1、 病 毒第一節(jié) 病 毒非細胞生物（真）病毒：至少含核酸和蛋白質(zhì)二種組分亞病毒類病毒：只含具侵染性的RNA組分衛(wèi)星RNA：只含有不具侵染性的RNA組分朊病毒：只含蛋白質(zhì)特點： 無細胞結(jié)構(gòu)，專性活細胞內(nèi)寄生； 沒有酶或酶系統(tǒng)極不完全，不能進行代謝活動； 個體極小，能通過細菌濾器； 對抗生素不敏感，對干擾素敏感。病毒是超顯微的，沒有細胞結(jié)構(gòu)的，專性活細胞內(nèi)寄生的實體。它們在活細胞外具有一般化學(xué)大分子特征，一旦進入宿主細胞又具有生命特征。一、病毒的形態(tài)構(gòu)造和化學(xué)成分（一）病毒的大小個體小，必需在電鏡下觀察；不同病毒的毒粒大小差別很大；毒粒的形狀大致可分球形顆粒(或稱擬球形顆粒)、桿狀顆粒和復(fù)雜形狀顆粒

2、（如蝌蚪狀，卵形）等少數(shù)幾類。（二）病毒的形態(tài)1、典型病毒粒的構(gòu)造基本成分核酸位于中心，稱為核心蛋白質(zhì)包圍在核心周圍，形成衣殼核心和衣殼合稱核衣殼，為病毒的基本結(jié)構(gòu)。有些復(fù)雜的病毒在衣殼的外面包裹著一層由脂類和多糖組成的包膜。有的包膜上還長有刺突。2、病毒粒的對稱體制螺旋對稱二十面體對稱復(fù)合對稱無包膜有包膜無包膜有包膜無包膜有包膜3、病毒的群體形態(tài)噬菌體感染細菌后，使細菌細胞破裂死亡，連續(xù)重復(fù)感染使大量的細菌死亡，在培養(yǎng)細菌的平板上，可以看到一個個透明不長細菌的小圓斑，稱為噬菌斑。人工培養(yǎng)的單層動物細胞感染病毒后，也會形成類似噬菌斑的動物病毒群體，稱為空斑。單層動物細胞受到腫瘤病毒的感染后，會

3、使動物細胞惡性增生，形成類似細菌菌落的病灶，稱為病斑。煙草花葉病毒感染煙草后，在葉片上出現(xiàn)的一個個壞死的病灶，稱為枯斑。1、螺旋狀對稱型：煙草花葉病毒（TMV） 呈直桿狀，長300nm，寬15nm，中空內(nèi)徑4nm，由158個氨基酸組成一個皮鞋狀的衣殼粒，相對分子量為17500，總共2130個衣殼粒，排列成130圈螺旋，核酸核心是單鏈的RNA，相對分子質(zhì)量為260萬，含有6390個核苷酸，每3個核苷酸與一個衣殼粒相結(jié)合，盤繞于蛋白質(zhì)的中空內(nèi)徑中。（三）3類典型形態(tài)的病毒及其代表 二十面體具有12個角、20個面 和30條棱。腺病毒的衣殼是典型的二十面體對稱， 由252個衣殼組成，沒有包膜。腺病毒的

4、核心是由線狀雙鏈DNA構(gòu)成的。 其基因組的大小都約為36500個核苷酸對。2、二十面體對稱型： T4由頭部（核心是雙鏈線狀DNA）、頸部和尾部（尾鞘、尾管、基板、刺突和尾絲）三個部分構(gòu)成。3、復(fù)合對稱型：偶數(shù)噬菌體4、 病毒的核酸 核酸是病毒的遺傳物質(zhì)；控制著病毒的增殖及對 宿主的感染性； 一種病毒的毒粒只含有一種核酸：DNA或是RNA；病毒核酸單鏈DNA（ss DNA）；雙鏈DNA（ds DNA）；單鏈RNA（ss RNA）；雙鏈RNA（ds RNA）；二、四類病毒及其繁殖方式（一）原核生物的病毒噬菌體與其他病毒一樣，噬菌體除有其特異性宿主外，并無顯著區(qū)別。它們都是由蛋白質(zhì)和核酸組成。基本形

