1、醫(yī)院細胞遺傳室人淋巴細胞培養(yǎng)及染色體制備作業(yè)指導(dǎo)書目的規(guī)范外周血標(biāo)本細胞培養(yǎng)及染色體制備過程，為臨床外周血淋巴細胞染色體核型分析可靠性提供質(zhì)量保證。測試方法密閉式培養(yǎng)/手工收獲測試原理外周血中的淋巴細胞幾乎都是處在G期或G期，一般情況下是不分裂的。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入植物血凝素( phytohemagglutinin PHA )時，這種小淋巴細胞受到刺激后轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，并開始進行有絲分裂。經(jīng)過短期培養(yǎng)后，用秋水仙素處理就可獲得大量中期分裂相的細胞，制 片后可以清楚地對染色體進行觀察與分析。性能特征經(jīng)G顯帶處理后可見 300-550條顯帶。. 樣本特征及受檢者準(zhǔn)備外周血用5ml 滅菌注射器吸取注

2、射用肝素(6250U/ml )0.05 ml濕潤管壁。消毒皮膚，于肘靜脈采血約 5ml,立即 送檢 。試劑人體外周血淋巴細胞培養(yǎng)基(必須具備三證)，秋水仙素：濃度20以g/ml低滲液：0.075mol/L的KCl溶液，卡諾固定液試劑與耗材超凈工作臺、待檢標(biāo)本、酒精燈，燒杯，天平，離心機，恒溫培養(yǎng)箱，冰盒，載玻片，玻片盒，光學(xué)顯微鏡，滅菌注射器（5ml） ，離心管，無菌吸管，量筒，培養(yǎng)瓶，試劑瓶等。操作程序淋巴細胞培養(yǎng)與處理取血：外周血用5ml 滅菌注射器吸取注射用肝素（ 6250U/ml ） 0.05 ml 濕潤管壁。消毒皮膚，于肘靜脈采血約5ml。在酒精燈火焰旁，向培養(yǎng)瓶內(nèi)人體外周血淋巴細胞

3、培養(yǎng)基中接種，外周血每瓶0.3-0.5ml （用 5ml 的注射器的7 號黑色針頭垂直滴加；男：G 帶：1 線 28 滴， 2 線 30 滴；女性多種2 滴） 。接種后輕輕水平搖動幾次混勻。 TOC o 1-5 h z 細胞培養(yǎng)：直立于培養(yǎng)箱內(nèi)密閉式培養(yǎng)箱培養(yǎng)66-72小時。外周血淋巴細胞培養(yǎng)環(huán)境的溫度為37cC 0.5 0C,且一定要以溫箱內(nèi)部溫度為準(zhǔn)，每隔24 小時左右輕搖1 次，以促進細胞生長增殖；秋水仙素處理：培養(yǎng)終止前在培養(yǎng)基中加入濃度為20以g/ml的秋水仙素0.01-0.02ml （用1ml注射器針頭垂直滴 加23滴），使最終濃度為 0.04-0.08以g/ml , 370C 0

4、.5 oC培養(yǎng)箱中處理4 小時；低滲處理：秋水仙素處理完畢后，小心地從溫箱取出培養(yǎng)瓶，用吸管吸取培養(yǎng)物入離心管，離心(1500rpm,10min )。然后加入 37oC溫育的 0.075mol/L 的 KCl低滲溶液8ml,用吸管吹打成細胞懸液，置37oC水溶處理35min；預(yù)固定：在每個離心管中加入1.5ml 的固定液，繼續(xù)37oC水浴，5-10min ;離心： 1500rpm 10min ，棄上清液；固定：在離心管中加入固定液6-8ml ，立即用吸管輕輕吹打，單個細胞懸液，在 37oC水溶中固定5-10min 后，離心，1500rpm, 10min,棄上清液；再固定：重復(fù)第 6 步；制片：

5、在離心管中滴入新固定液0.2 毫升，用吸管將淋巴細胞團輕輕吹打成細胞懸液，從冰箱的冷凍室內(nèi)取出冰片，每片滴加懸液 1-2滴，75oC烤3小時；染色：用0.025%胰酶消化后用 Giemsa染液染色(消化時間和染色時間因環(huán)境變化有差別，因此每次顯帶染色應(yīng)進行預(yù)實驗)，然后用鑷子夾出玻片，用自來水輕輕沖洗兩面，室溫干燥或電吹風(fēng)吹干；鏡檢：待玻片干后，在顯微鏡下檢查。先用低倍鏡尋找良好的分裂相，然后用高倍油鏡觀察。9 參考范圍染色體數(shù)目：46,XN ；染色體結(jié)構(gòu)：無明顯結(jié)構(gòu)異常潛在變異來源1）不排除細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生突變的可能性，從而導(dǎo)致染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)改變，因此應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行1-2 線平行操作，以發(fā)現(xiàn)因培養(yǎng)過程導(dǎo)致的結(jié)果異常。2）接種所用器皿要進行嚴(yán)格的滅菌處理。3）秋水仙素處理時間過長，分裂細胞多，染色體短小；反之，則少而細長。都不宜觀察形態(tài)及計數(shù)。故秋水仙素的濃度及時間要準(zhǔn)確掌握。4）低滲使紅細胞膜破裂，淋巴細胞膨脹，低滲處理濃度及時間要適當(dāng)。且低滲后混勻細胞一定要輕，否則引起膜破裂、染色體散失。5）固定液應(yīng)在使用前臨時配制，要求新鮮，否則將形成脂類，從而影響固定效果環(huán)境安全1）試劑中含有防腐劑和穩(wěn)定劑, 請勿直接接觸皮膚、眼睛、黏膜，一旦接觸，立即用大量清