1、固定化木瓜蛋白酶與溶液酶性質的比較學生姓名 劉晶 指導老師 萬善霞摘要：本文就木瓜蛋白酶固定化后的性質與其溶液酶性質進行了初步比較。以變性的卵清蛋白為載體，以戊二醛做交聯(lián)劑固定木瓜蛋白酶。結果表明：與溶液酶相比，固定化后的木瓜蛋白酶最適反應溫度提高了30，最適反應PH向堿性方向移動2.0，其熱穩(wěn)定性及耐熱性均較溶液酶有顯著提高。關鍵詞：木瓜蛋白酶；固定化；卵清蛋白；戊二醛Comparison of the properties immobilized papain and soluble papainLiu Jing Wan ShanxiaAbstract: In this paper, th

2、e immobilized papain with the nature of a preliminary nature of the soluble papain compared.To denatured egg white protein as the support with glutaraldehyde as the cross-linker. The result showed that:compared with the soluble papain,immobilized papain increased the optimum temperature 30,optimum P

3、H2.0 to the basic direction, The thermostability and thermotolerance of the immobilized papain are obviously increased compared to those of the soluble one.Key words: papain; immobilization; egg white protein; glutaraldehyde目錄 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc199241766 1.序言5 HYPERLINK l _Toc199241767

4、 2.實驗材料5 HYPERLINK l _Toc199241768 2.1儀器及器材5 HYPERLINK l _Toc199241769 2.2 實驗試劑 6 HYPERLINK l _Toc199241774 3.實驗方法及結果6 HYPERLINK l _Toc199241775 3.1實驗測定原理6 HYPERLINK l _Toc199241776 3.2固定化酶與溶液酶最適溫度的比較7 HYPERLINK l _Toc199241777 3.2.1 實驗方法7試劑組成7木瓜蛋白酶的固定化7木瓜蛋白酶溶液酶活力的檢測7固定化酶活力的定8 HYPERLINK l _Toc199241

5、778 3.2.2實驗結果及分析9 實驗結果9 結果分析10 HYPERLINK l _Toc199241779 3. 3固定化酶與溶液酶最適PH的比較10 HYPERLINK l _Toc199241777 3.3.1 實驗方法10試劑組成 10木瓜蛋白酶的固定化11木瓜蛋白酶溶液酶活力的檢測11固定化酶活力的定11 HYPERLINK l _Toc199241781 3.3.2實驗結果及分析11 實驗結果11 結果分析12 HYPERLINK l _Toc199241782 3. 4固定化酶與溶液酶熱穩(wěn)定性的比較12 HYPERLINK l _Toc199241783 3.4.1試驗方法1

6、2試劑組成12木瓜蛋白酶的固定化12木瓜蛋白酶溶液酶活力的檢測13固定化酶活力的定14 HYPERLINK l _Toc199241784 3.4.2實驗結果及分析14 實驗結果14 結果分析15 HYPERLINK l _Toc199241785 3. 5固定化酶與溶液酶耐熱性的比較15 HYPERLINK l _Toc199241786 3.5.1試驗方法15試劑組成15木瓜蛋白酶的固定化15木瓜蛋白酶溶液酶活力的檢測15固定化酶活力的定16 HYPERLINK l _Toc199241787 3.5.2實驗結果及分析16 實驗結果16 結果分析16 HYPERLINK l _Toc199

7、241797 4.討論17 HYPERLINK l _Toc199241798 5.結論17 HYPERLINK l _Toc199241799 參考文獻18 HYPERLINK l _Toc199241800 致謝191.序言木瓜蛋白酶（Papain）簡稱木瓜酶，又稱為木瓜酵素。木瓜蛋白酶由212個 HYPERLINK /wiki/%E6%B0%A8%E5%9F%BA%E9%85%B8 o 氨基酸 氨基酸殘基組成，并含有3對二硫鍵，是一種含疏基(-SH)肽鏈的內切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，具有較廣泛的特異性1。它的三維結構是由兩個不同的 HYPERLINK /wiki/%E7%BB%93%

8、E6%9E%84%E5%9F%9F o 結構域 結構域所組成，兩個結構域之間形成一個縫隙；縫隙內含有 HYPERLINK /wiki/%E9%85%B6 o 酶 酶的 HYPERLINK /wiki/%E6%B4%BB%E6%80%A7%E4%BD%8D%E7%82%B9 o 活性位點 活性位點，包括一個 HYPERLINK /w/index.php?title=%E5%82%AC%E5%8C%96%E4%B8%89%E8%81%94%E4%BD%93&action=edit&redlink=1 o 催化三聯(lián)體 催化三聯(lián)體，與 HYPERLINK /wiki/%E8%83%B0%E5%87%9

