1、11.2 基因工程的基本操作程序?qū)ｎ}1 基因工程第1頁(yè)，共55頁(yè)。2第2頁(yè)，共55頁(yè)。3基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定第3頁(yè)，共55頁(yè)。4編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 終止子啟動(dòng)子與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)補(bǔ)：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)：非編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)，連續(xù)不間斷不編碼蛋白質(zhì)，有調(diào)控作用第4頁(yè)，共55頁(yè)。5編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 終止子啟動(dòng)子與RNA聚酶結(jié)合位點(diǎn)補(bǔ)：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)外顯子內(nèi)含子不編碼蛋白質(zhì)，有調(diào)控作用編碼區(qū)：非編碼區(qū)：外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列第

2、5頁(yè)，共55頁(yè)。6結(jié)構(gòu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加工修飾成熟mRNA第6頁(yè)，共55頁(yè)。7 關(guān)于內(nèi)含子和外顯子的說(shuō)法正確的是 （ ） A. 內(nèi)含子和外顯子在轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中都能夠轉(zhuǎn)錄成成 熟的mRNAB. 只有外顯子能夠轉(zhuǎn)錄成mRNA，tRNA，rRNAC. 原核細(xì)胞基因中也有內(nèi)含子和外顯子D. 由于內(nèi)含子不能編碼蛋白質(zhì)，故它屬于非編碼區(qū)B第7頁(yè)，共55頁(yè)。8從基因文庫(kù)中提取目的基因1 基因文庫(kù)(gene library)概念又稱(chēng)DNA文庫(kù)，是指某個(gè)生物的基因組DNA或cDNA片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外重組后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并通過(guò)一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽(yáng)性菌落(或噬菌體)，所有菌落或噬菌體的集合即為

3、該生物的基因文庫(kù)?；蛭膸?kù)由外源DNA片段、載體和宿主組成。第8頁(yè)，共55頁(yè)。9基因文庫(kù)的分類(lèi)按照外源DNA片段的來(lái)源：從特定組織提取的染色體基因組DNA -基因組DNA文庫(kù)（總）mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA拷貝-cDNA文庫(kù)（部分）基因文庫(kù)的目的 為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。第9頁(yè)，共55頁(yè)。10基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)第10頁(yè)，共55頁(yè)。11基因文庫(kù)中不是直接保管相應(yīng)基因，而是保存受體菌，菌中含基因第11頁(yè)，共55頁(yè)。12利用PCR提取目的基因PCR：是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。原理：DNA雙鏈復(fù)制原料：模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；

4、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；離子第12頁(yè)，共55頁(yè)。13模板DNA （已知堿基序列） 特異性引物（DNA）耐熱DNA聚合酶（Taq酶） dNTPs （4種脫氧核苷酸）Mg+(促進(jìn)dNTP與核酸骨架作用)PCR體系基本組成成分第13頁(yè)，共55頁(yè)。14PCR的基本反應(yīng)步驟變性90-95C延伸70-75C退火55-60C第三步：將反應(yīng)體系升溫至7075 ，在耐高溫的DNA聚合酶催化作用下，將與模板互補(bǔ)的單個(gè)核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA鏈延伸合成，產(chǎn)生一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈。第一步：將反應(yīng)體系（包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應(yīng)所需的離子等）

5、加熱至9095 ，使雙鏈DNA模板兩條鏈之間的氫鍵打開(kāi)，變成單鏈DNA，作為互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板。第二步：將反應(yīng)體系降溫至5560 ，使兩種引物分別與模板DNA鏈配對(duì)結(jié)合，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為復(fù)性。第14頁(yè)，共55頁(yè)。15模板DNA9553355335變性第15頁(yè)，共55頁(yè)。1655533555AB引物AB退火第16頁(yè)，共55頁(yè)。1772533555Taq酶延伸1第17頁(yè)，共55頁(yè)。1872533555延伸2第18頁(yè)，共55頁(yè)。19Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性(%)溫度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20第19頁(yè)，共55頁(yè)。2

6、0729455PCR循環(huán)第20頁(yè)，共55頁(yè)。21模板DNA95第21頁(yè)，共55頁(yè)。22PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物第22頁(yè)，共55頁(yè)。23PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第23頁(yè)，共55頁(yè)。24PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束第2輪開(kāi)始第24頁(yè)，共55頁(yè)。25PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaq第25頁(yè)，共55頁(yè)。26PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束第26頁(yè)，共55

