1、炮制方法對(duì)延胡索生物堿含量及其鎮(zhèn)痛作用的影響 綜合一體化實(shí)驗(yàn) 林親雄 陳旅翼 編寫一、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目擬達(dá)到的學(xué)生訓(xùn)練目的或目標(biāo)1.掌握延胡索炮制方法、要點(diǎn)及原料；2.掌握延胡索生物堿成分及鎮(zhèn)痛藥理作用測(cè)定的方法；3.了解炮制前后延胡索生物堿含量與鎮(zhèn)痛藥理作用變化的意義。二、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目涉及的主要科學(xué)原理1.延胡索的炮制及增效原理：按照2010年版中華人民共和國(guó)藥典延胡索項(xiàng)下的炮制方法、采用醋炙法炮制延胡索，增強(qiáng)其行氣止痛作用。其有效成分為難溶于水的生物堿，醋炙后可使生物堿成鹽，易于溶出。而生物堿又為其鎮(zhèn)痛有效成分。故醋炙后，延胡索的生物堿提取率和鎮(zhèn)痛作用均能增加。2.延胡索生物堿成分的HPLC測(cè)定：延胡

2、索的主要活性成分是生物堿類成分，具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和催眠作用，對(duì)心律失常、胃潰瘍等多種疾病有較好的臨床效果。通過(guò)HPLC方法比較分析醋炙前后延胡索主要生物堿成分的變化，可為闡明醋炙增效理論提供科學(xué)依據(jù)。3.鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)原理：采用小鼠腹腔注射0.4%的醋酸溶液，引起扭體反應(yīng)；采用熱板法，引起舔后足反應(yīng)；設(shè)置空白組，陽(yáng)性組、給藥組，以反映延胡索的鎮(zhèn)痛作用。三、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目需要的主要器材1.實(shí)驗(yàn)器具 炒鍋、鍋鏟、煤氣灶、搪瓷盤、切藥刀、標(biāo)準(zhǔn)篩（50目，即三號(hào)篩）、高效液相色譜儀、分析天平（1/100000）、水浴鍋、容量瓶（10ml、5ml）、圓底燒瓶（50ml）、平底燒瓶（100ml）、移液管（25ml

3、、50ml）、回流及回收裝置、燒杯、玻璃漏斗、錐形瓶、量筒、注射器、微孔濾膜、微量進(jìn)樣器、流動(dòng)相過(guò)濾裝置、 HPLC儀。臺(tái)式天平、燒杯（1000ml）、秒表、小鼠籠。2.實(shí)驗(yàn)材料：延胡索、米醋、甲醇（分析純和色譜純）、濃氨水、0.1%磷酸、三乙胺、蒸餾水、生理鹽水、0.6%醋酸溶液、苦味酸（動(dòng)物標(biāo)號(hào)用）延胡索乙素對(duì)照品。3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年ICR雄性小鼠（1822g）。 四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法1.延胡索的炮制（1）延胡索預(yù)處理：取原藥材，除去雜質(zhì)，大小分開(kāi)，洗凈，稍浸，潤(rùn)透，切厚片，干燥，篩去碎屑，或洗凈、干燥后搗碎。（2）醋炙延胡索：取凈延胡索或延胡索片，稱重，加入定量的米醋拌勻，悶潤(rùn)至醋被吸

4、盡后，置炒制容器內(nèi)，文火加熱，炒干，取出晾涼。稱重，計(jì)算得率。2 醋炙前后延胡索主要生物堿成分的含量測(cè)定2.1 醋炙前后延胡索總堿樣品的制備 延胡索生品溶液的制備：取延胡索生品干燥塊莖20.0g，粉碎過(guò)篩，取4.0g藥材粉末用ph3.5（醋酸調(diào)）75乙醇液120.0ml溶解，置于超聲波清洗機(jī)（40，500w）超聲40min，抽濾液，滲濾液減壓揮去乙醇（55），用蒸餾水定容至100ml，用10%氨水調(diào)ph至10.0。用乙醚1:1萃取三次，合并乙醚相，減壓揮干（40），加20ml甲醇使溶解，最后定容至25ml。取已定容25ml乙醚萃取物中的8ml蒸干，殘?jiān)?ml甲醇超聲溶解，用0.45um過(guò)濾即