9、D%E4%B9%B3%E8%9B%8B%E7%99%BD%E9%85%B6 o 胰凝乳蛋白酶 胰凝乳蛋白酶中所含的相似。木瓜蛋白酶中的催化三聯(lián)體由25位的 HYPERLINK /wiki/%E5%8D%8A%E8%83%B1%E6%B0%A8%E9%85%B8 o 半胱氨酸 半胱氨酸（Cys-25）、159位的 HYPERLINK /wiki/%E7%BB%84%E6%B0%A8%E9%85%B8 o 組氨酸 組氨酸（His-159）和158位的 HYPERLINK /wiki/%E5%A4%A9%E5%86%AC%E9%85%B0%E8%83%BA o 天冬酰胺 天冬酰胺（Asn-158）這

10、三個氨基酸所組成2。木瓜蛋白酶是一種重要的生化產(chǎn)品，它已被廣泛應用于食品、美容化妝品、醫(yī)藥保健品、日化品、飼料、皮革、紡織等多個行業(yè)，有效提高產(chǎn)品的質量和檔次，降低生產(chǎn)成本。木瓜蛋白酶的固定化始于20世紀60年代初，但多數(shù)方法不是因為材料來源困難，就是因為試劑毒性較大而影響了其在工業(yè)上應用。Kamata3曾報道過廉價的卵清蛋白做載體來固定化胰蛋白酶和-淀粉酶。但這種方法操作相對繁瑣，必需先對卵清蛋白進行糖基化，再將糖基化后的載體與酶進行固定，并且糖基化后的載體容易溶解，從而導致固體化酶的回收率偏低。本文以此為基礎，載體直接選用變性的卵清蛋白，結合傳統(tǒng)的交聯(lián)固定法，用戊二醛做交聯(lián)劑，成功的固定了

11、木瓜蛋白酶，簡化了操作步驟。用卵清蛋白固定化的木瓜蛋白酶在耐熱性、熱穩(wěn)定性、耐酸堿等方面都較溶液酶有明顯提高。這為木瓜蛋白酶的固定和提供一種新的途徑，為擴大其在工業(yè)中的應用提供了一定技術依據(jù)。2.實驗材料2.1儀器及器材UV-2100型 紫外分光光度儀Sartorius 電子分析天平 三溫三孔水浴鍋HZQ-C型 空氣浴震蕩儀海爾4恒溫冰箱移液槍DNP-9052 型電熱恒溫培養(yǎng)箱WG-71型 電熱恒溫鼓風干燥箱PH 綜合測試儀試管和試管架；燒杯；玻璃棒；量筒；漏斗；研缽；200ml離心管；150ml離心管；石英比色皿；移液槍槍頭； 2.2 試劑木瓜蛋白酶（0.5-2units/mg）半胱氨酸乙二

12、胺四乙酸 EDTA硫酸氫二鈉（分析純）磷酸二氫鈉（分析純）戊二醛25%（生化試劑）氫氧化鈉（分析純）干酪素（棕色瓶子保存）三氯乙酸 (TCA)3 實驗方法及結果3.1實驗測定原理本試驗采用以酪蛋白為底物的紫外分光光度法測定木瓜蛋白酶的活性。木瓜蛋白酶分解酪蛋白的產(chǎn)物為酪氨酸共軛雙鍵，在280nm處，檢測酪氨酸共軛雙鍵的吸光系數(shù)，酶的單位定義為每分鐘吸光值增加0.01所需的酶量。 對于木瓜蛋白酶的固定，則用變性的卵清蛋白直接作為載體, 結合傳統(tǒng)的交聯(lián)固定法, 用戊二醛作交聯(lián)劑，形成共價鍵，成功地固定了木瓜蛋白酶,主要是基于經(jīng)濟效益和安全兩個方面的考慮。首先，卵清蛋白體的獲得及制備十分容易，且成本

13、低。另外，在食品和醫(yī)藥的用用中，卵清蛋白載體無毒性問題，這是產(chǎn)品的安全性大大提高；戊二醛又最常用的交聯(lián)劑之一，交聯(lián)效果穩(wěn)定，并且簡化了操作步驟。因此，這種固定化木瓜蛋白酶的方法可取。3.2 固定化酶溶液酶最適溫度的比較3.2.1 實驗方法試劑組成木瓜蛋白酶 1.6mg/ml 酪蛋白 5mg/ml三氯乙酸 15%戊二醛 5%磷酸緩沖液 （0.2 mol/L的pH7.0的磷酸緩沖液中含30 mmol/L半胱氨酸和0.6 mmol/L EDTA,）木瓜蛋白酶的固定化參考相關文獻可知4，以卵清蛋白為載體固定化木瓜蛋白酶的最佳條件。取定量的雞蛋清，按13的比例加入蒸餾水，于100水浴攪拌加熱使其變性成膠