7、頁(yè)。27PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù) 第27頁(yè)，共55頁(yè)。28靶序列靶序列PCR 循環(huán)第一步：加熱變性第28頁(yè)，共55頁(yè)。29靶序列靶序列引物 引物 53553533PCR 循環(huán)第二步：引物與靶序列退火第29頁(yè)，共55頁(yè)。30靶序列靶序列引物引物53553533Taq DNA聚合酶PCR 循環(huán)第三步：引物延伸第30頁(yè)，共55頁(yè)。31靶序列 靶序列第1個(gè) PCR

8、循環(huán)完成后：得到兩個(gè)拷貝的靶序列第31頁(yè)，共55頁(yè)。32PCR是針對(duì)特定DNA片斷的快速體外復(fù)制增殖技術(shù)每循環(huán)一輪，目的基因的量可增加一倍增殖速率為2n,（n為循環(huán)次數(shù)） 每完成一個(gè)循環(huán)需2-4分鐘，2-3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。 第32頁(yè)，共55頁(yè)。33PCR技術(shù)擴(kuò)增過(guò)程a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下， 斷裂，形成 。 b、復(fù)性（55-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物 與DNA模板結(jié)合，形成局部 。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，從 引物的5端3端延伸，合成與模板互補(bǔ) 的 。 氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第33頁(yè)，共55頁(yè)。34從基因文庫(kù)中獲取

9、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增利用化學(xué)方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法DNA合成儀DNA序列自動(dòng)測(cè)序儀PCR擴(kuò)增儀第34頁(yè)，共55頁(yè)。35基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA 連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種 限制酶 目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。第35頁(yè)，共55頁(yè)。36構(gòu)建表達(dá)載體組成目的基因啟動(dòng)子終止子標(biāo)記基因目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在；可以遺傳給下一代；使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。復(fù)制原點(diǎn)插入基因終止子抗生素抗性基因表達(dá)載體啟動(dòng)子第36頁(yè)，共55頁(yè)。37將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管

10、通道法第37頁(yè)，共55頁(yè)。38將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）第38頁(yè)，共55頁(yè)。39將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞Ca2處理受體細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞，再進(jìn)行混合。 將細(xì)菌用CaCl2處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性。第39頁(yè)，共55頁(yè)。40目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè):是否插入目的基因是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯鑒定:功能活性鑒定抗性鑒定第40頁(yè)，共55頁(yè)。41DNA分子雜交技術(shù)DNA-RNA分子雜交技術(shù)抗原抗體雜交技術(shù)檢驗(yàn)受體細(xì)胞染色體的DNA上是否插入了目的基因檢驗(yàn)?zāi)康幕蚴欠褶D(zhuǎn)錄出了mRNA檢驗(yàn)?zāi)康幕蚴欠癖磉_(dá)出了蛋白質(zhì)個(gè)體生物學(xué)檢驗(yàn)個(gè)體生物學(xué)性狀觀察第41

11、頁(yè)，共55頁(yè)。42DNA附著在膜上硝化纖維素加探針報(bào)告基因（含熒光素分子）變性DNA雜交（如檢測(cè)SARS病毒等）abcd第42頁(yè)，共55頁(yè)。43檢測(cè)是否插入目的基因，利用DNA分子雜交技術(shù)，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的DNA雜交，看是否有雜交帶。檢測(cè)是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，利用DNA分子雜交技術(shù)，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的mRNA雜交，看是否有雜交帶。檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)?？贵w與蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原抗體雜交，看是否有雜交帶。還可以進(jìn)行個(gè)體水平的鑒定，根據(jù)其性狀。提示：DNA分子雜交技術(shù)首先提取受體細(xì)胞中的DNA，然后高溫解成單鏈，再與同位素標(biāo)記的DNA

12、探針雜交；抗原抗體雜交所用到的抗體是用表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動(dòng)物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出而來(lái)的。第43頁(yè)，共55頁(yè)。44大量的受體細(xì)胞接受不多的目的基因。處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測(cè)出來(lái)。 將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測(cè)菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無(wú)表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。無(wú)表達(dá)產(chǎn)物無(wú)表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物無(wú)表達(dá)產(chǎn)物第44頁(yè)，共55頁(yè)。45歸納: 基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫(kù)利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢

13、測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯第45頁(yè)，共55頁(yè)。461.下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作的名詞及對(duì)應(yīng)的內(nèi)容，正確的組合是2、下列屬于獲取目的基因的方法的是利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫(kù)中提取從受體細(xì)胞中提取 利用PCR技術(shù) 利用DNA轉(zhuǎn)錄 人工合成A. B. C. D.第46頁(yè)，共55頁(yè)。473.細(xì)菌的質(zhì)粒分子帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性 B有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè)C增加質(zhì)粒分子的分子量D便于與外源基因連接4. 有關(guān)基因工程的敘述正確的是A限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用B重組質(zhì)粒的形成是在細(xì)胞內(nèi)完成的C質(zhì)粒都可作

14、為運(yùn)載體 D蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料第47頁(yè)，共55頁(yè)。485.哪項(xiàng)不是基因表達(dá)載體的組成部分 A啟動(dòng)子 B終止密碼 C標(biāo)記基因 D目的基因6.下列哪項(xiàng)不是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法 A基因槍法 B顯微注射法 C農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 D花粉管通道法第48頁(yè)，共55頁(yè)。49例、采用基因工程技術(shù)將人凝血因子基因?qū)肷窖蚴芫眩嘤隽宿D(zhuǎn)基因羊。但是，人凝血因子只存在于該轉(zhuǎn)基因羊的乳汁中。以下有關(guān)敘述，正確的是A.人體細(xì)胞中凝血因子基因編碼區(qū)的堿基對(duì)數(shù)目，等 于凝血因子氨基酸數(shù)目的3倍B.可用顯微注射技術(shù)將含有人凝血因子基因的重組 DNA分子導(dǎo)入羊的受精卵C.在該轉(zhuǎn)基因羊中，人凝血因子基因存在

15、于乳腺細(xì) 胞，而不存在于其他細(xì)胞中D.人凝血因子基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄后，DNA連接酶以DNA分 子的一條鏈為模板合成mRNAB第49頁(yè)，共55頁(yè)。50 胰島素是治療糖尿病的特效藥，長(zhǎng)期以來(lái)只能依靠從豬、牛等動(dòng)物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價(jià)格之高可想而知。 假如讓你用基因工程的方法使大腸桿菌生產(chǎn)出人的胰島素，想一想，如何設(shè)計(jì)？ 嘗試設(shè)計(jì) 第50頁(yè)，共55頁(yè)。511.答：不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1） 生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才

16、能比較有利于基因的表達(dá)；（2） 通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)法轉(zhuǎn)錄；（3） 目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4） 為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；（5） 有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。思考與探究（P15）第51頁(yè)，共55頁(yè)。522.解析：農(nóng)桿菌可分為根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌，在植物基因工程中以根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化最多。根瘤農(nóng)桿菌廣泛存在于雙子葉植物中。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，約有93屬6

17、43種雙子葉植物對(duì)根瘤農(nóng)桿菌敏感。裸子植物對(duì)該菌也敏感。當(dāng)這些植物被該菌侵染后會(huì)誘發(fā)腫瘤。近年來(lái)，也有報(bào)道該菌對(duì)單子葉植物也有侵染能力。 根瘤農(nóng)桿菌侵染植物是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。根瘤農(nóng)桿菌具有趨化性，即植物的受傷組織會(huì)產(chǎn)生一些糖類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)吸引根瘤農(nóng)桿菌向受傷組織集中。研究證明，主要酚類(lèi)誘導(dǎo)物為乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，這些物質(zhì)主要在雙子葉植物細(xì)胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，這也是單子葉植物不易被根瘤農(nóng)桿菌侵染的原因。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有誘導(dǎo)作用。酚類(lèi)物質(zhì)和糖類(lèi)物質(zhì)既可以作為根瘤農(nóng)桿菌的趨化物，又可以作為農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上Vir區(qū)（毒性區(qū)）基因的誘導(dǎo)

18、物，使Vir區(qū)基因活化，導(dǎo)致T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移，從而侵染植物細(xì)胞。第52頁(yè)，共55頁(yè)。53 需要注意的是農(nóng)桿菌中不同的菌株，侵染能力有差別，在基因工程中需要加以選擇使用。利用農(nóng)桿菌侵染單子葉植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，是需要加上述酚類(lèi)物質(zhì)的，同時(shí)單子葉植物種類(lèi)不同，農(nóng)桿菌侵染進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的效果也有很大差異。 如果想將一個(gè)抗病毒基因轉(zhuǎn)入小麥，也可以用農(nóng)桿菌，但要注意兩點(diǎn)：要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。第53頁(yè)，共55頁(yè)。543.解析：有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