5、態(tài)為蝌蚪形、球形、和絲狀三種。從結(jié)構(gòu)看以可分為六種不同的類型。1、噬菌體的繁殖病毒粒子并無個體的生長過程，而只有其兩種基本成分的合成和裝配，即： 核酸復(fù)制+蛋白質(zhì)合成核蛋白（病毒粒子）噬菌體的繁殖一般可分五個階段，即吸附 侵入增殖（復(fù)制與生物合成）成熟（裝配）裂解（釋放）尾絲尖端與宿主細胞表面的特異性受體接觸，可觸發(fā)尾絲散開，附著在受體上，隨之把刺突、基板固定（1）吸附病毒吸附蛋白與細胞受體間的結(jié)合力來源于空間結(jié)構(gòu)的互補性，相互間的電荷、氫鍵、疏水性相互作用及范得華力。（2）侵入吸附尾釘固著尾鞘收縮尾管穿入DNA注入尾部的酶水解細胞壁的肽聚糖，使細胞壁產(chǎn)生小孔；尾鞘收縮，核酸通過中空的尾管壓入

6、胞內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼留在胞外；（3）增殖 病毒利用宿主的生物合成機構(gòu)和場所，使病毒核酸表達和復(fù)制，產(chǎn)生大量的病毒蛋白質(zhì)和核酸。（4）成熟（裝配）T4噬菌體的裝配是一個極為復(fù)雜的指導(dǎo)裝配的過程（5）裂解（釋放）吸附侵入早期：病毒特異性酶的合成病毒核酸復(fù)制病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)合成裝配釋放病毒大分子合成2、噬菌體效價的測定效價表示每毫升試樣中所含有的具侵染性的噬菌體粒子數(shù)又稱噬菌斑形成單位（pfu）或感染中心 測定的方法雙層平板法 用雙層平板法測出的效價比用電鏡直接記數(shù)得到的效價低。 前者是計有感染力的噬菌體粒子，后者是計噬菌體的總數(shù)。 一步生長曲線可分為三個時期： 潛伏期是指菌體的核酸侵入宿主細胞后至第 一

7、個噬菌 體粒子裝配前的一段時間。 裂解期是指溶液中噬菌體粒子急劇增多的一 段時間。 穩(wěn)定期溶液中噬菌體總數(shù)達到最高點后的時期。3、一步生長曲線定量描述烈性噬菌體生長規(guī)律的實驗曲線稱作一步生長曲線4、溶 源性 溫和噬菌體或稱溶源性噬菌體（lysogenic phage）：感染宿主細胞后不能完成復(fù)制循環(huán)，噬菌體基因組長期存在于宿主細胞內(nèi)，沒有成熟噬菌體產(chǎn)生。這一現(xiàn)象稱做溶源性（lysogeny）現(xiàn)象附著或融合在溶源性細菌染色體上的溫和噬菌體的核酸稱為原噬菌體或前噬菌體。前噬菌體含有溫和噬菌體的DNA 而又找不到形態(tài)上可見的噬菌體粒子的宿主細菌叫溶源性細菌。溶源性細菌的基本特性： 自發(fā)裂解 誘發(fā)裂解

8、 免疫性 復(fù)愈性 溶源轉(zhuǎn)變植物病毒沒有專門的吸附結(jié)構(gòu)，通過昆蟲口器、摩擦傷口和人為傷口進入寄主細胞。植物病毒在入住宿主細胞后脫去蛋白質(zhì)外殼。 TMV的衣殼粒以雙層盤的形式組裝成衣殼，PH的改變、RNA的嵌入對衣殼的裝配起關(guān)鍵作用。（二）植物病毒（三）人類和脊椎動物病毒脊椎動物病毒包括DNA和RNA病毒，動物病毒的釋放方式多種多樣，主要有以下幾種形式：1.無包膜的病毒，如腺病毒通過細胞裂解或局部破裂而釋放。2.有包膜的DNA病毒，如皰疹病毒，以細胞質(zhì)中通道釋放到細胞外。3.有包膜的RNA病毒，如副流感病毒用出芽方式通過寄主細胞膜， 釋放到細胞外并獲得細胞源性的包膜和產(chǎn)生刺突。腺病毒的復(fù)制可代表D