14、狀，于電熱恒溫鼓風干燥箱烘干，研細，以此作為載體。取1g的載體，加入10mg的木瓜蛋白酶，隨后加入pH6的磷酸緩沖液及5%戊二醛溶液，用電熱恒溫培養(yǎng)箱混勻，振蕩20小時，過濾，將固定后的酶用pH6的磷酸緩沖液洗滌干凈，冰箱備用。木瓜蛋白酶溶液酶活力的檢測稱取0.16 g木瓜蛋白酶(0.5-2units/mg),溶于0.2 mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液并定容至100 mL,過濾,制得1.6mg/ml的木瓜蛋白酶溶液,用比色法測定酶活力。在0.1 mL 1.6 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液中加入0.9 mL磷酸緩沖液(0.2 mol/L的pH7.0的磷酸緩沖液中含30 mmol/L半胱氨酸和0

15、.6 mmol/L EDTA,現(xiàn)配現(xiàn)用),分別于30、40、50、60、70、80、90、100水浴恒溫10 min,加入相應溫度恒溫預熱的5 mg/mL的酪蛋白溶液1 mL(0.2 mol/L pH7.0的磷酸緩沖液配制), 相應溫度下準確反應10 min,立即加入15%三氯乙酸(TCA)溶液3 mL終止反應,對照則先加TCA終止反應,再加5 mg/mL的酪蛋白溶液1 mL,其余與測定管相同?；旌暇鶆蚝?， 25下放靜置5 min后,漏斗過濾,濾液于280 nm波長下測定光吸收值（操作過程見表1）表1 木瓜蛋白酶溶液酶加樣順序 管號0 （對照）1 （樣品）2( 樣品 )酶液（ ml ）0.10

16、.10.1激活劑（ ml ）1.01.01.0恒溫預熱 10 分鐘酪蛋白（ ml ）01.01.0恒溫水浴 10 分鐘15%TCA （ ml ）3.03.03.0酪蛋白（ ml ）1.000搖勻，靜置 10 分鐘過濾OD 280nm0.000固定化酶活力的測定在試管中加入1.0 mL 0.1 mol/L， pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液(含30m mol/L半胱氨酸和0.6mmol/L EDTA,)，分別于30、40、50、60、70、80、90、100預熱5 min，加入0.01g的固定化酶，隨后加入1.0 mL 酪蛋白溶液。于相應溫度水浴中震蕩反應， 10 min后立即加入3 mL 15%的三

17、氯乙酸溶液終止反應，混合均勻后，25下靜置30 min，漏斗過濾， 280 nm處測定上清液的吸光度。（操作過程見表2）表2 木瓜蛋白酶溶液酶加樣順序 管號0 （對照）1 （樣品）2( 樣品 )激活劑（ ml ）1.01.01.0恒溫預熱 5 分鐘固定化酶（g）0.010.010.01酪蛋白（ ml ）01.01.0恒溫水浴 10 分鐘15%TCA （ ml ）3.03.03.0酪蛋白（ ml ）1.000搖勻，25靜置 30 分鐘過濾OD 280nm0.0003.2.2實驗結果及分析 實驗結果表3 不同溫度下，固定化木瓜蛋白酶與其溶液酶活性酶組溫度溶液酶固定化酶第一組第二組第三組平均值第一組

18、第二組第三組平均值300.0110.0090.0120.0110.0090.0080.0100.009400.0500.0470.0470.0480.0120.0120.0100.012500.0670.0670.0650.0650.0230.0250.0240.024600.1030.1010.1020.1020.0310.0330.0320.032700.0850.0880.0860.0860.0410.0440.0400.042800.0830.0850.0840.0840.0700.0900.0800.080900.0640.0640.0630.0630.0980.0970.0960.0971000.0200.0230.0220.0220.0890.0870.0860.088根據(jù)三次檢測的平均值，繪圖如下（見圖1）固定化酶與游離酶最適溫度的選擇 圖1 結果分析檢測結果如圖1所示，可見在同一反應體系中，溶液酶的最適反應溫度為60，固定化酶為90。固定化酶的最適反應溫度提高了30，說明固定化酶的熱穩(wěn)定性好。3.3 固定化酶與溶液酶最適PH的比較3.3.1 實驗方法試劑組成木瓜蛋白酶 1.6mg/ml酪蛋白 5mg/ml三氯乙酸 15%戊二醛 5%磷酸緩