況：次級(jí)保留引起峰拖尾的機(jī)理解析：反相色譜中，通常非極性和弱極性的化合物能獲得良好的峰形，而帶有COOH、NH2、NHR、NR2等極性基團(tuán)的化合物則比較容易產(chǎn)生拖尾，原因是硅膠表面殘留硅羥基對(duì)極性

17、和堿性樣品分子產(chǎn)生次級(jí)保留效應(yīng)。 反相填料表面有殘余的硅羥基，具有一定的酸性，其pKa約為4.54.7。根據(jù)電離規(guī)律，流動(dòng)相的pHpKa2即pH6.7時(shí)，99以上的硅羥基應(yīng)該是呈離子狀態(tài)的，即SiO ，而pKapH2即pH2.5時(shí)，酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離，99以上的硅羥基應(yīng)該是呈分子狀態(tài)的，即SiOH，但其極性仍然存在，即SiOH。SiOH和SiO對(duì)于極性化合物之間的作用力則是一種極性的靜電作用力，這種作用力比范德華力要強(qiáng)得多。同時(shí)，因?yàn)楣枘z表面鍵合了C18長(zhǎng)鏈，由于空間位阻作用，樣品分子中能接觸到殘余硅羥基的機(jī)會(huì)不多，只有少部分的分子才能與殘余硅羥基產(chǎn)生強(qiáng)的靜電作用而被推遲洗脫出來(lái)，產(chǎn)生

18、后拖。拖尾嚴(yán)重的程度與樣品分子極性大小和殘余硅羥基的多少有著直接的關(guān)系。 上圖是填料表面的示意圖，完全硅羥化的硅膠表面硅羥基濃度為8mol/m2，由于空間位阻的作用，通常與C18硅烷基發(fā)生反應(yīng)的僅達(dá)23.5mol/m2，需要再用小分子的硅烷跟硅羥基反應(yīng)，如圖中的三甲基氯硅烷，使硅羥基中的氫變成了三甲基硅烷的一個(gè)惰性基團(tuán)。三甲基硅烷還是比氫原子大得多，還是不能將所有的殘余硅羥基的活性封閉掉。 相同的樣品在不同品牌的柱子上產(chǎn)生拖尾的嚴(yán)重性不同，從填料合成的角度而言就是鍵合密度是否高、封尾是否徹底，高密鍵合和徹底的封尾能顯著減少這種機(jī)會(huì)，獲得良好的峰形。Welch公司Ulimate品牌的XBC18、

19、AQC18和Xtimate C18采取的就是高密鍵合和徹底的雙峰尾工藝。解決方案：1）先檢查樣品是否過(guò)載，由于樣品過(guò)載引起的峰形后拖不能通過(guò)改變色譜條件消除。如果發(fā)現(xiàn)過(guò)載，需降低進(jìn)樣量（包括進(jìn)樣體積或濃度），進(jìn)樣量越小，峰形越好，例子如頭孢尼西鈉的測(cè)定：2）調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH將流動(dòng)相的pH調(diào)至比弱酸pKa小2以上，比弱堿pKa大2以上，可有效抑制易離子化待測(cè)物的電離，從而取得良好峰形。例子如二甲基苯氧乙酸的測(cè)定： 堿性化合物中，甲胺的pKa為10.64，那么在pH 8.64的時(shí)候它是完全呈離子態(tài)的， 那么pH在2.58.64時(shí)，特別是pH6.78.64時(shí)，此時(shí)甲胺和硅羥基均以離子狀態(tài)NH3和SiO

20、形式存在的，它們之間相互吸引的靜電作用導(dǎo)致后拖，這就是為什么很多堿性化合物在pH 7.0的條件下容易產(chǎn)生拖尾的原因。而很多色譜柱生產(chǎn)商也因此以阿米替林（含N(CH3)2，堿性比NH2強(qiáng)）在pH 7.0的條件下來(lái)評(píng)價(jià)和比較不同色譜柱之間的優(yōu)劣，該條件下的阿米替林的峰形越好說(shuō)明封尾越好。而在pH12.64，大于pKa2以上時(shí)，甲胺完全以分子狀態(tài)形式存在，不會(huì)引起拖尾。3）增加緩沖鹽或增大緩沖鹽的濃度： 流動(dòng)相中加入緩沖鹽，增強(qiáng)了流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，在NH3等極性基團(tuán)和硅羥基SiO之間存在著許多離子的干擾，減少了樣品分子與硅羥基之間相互接觸的機(jī)會(huì)，有助于削弱極性基團(tuán)與硅羥基之間的相互作用，改善峰形。這