9、NA病毒的復(fù)制脊髓灰質(zhì)炎病毒的復(fù)制可代表RNA病毒的復(fù)制1.吸附：腺病毒吸附在宿主細 胞表面的糖蛋白受體上。2.穿入：通過吞噬作用進入胞內(nèi)。3.脫殼：寄主細胞的蛋白酶 水解腺病毒衣殼。 4.在宿主細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄早期 mRNA并翻譯早期蛋白。5.在宿主細胞核內(nèi)復(fù)制出病毒的 DNA和晚期mRNA。 一些帶有囊膜的病毒，如單純皰疹病毒，當它們的核酸和衣殼蛋白組裝完畢后，它們將以“出芽”的方式，包裹寄主細胞的細胞膜或核膜，從寄主細胞中釋放出來。 引起愛滋病的病毒人類免役缺陷病毒（HIV）從淋巴細胞中釋放出來（四）昆蟲病毒多數(shù)昆蟲病毒可在宿主細胞內(nèi)形成光鏡下呈多角形的包涵體，稱多角體，成分為堿溶性結(jié)晶蛋白

10、，其內(nèi)包裹著數(shù)目不等的病毒粒。核形多角體病毒（NPV）：在昆蟲細胞核內(nèi)增殖、具有 蛋白質(zhì)包涵體的桿狀病毒 質(zhì)形多角體病毒（CPV）：在昆蟲細胞質(zhì)內(nèi)增殖、可形 成蛋白質(zhì)包涵體的球狀病毒 顆粒體病毒（GV）：具有蛋白質(zhì)包涵體，每個包涵體 內(nèi)通常僅含一個病毒粒的昆蟲桿 狀病毒主要有三種類型：第二節(jié) 亞 病 毒1971年T.O.Diener闡明馬鈴薯紡錘形塊莖病毒的病原是一種具有感染性和自主復(fù)制能力的低分子RNA（類病毒，Diener,1971）以后又發(fā)現(xiàn)了稱之為擬病毒(Randles,1981)的植物病毒Prusiner發(fā)現(xiàn)了朊病毒(Prusiner,1982)。一、類病毒類病毒是裸露的，僅含一個單

11、鏈環(huán)狀低相對分子質(zhì)量RNA分子的病原體。 發(fā)現(xiàn)的第一個類病毒是馬鈴薯紡錘形塊莖病類病毒(Potato spindletuber viroid，PSTV)，這是一種導(dǎo)致馬鈴薯嚴重減產(chǎn)的病原體，棒狀，無蛋白外殼。它僅含一個由359個核苷酸組成的單鏈環(huán)狀RNA分子(相對分子質(zhì)量約100 000)。該分子內(nèi)有很多堿基(70)通過氫鍵配對而形成雙螺旋區(qū)，未配對堿基則形成內(nèi)環(huán)。雙螺旋區(qū)與內(nèi)環(huán)交替排列形成一個伸長的棒狀分子。 類病毒RNA相對分子質(zhì)量雖小，但能獨立侵染寄主，侵入寄主后也能自我復(fù)制，不需要輔助病毒。二、擬病毒 一類被包裹在植物病毒粒體內(nèi)部的類病毒，被稱為擬病毒。擬病毒含有兩種RNA分子，一種和