5、得樣品A。 延胡索炮制品溶液的制備：同延胡索生品溶液的制備。 對(duì)照品溶液的制備：精確稱取原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿、四氫小檗堿四種對(duì)照品甲醇超聲溶解，用甲醇稀釋成1mg/ml的溶液。2.2 HPLC色譜條件與系統(tǒng)實(shí)用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH 6.0） (55：45)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為281nm。理論板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。梯度洗脫程序由學(xué)生自行探索。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和測(cè)定：將對(duì)照品溶液按照不同的比例進(jìn)行稀釋，精密吸取各不同稀釋倍數(shù)的對(duì)照品溶液各10 L，注入液相色譜儀，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法，進(jìn)行測(cè)定，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。 樣

6、品測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 L，注入液相色譜儀，測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。3醋酸扭體法比較延胡索炮制前后的鎮(zhèn)痛作用 （1）供試品溶液的制備 取延胡索生品及醋炙品各25g，分別煎煮，第一次加水400ml，第二次加水250ml煎煮2次，每次25分鐘，濾過(guò)，合并濾液，濃縮至50ml備用。 （2）試驗(yàn)方法 取小鼠隨機(jī)分為3組，每組4只，分別灌以生理鹽水和延胡索生品供試液、延胡索醋炙品供試液0.2ml/10g，40分鐘后，各鼠腹腔注射0.6%醋酸0.1ml/10g，注射后立即啟動(dòng)秒表，記錄扭體潛伏期及015分鐘、1530分鐘的扭體次數(shù)。4熱板法比較延胡索炮制前后的鎮(zhèn)痛作用 (1)

7、 供試品溶液的制備 取延胡索生品及醋炙品各25g，分別煎煮，第一次加水400ml，第二次加水250ml煎煮2次，每次25分鐘，濾過(guò)，合并濾液，濃縮至50ml備用。（2）把小鼠放在事先加熱至550.5的熱板測(cè)痛儀的金屬板上，熱板作為熱刺激，用秒表記錄自投入熱板至出現(xiàn)舔后足的時(shí)間（S）作為該鼠的痛閾值。給藥前先測(cè)定每只小鼠的痛閾值（共測(cè)定兩次，以平均值不超過(guò)30s者為合格）。取合格小鼠12只，稱重，均分為三組，分別灌以生理鹽水和延胡索生品供試液、延胡索醋炙品0.2ml/10g,40分鐘后，每隔0.51h測(cè)定一次痛閾值，連續(xù)數(shù)次，如痛閾值超過(guò)60s，即停止測(cè)試而按60s計(jì)。匯總各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)于下表

8、內(nèi)，按所測(cè)之痛閾平均值并依照下列公式計(jì)算藥物對(duì)小鼠的痛閾提高百分率。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果或結(jié)論1、醋炙前后延胡索主要生物堿成分的含量測(cè)定結(jié)果 將測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，填寫表1，附HPLC圖譜，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分說(shuō)明，得出結(jié)論。 表1 炮制前后延胡索生物堿成分的含量變化生物堿保留時(shí)間炮制前樣品峰面積炮制后樣品峰面積炮制前樣品濃度炮制后樣品濃度炮制后樣品濃度增加百分比原阿片堿乙素 紫堇堿四氫小檗堿2、醋炙前后延胡索鎮(zhèn)痛作用測(cè)定的結(jié)果 將測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，匯總?cè)鄶?shù)據(jù)后，采用SPASS進(jìn)行方差檢驗(yàn)，判斷顯著性差異，并作圖。填寫表2-5，附相關(guān)實(shí)驗(yàn)圖片或圖譜，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分說(shuō)明，得出結(jié)論。表2 動(dòng)物扭體潛伏期和單位時(shí)間內(nèi)的扭體次數(shù)組別體重給藥量（ml）扭體潛伏期（秒）扭體次數(shù)（次/10分鐘）015分鐘1530分鐘生理鹽水生延胡索醋炙延胡索 表3 匯總?cè)鄬?shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表組別