21、種適合于堿性較弱（如氨基的N原子與強(qiáng)吸電子基相連），或堿性很強(qiáng)，但在剛性結(jié)構(gòu)中，比較難以接近被C18長(zhǎng)鏈和封尾試劑覆蓋的硅羥基，例子如高烏甲素的測(cè)定：4）加入三乙胺、四丁基硫酸氫銨或辛烷磺酸鈉等 拖尾的產(chǎn)生是因?yàn)镹H2、NHR、NR2與硅羥基發(fā)生靜電作用引起的，那么阻礙它們之間靜電作用的途徑，應(yīng)該有兩種，一種是占據(jù)硅羥基這個(gè)作用位點(diǎn)，另一種是占據(jù)NH2、NHR、NR2這個(gè)作用位點(diǎn)。 在流動(dòng)相中加入三乙胺，能顯著的改善峰形，消除拖尾，其作用是屏蔽硅羥基。三乙胺的pKa為11.09，在pH11.0929.09的條件下是以離子狀態(tài)NH(CH2CH3)3的形式存在的，因此pH在2.58.64 硅羥基呈

22、SiO離子態(tài)的情況下，NH(CH2CH3)3容易與SiO形成相對(duì)較強(qiáng)的靜電吸引力。 加入三乙胺改善峰形的時(shí)候，有兩點(diǎn)需要注意：1）三乙胺的堿性很強(qiáng)，加入三乙胺后流動(dòng)相的pH可能超出色譜柱的使用范圍，對(duì)色譜柱造成損傷。pH的改變也會(huì)導(dǎo)致出峰時(shí)間的顯著變化，可能引起的其它問(wèn)題，建議流動(dòng)相中加入三乙胺后回調(diào)至未加入前的pH值。通常即使pH回調(diào)過(guò)后，由于三乙胺成為了固定相的一部分，保留時(shí)間也有較大變化；2）三乙胺在210nm處有比較強(qiáng)的吸收，如果液相方法中檢測(cè)波長(zhǎng)在210nm以下測(cè)定時(shí)需要謹(jǐn)慎使用。 四烷基季銨鹽（如四丁基硫酸氫銨、四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨等）在水中電離后，也形成了類似NH(CH2

23、CH3)3的結(jié)構(gòu)N(CH2CH2CH2CH3)4 ，這種結(jié)構(gòu)也能有效的與SiO產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電作用，阻止氨基與硅羥基的接觸，改善峰形。而且它還有一個(gè)不同于三乙胺的顯著特點(diǎn)是，它在低波長(zhǎng)范圍的吸收比三乙胺弱。 流動(dòng)相中加入辛烷磺酸鈉等烷基磺酸鹽離子對(duì)試劑也能很好的改善峰形，其作用機(jī)理與三乙胺和四丁基硫酸氫銨頗為不同，是通過(guò)與樣品分子的作用來(lái)阻止樣品分子與硅羥基的作用來(lái)改善峰形。2峰前延峰前延發(fā)生的概率比較小，下面是三種前拖峰的表現(xiàn)形式： 造成前延峰的原因有多種，我們可依次逐一排查：1）樣品是否過(guò)載 降低進(jìn)樣濃度，看峰形是否有所改善。一般認(rèn)為峰高在100mAU左右比較合適，不至于因過(guò)載影響峰形。2)

24、 檢查是否是用流動(dòng)相溶解樣品 溶解樣品的溶劑（如純甲醇）洗脫能力比流動(dòng)相強(qiáng)會(huì)發(fā)生峰前延。具體機(jī)理是： 正常的峰形應(yīng)該是樣品在色譜柱上均勻的前移的情況下得到的，濃度分布在整個(gè)通過(guò)色譜柱柱床的過(guò)程中任何時(shí)候都呈正態(tài)分布。樣品溶液進(jìn)樣后到達(dá)色譜柱時(shí)間很短，應(yīng)還未被流動(dòng)相充分稀釋，洗脫能力更強(qiáng)的樣品溶劑的局部存在，將使部分樣品被洗脫的速度加快，導(dǎo)致峰前延。3）增加流動(dòng)相中緩沖鹽的濃度 增加緩沖鹽濃度可以增大流動(dòng)相中的離子強(qiáng)度，減少因靜電的作用（有可能存在于樣品分子之間、也有可能存在于樣品分子與填料表面之間）引起的前延。例如：注射用苦參堿的測(cè)定4）流動(dòng)相中加入適量的四氫呋喃 往流動(dòng)相中加入少量的四氫呋喃