12、一般病毒中的類似，另一種RNA分子與類病毒有相似的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，也是環(huán)狀的。不過這兩種RNA分子單獨都不表現(xiàn)致病性，只有聯(lián)合起來才具有復(fù)制和感染性。這種類似類病毒的RNA稱之擬病毒（Virusoid）。 又稱蛋白質(zhì)侵染因子。朊病毒是一類能侵染動物并在宿主細胞內(nèi)復(fù)制的小分子無免疫性疏水蛋白質(zhì)。羊瘙癢病是羊的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化性紊亂疾病。表現(xiàn)為毛脫落，皮膚瘙癢，失去平衡和后肢麻痹等癥狀。這種“羊瘙癢病”的病原是經(jīng)過近兩個世紀的研究未能解決的一個謎。直至1982年，美國加洲大學(xué)舊金山分校動物病毒學(xué)家SBPrusiner發(fā)現(xiàn)羊瘙癢病是蛋白質(zhì)侵染引起的疾病，并稱為“Prion”即朊病毒?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)

13、與朊病毒有關(guān)的疾病有羊瘙癢病、貂腦病、人的庫魯?。ㄕ痤澆。┖涂搜攀喜?。有人還推測人類的一些慢性退化性紊亂疾病，像早老年癡呆，帕金森氏病、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和紅斑狼瘡等疾病也可能是由朊病毒引起的。三、朊病毒(prion) ：變態(tài)反應(yīng)(allergy ) 定義：抗原或半抗原刺激機體產(chǎn)生細胞性和體液性免疫反應(yīng)，當二次抗原再進來時發(fā)生了超敏反應(yīng)，引起組織損傷。 分類：1、根據(jù)反應(yīng)發(fā)生的快和慢來分：速發(fā)型，遲發(fā)型 2、1968年Gell和Coombs將變態(tài)反應(yīng)分為、。 第一節(jié) 型變態(tài)反應(yīng)（anaphylaxis） 一、動物過敏性休克二、人類的型超敏反應(yīng)1、血清過敏性休克（serumanaphylaxi

14、s）舉例：注射破傷風(fēng)抗毒素（馬血清）癥狀：病人不安，注射局部腫脹，鼻喉發(fā)癢，呼吸困難，血壓下降，出冷汗，休克處理：一問，二試，三注射脫敏目的：避免組胺一次大量釋放2、 藥物過敏性休克舉例：青霉素容易過敏的原因：1、遺傳因素，家族史2、日常生活中自然致敏3、注射器未洗滌干凈3、局部過敏反應(yīng)1、食物過敏2、花粉、香料3、動物皮毛三、發(fā)病機理 型超敏反應(yīng)的介質(zhì)1、組織胺(histamin)生物學(xué)效應(yīng)：作用十分短暫。增強毛細血管通透性，使支氣管及其平滑肌發(fā)生收縮，并刺激黏液腺分泌。2、白三烯(srs-a)：生物學(xué)效應(yīng)：作用慢而持久。平滑肌收縮，支氣管哮喘。3、激肽（kinin）生物學(xué)效應(yīng);刺激平滑肌收

15、縮，對人支氣管有很強的收縮作用，強烈的血管擴張作用，血壓下降4、血小板活化因子（paf）生物學(xué)效應(yīng)：活化血小板使其釋放組織胺，引起毛細血管擴張和通透性增加嗜酸性粒細胞趣化因子（ecf-a）生物學(xué)作用：吸引嗜酸性細胞向局部聚集的趨化作用。5、5羥色胺（5ht）生物學(xué)活性與組織胺相似6、前列腺素（pg）生物學(xué)活性:血管擴張劑和支氣管收縮劑 小 結(jié)1、 發(fā)作快2、 抗體是IgG3、 無補體參加4、 反應(yīng)重，大多發(fā)生休克，出現(xiàn)全身或局部癥狀5、 和遺傳有關(guān)，個體有差異6、 可以用抗體被動轉(zhuǎn)移第二節(jié) 型變態(tài)反應(yīng) 細胞毒型（cytotoxic type）一、特 點1、起因：由于中等大小可溶性免疫復(fù)合物沉積

16、2、致?。好庖邚?fù)合物沉積在血管基底膜上，激活補體，吸引中性粒細胞及血小板聚集，造成血管炎癥損傷。3、 抗體為IgG、IgM一、型變態(tài)反應(yīng)的特點1、抗原：機體細胞本身或藥物半抗原2、抗體：IgM,IgG3、補體參加4、被毒害的靶細胞：主要是血細胞，組織細胞5、結(jié)果：靶細胞融解，通過三條途徑：吞噬， ADCC,補體激活 二、分 類（一）自身成分成為自身抗原1、 輸血反應(yīng)2、 新生兒溶血母親為Rh()，第一胎是Rh()，第二胎是Rh()，導(dǎo)致溶血預(yù)防：第一胎分娩后72小時內(nèi)，給母親注射抗D-丙球蛋白產(chǎn)前診斷：孕婦血清中有無Rh抗體出生后診斷：有無黃疸、水腫、貧血（二）外源性抗原1、藥物半抗原常引起過

17、敏性血細胞減少癥非那西汀、對氨基水楊酸，青霉素，內(nèi)毒素：溶血性貧血奎尼丁、氯霉素、磺胺、安替比林、保泰松：粒細胞減少癥奎寧、奎尼丁、苯海拉明:血小板減少性紫癜2、 抗腎小球基底膜型鏈球菌感染后腎小球腎炎：A型溶血性鏈球菌與腎小球基底膜有共同抗原，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)三、發(fā)病機理第三節(jié) 型變態(tài)反應(yīng) 免疫復(fù)合物型（immune complex type allergic reaction） 4、 抗原抗體比例A 抗原抗體比例合適，凝聚為不溶性免疫復(fù)合物，易被吞噬，不引起損傷。B 可溶性免疫復(fù)合物，體積微小者，在體內(nèi)易通過血管壁滲出，易被血流沖走，無危害。C 抗原抗體比例不合適，形成中等大小體積者的抗原抗

18、體沉淀于血管壁，激活補體，吸引中性粒細胞，造成血管炎癥損傷。二、發(fā)病機理（表）三、相關(guān)疾病1、 血清病第一次大劑量注射異種動物血清后，體內(nèi)第7天就產(chǎn)生IgG、IgM抗體,而異種動物血清尚未完全清除，二者結(jié)合形成可溶性免疫復(fù)合物，隨血流嵌入腎小球基底膜，關(guān)節(jié)滑液中，皮下組織毛細血管中。激活補體，吸引白細胞與血小板聚集，釋放血管活性物質(zhì)和溶酶體酶，引起腎小球腎炎。2、鏈球菌感染后腎小球腎炎鏈球菌M蛋白刺激機體產(chǎn)生抗體，再次感染時，鏈球菌抗原與已形成的抗體形成免疫復(fù)合物，沉積于腎小球基底膜，激活補體。3、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎慢病毒感染，支原體侵犯關(guān)節(jié)滑液引起炎癥。IgG進入關(guān)節(jié)與抗原形成復(fù)合物，被吞噬細胞

19、吞噬。水解酶損傷IgG,并釋放出細胞。變性的IgG刺激機體產(chǎn)生抗體。其中的IgM抗體即Rh因子。4、 Arthus現(xiàn)象局部的抗體多于抗原，形成中等大小的免疫復(fù)合物，激活補體，產(chǎn)生過敏毒素，引起水腫，最終形成壞死性血管炎而導(dǎo)致潰瘍。 第四節(jié) 型變態(tài)反應(yīng)（delayed type allergic）一、 特點1、發(fā)作慢：致敏的機體再次接觸抗原12小時才出現(xiàn)反應(yīng)，2472小時至高峰2、細胞主導(dǎo)：T細胞起作用，無抗體、補體參加3、病變特點：單核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞浸潤為主的；炎癥病變 4、致敏的淋巴細胞釋放的淋巴因子是細胞免疫中重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，淋巴因子一般是對機體有利的，但過強會損傷組織。 二、發(fā)