25、有時(shí)可以改善峰形、增大分離度，很多色譜工作者都知道和使用，但其機(jī)理似乎少人提及。通常所加入的量在5以內(nèi)即可，需要的時(shí)候可以加入更大的量。例子如下：阿莫西林膠囊的測(cè)定色譜柱：Ultimate AQC18，5um，4.6250mm； 檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm； 溫度：室溫28度； 流速：1.0ml/min； 進(jìn)樣量：20ul；5）升高柱溫 升溫有助于增加流動(dòng)相傳質(zhì)速率，減少因靜電作用引起的前拖，但溫度不宜太高，溫度太高容易損傷色譜柱，特別是含有離子對(duì)試劑的時(shí)候，最好不要超過(guò)40度。3其它峰形問(wèn)題裂峰： 柱頭污染和柱頭塌陷都會(huì)造成裂峰，最常見(jiàn)的原因是篩板上顆粒物堵塞樣品進(jìn)入色譜柱不均一，只需反沖色譜柱將

26、顆粒物除掉就可解決。四、保留時(shí)間問(wèn)題 分保留時(shí)間重現(xiàn)性和保留時(shí)間單向漂移兩類。1.保留時(shí)間的重現(xiàn)性 在色譜分析中最重要的是分離選擇性，保留時(shí)間的重現(xiàn)性則是可簡(jiǎn)單通過(guò)用峰面積定量代替峰高定量來(lái)消除其對(duì)分析結(jié)果的影響。溫度、流動(dòng)相組成、pH、離子強(qiáng)度等的微小變化都會(huì)引起保留時(shí)間的改變。2.保留時(shí)間漂移 柱平衡不夠：10-20柱體積流動(dòng)相平衡是必須的。三乙胺等添加劑加入，平衡時(shí)間需加長(zhǎng)。 固定相流失： 1) 在酸性條件下鍵合相碳鏈水解斷裂流失； 2)堿性條件下硅膠基質(zhì)溶解導(dǎo)致在基質(zhì)上鍵合固定相流失； 3)p H2-8下，上述兩種因素導(dǎo)致的流失仍會(huì)緩慢發(fā)生。多位鍵合比單點(diǎn)鍵合好，長(zhǎng)鏈比短鏈鍵合牢固，用

27、于封尾的鍵合相易流失；C18鏈的穩(wěn)定性比CN基鏈大三個(gè)數(shù)量級(jí)，一個(gè)是3個(gè)月會(huì)有明顯流失，一個(gè)是1小時(shí)；用有機(jī)相洗柱子會(huì)加快流動(dòng)相的流失。 柱污染：污染物作為固定相的一部分起保留作用，隨著污染程度的逐步增加，保留時(shí)間發(fā)生趨向性的變化。 流動(dòng)相組成變化: 如甲醇等揮發(fā)引起保留時(shí)間逐步變大。 相塌陷：純水條件下，C18柱會(huì)發(fā)生固定相塌陷，引起保留時(shí)間逐步變小甚至失去保留能力。3.柱與柱之間的重現(xiàn)性 同一批填料生產(chǎn)出的不同柱子，裝柱密度或柱體積的不同引起保留時(shí)間不一致。同樣尺寸規(guī)格柱子，填料裝得越結(jié)實(shí)，柱體積越小，保留時(shí)間越快。正常情況只有百分之幾的差別。 平衡程度、老化程度、使用歷史及污染程度的不一

28、樣都會(huì)導(dǎo)致兩根同品牌同批次色譜柱之間的保留時(shí)間不一致。4.批與批之間的重現(xiàn)性 由于不同批次填料之間的差異性導(dǎo)致。主要是表面鍵合度（可用載碳量指標(biāo)）和羥基活性方面的差異。可調(diào)整方法提高方法的適應(yīng)性，或者讓廠商備存足夠的同批次的適應(yīng)方法的填料。 五、壽命問(wèn)題 色譜柱如果得到正確使用、維護(hù)和保養(yǎng)，壽命會(huì)很長(zhǎng)。在使用保護(hù)柱的情況下，有壽命超過(guò)1萬(wàn)針的實(shí)例。如果不用保護(hù)柱，即便得到很好保養(yǎng)維護(hù)，一般能用到2000針左右就不錯(cuò)了。不過(guò)保護(hù)柱頻繁換柱芯的成本也不低，而且使用裝填不好的保護(hù)柱還會(huì)影響分離質(zhì)量。 對(duì)硅膠基質(zhì)色譜柱，流動(dòng)相p H值和樣品清潔程度對(duì)壽命影響較大。個(gè)人認(rèn)為高柱溫對(duì)壽命有影響，但不大，即

29、使方法要求70攝氏的柱溫，也沒(méi)發(fā)現(xiàn)有顯著的壽命縮短。進(jìn)針前樣品處理得越干凈，色譜柱壽命當(dāng)然越長(zhǎng)。但樣品前處理也是需要花錢的，需要在前處理成本、色譜柱成本和數(shù)據(jù)質(zhì)量之間進(jìn)行權(quán)衡。 色譜柱是高檔儀器中的高檔部件，表面看，一支只有和筷子一樣大小的色譜柱，2000-5000元價(jià)格算比較昂貴了，但色譜柱的使用成本占整個(gè)分析成本的比例卻很低。 因?yàn)樯V柱是耗材中可重復(fù)試用次數(shù)算多的，按平均用2000次計(jì)算，單次使用成本僅有1-2元人民幣，與制樣和試劑成本相比，幾乎可忽略不計(jì)。制樣用的SPE萃取小柱，過(guò)濾樣品和流動(dòng)相的濾膜，一次性用完之后，我們眼都不眨就扔掉了。因此，盡管通過(guò)本文中提到的很多再生清洗方法能延

30、長(zhǎng)使用壽命，但還需要權(quán)衡是否值得花時(shí)間這樣做，一是清洗色譜柱用的試劑是需要成本的，二是再生修復(fù)的柱子畢竟不能完全恢復(fù)到新柱的性能，三是繼續(xù)使用性能已經(jīng)下降很多的色譜柱，萬(wàn)一造成分析項(xiàng)目失敗，得不償失。 建議每支色譜柱固定做一種分析方法。盡管一開(kāi)始需要備的色譜柱多一些，但從長(zhǎng)期來(lái)看，這樣做和用一根色譜柱來(lái)回切換用于不同的樣品分析相比，產(chǎn)生問(wèn)題會(huì)更少，色譜柱花費(fèi)的總體成本會(huì)更低。HPLC使用注意事項(xiàng) 1.流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使用前過(guò)濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45um或更細(xì)的膜 過(guò)濾)。2.流動(dòng)相過(guò)濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。 3.不能用純乙腈作為流動(dòng)相

31、，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液。 4.使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)沖 洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對(duì)于柱塞桿 外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上。 5.長(zhǎng)時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相(如甲醇等)，因?yàn)榧兯组L(zhǎng)霉。 6.每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗。 7.C18柱絕對(duì)不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。 8.堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱混合器中的管路過(guò)濾器單向閥檢查 并清洗。清洗方法；以異 丙醇作溶劑沖洗：放在異丙醇中間用超聲波清 洗；用10稀硝酸清洗。

32、9.氣泡會(huì)致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過(guò)程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。 10.如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí)，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相 的清洗。 11.要注意柱子的PH值范圍，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。 12.更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊靖洗，然后插入新的 流動(dòng)相中。更換無(wú)互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過(guò)渡一下。 高效常見(jiàn)故障的斷定及解決診狀 可能的原因 解 決 方 法(一)保留時(shí)間變化 1.柱溫變化 柱恒溫，必要時(shí)需配置恒溫箱 2.等度與梯度間未能充分平衡 至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱 3.緩沖液容量不夠 用25mmol/L的緩沖液 4.柱污染 每

33、天沖洗柱 5.柱內(nèi)條件變化 穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相 6.柱快達(dá)到壽命 采用保護(hù)柱 (二)保留時(shí)間縮短 1.流速增加 檢查泵,重新設(shè)定流速 2.樣品超載 降低樣品量 3.鍵合相流失 流動(dòng)相PH值保持在37.5檢查柱的方向 4.流動(dòng)相組成變化 防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀 5.溫度增加 柱恒溫 (三)保留時(shí)間延長(zhǎng) 1.流速下降 管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡 2.硅膠柱上活性點(diǎn)變化 用流動(dòng)相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化 3.鍵合相流失 同前(二)3 4.流動(dòng)相組成變化 同前(二)4 5.溫度降低 同前(二)5 (四) 出現(xiàn)肩峰或分* 1.樣品體積過(guò)大 用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的1

34、5% 2.樣品溶劑過(guò)強(qiáng) 采用較弱的樣品溶劑 3.柱塌陷或形成短路通道 更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件 4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效 更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過(guò)濾器,過(guò)濾樣品 5.進(jìn)樣器損壞 更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子 (五)鬼峰 1.進(jìn)樣閥殘余峰 每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗 2.樣品中未知物 處理樣品 3.柱未平衡 重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑 (尤其是離子對(duì)色譜) 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜) 每天新配,用抗氧化劑 5.水污染(反相) 通過(guò)變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級(jí)的水 (六) 基線噪聲 1.氣泡(尖銳峰) 流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓 2.污染(隨機(jī)噪聲) 清洗柱,凈化樣品,用HP

35、LC級(jí)試劑 3.檢測(cè)器燈連續(xù)噪聲 更換氘燈 4.電干擾(偶然噪聲) 采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來(lái)源(如等) 5.檢測(cè)器中有氣泡 流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓 (七)峰拖尾 1.柱超載 降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相 2.峰干擾 清潔樣品,調(diào)整流動(dòng)相 3.硅羥基作用 加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相PH值,鈍化樣品 4.同前(四)4 同前(四)4 5.同前(四)3 5.同前(四)3 6.死體積或柱外體積過(guò)大 連接點(diǎn)降至最低,對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整,盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管 7.柱效下降 用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱 (八)峰展寬 1.進(jìn)樣體積過(guò)大 同(四)1 2.在

36、進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展 進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散 3.數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢 設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn) 4.檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)過(guò)大 設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10% 5.流動(dòng)相粘度過(guò)高 增加柱溫,采用低粘度流動(dòng)相 6.檢測(cè)池體積過(guò)大 用小體積池,卸下熱交換器 7.保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 等度洗脫時(shí)增加溶劑含量也可用梯度洗脫 8.柱外體積過(guò)大 將連接管徑和連接管長(zhǎng)度降至最小 9.樣品過(guò)載 進(jìn)小濃度小體積樣品經(jīng)驗(yàn)1：由強(qiáng)到弱：一般先用100%的乙腈(或甲醇)/0%的水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn)， 這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。 經(jīng)驗(yàn)2：三倍規(guī)則 ：每減少10%的有

37、機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。在此過(guò)程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況。 經(jīng)驗(yàn)3：精細(xì)調(diào)整：當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。色譜柱是有使用壽命的。一根正常的商品柱一般可以正常使用20005000次進(jìn)樣；保護(hù)良好的柱子可達(dá)10000次以上，但是有時(shí)候即使是一次不當(dāng)使用就可能使柱子發(fā)生嚴(yán)重的損害。柱子受損害后，可表現(xiàn)為柱壓升高、柱效下降、峰形異常等現(xiàn)象。 1. 柱壓升高 造成柱壓升高的可能原因有很多。一般是由于柱床內(nèi)產(chǎn)生了異常的占位性物體，造成流體阻力加大所引起的。 （1）流動(dòng)相過(guò)濾不良 這

38、往往是由于流動(dòng)相沒(méi)有過(guò)濾，或者雖然已經(jīng)過(guò)濾但濾膜孔徑過(guò)大或?yàn)V片損壞，使得固體雜質(zhì)滯留于濾板上所造成的。致使柱的進(jìn)口濾片處堵塞，壓力升高。 （2）霉菌生長(zhǎng) 霉菌在流動(dòng)相中、管路中或柱子進(jìn)口處繁殖、生長(zhǎng)，堵塞濾板，導(dǎo)致壓力升高。這種現(xiàn)象在夏天，尤其是使用磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相時(shí)更易發(fā)生。在夏季使用磷酸鹽緩沖液時(shí)一般要現(xiàn)配現(xiàn)用。即使保存在冰箱中，一般也不要超過(guò)兩天。否則，即使不堵塞濾板，也會(huì)因細(xì)菌或霉菌孳生而產(chǎn)生的代謝物造成對(duì)樣品的干擾。 （3）非特異性吸附 當(dāng)溶質(zhì)在柱子上有較強(qiáng)的非特異性吸附，且當(dāng)前所用的流動(dòng)相難以將它們洗脫時(shí)，累積的未洗脫溶質(zhì)也會(huì)造成阻力增大和壓力升高。 （4）更換流動(dòng)相時(shí)置換不徹底 致使流動(dòng)相不互溶 （5）鹽晶體的析出 更換流動(dòng)相后，緩沖液在新的流動(dòng)相體系溶解度低而析出 （6）樣品的沉淀 配制樣品的溶劑與流動(dòng)相不一致時(shí)，樣品進(jìn)入柱中溶解度可能降低而析出 （7）壓力脈沖 運(yùn)行過(guò)程中，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生系統(tǒng)內(nèi)壓力的突然升降。如，轉(zhuǎn)動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí)動(dòng)作過(guò)緩，造成液流堵塞再瞬間釋放；開(kāi)機(jī)瞬間壓差較高等。壓力脈沖會(huì)造成多孔填料的崩壞和柱床結(jié)構(gòu)的微小變化。填料微屑的長(zhǎng)期累積可能會(huì)使柱床阻力增大。 2.柱效下降 柱子