20、病機制 三、 相關(guān)疾病1、傳染病細菌：結(jié)核、傷寒、副傷寒病毒：腮腺炎、皰疹病毒、牛痘病毒真菌：白色念珠菌2、接觸性皮炎接觸的小分子化學(xué)物質(zhì)藥物、化妝品等和皮膚蛋白結(jié)合形成完全抗原致敏 青霉素皮試和結(jié)核菌素皮試的區(qū)別OT 青霉素 （馬血清）原理型變態(tài)反應(yīng)（遲發(fā)型）型變態(tài)反應(yīng)（速發(fā)型）材料菌體蛋白 1：2000/0.1cc200單位/0.1cc 青霉素（馬血清）20單位/0.1cc結(jié)果判讀時間24-72h20陽性結(jié)果標準0.5cm紅腫、硬結(jié)（致敏淋巴細胞浸潤）紅暈（境界不清，偽足狀，周邊發(fā)紅，中間發(fā)白，水腫）陽性說明有型變態(tài)反應(yīng)，有細胞免疫對青霉素過敏，不能使用陰性無細胞免疫，未感染過TB，接種卡

21、介苗對象第五節(jié) 變態(tài)反應(yīng)的防治原則 1、 詢問病史（過去史、家族史、接觸史）、皮試 2、 尋找過敏源，避免接觸3、 穩(wěn)定細胞膜：色氨酸二鈉等4、 提高CAMP的藥物5、 抗組織胺：苯海拉明，撲爾敏6、 平喘解痙：麻黃素7、 降低毛細血管通透性：CaCl2，VC8、 鈣離子拮抗劑：異搏定、硝苯吡啶等第四章 病毒 第三節(jié) 病毒的干擾現(xiàn)象與干擾素 干擾現(xiàn)象：兩種病毒同時感染一個細胞，其中一種會抑制另一種病毒增殖的現(xiàn)象。干擾素定 義： 由病毒或其他IFN誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)人或動物細胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，它具有抗病毒、抑制腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性種 類：種類產(chǎn)生細胞 抗病毒 抗腫瘤 免疫調(diào)節(jié) 人白細胞 強 弱

22、 弱 人成纖維細胞 強 弱 弱 T細胞 弱 強 強干擾素特性廣譜性、種的特異性、間接性；抑制細胞分裂、分化及成熟；活化巨噬細胞及抑制細胞內(nèi)寄生物IFN的誘生與抗病毒機理 IFN的誘生和作用示意圖 早期中斷病毒復(fù)制，阻止病毒擴散分期接種疫苗，避免干擾現(xiàn)象干擾現(xiàn)象的意義： 干擾素的副作用1.流感樣綜合征：患者發(fā)熱、寒戰(zhàn)、全身不適，肌痛、頭痛等。 2.造血系統(tǒng)改變：抑制骨髓，降低外周血白細胞及血小板。3.消化系統(tǒng)反應(yīng)：如食欲不振、味覺異常、惡心、嘔吐、泄瀉、腹脹等。 4.皮膚反應(yīng)：用藥超過4個月者的最常見副作用是輕、中度脫發(fā)，偶有停藥后更嚴重者。 第四節(jié) 病毒的感染與免疫病毒的傳播方式一、水平傳播病

23、毒在人群不同個體間的傳播病毒侵入機體的重要門戶媒介昆蟲叮咬感染呼吸道消化道動物咬傷感染接觸感染登革熱常見的癥狀1、發(fā)熱所有患者均發(fā)熱。2、皮疹于病程25日出現(xiàn)，初見掌心、腳底或軀干及腹部，漸延及頸部及四肢。3、出血于發(fā)病后5-8日，2550%病例有不同部位、不同程度的出血。 4、淋巴結(jié)腫大全身淋巴結(jié)可有輕度腫大及觸痛。 5、其他可有肝臟腫大，脾大不常見，ALT升高 二、垂直傳播通過胎盤或產(chǎn)道，病毒由母親傳給胎兒的方式胎盤流產(chǎn)病毒感染的播散方式1 局部播散2 經(jīng)淋巴和血流播散3 經(jīng)神經(jīng)通道播散病毒的致病機理一、病毒對宿主細胞的直接作用 細胞水平上致病機理1、殺細胞性感染：多見于無包膜病毒 2、穩(wěn)

24、定狀態(tài)感染：多見于有包膜病毒 3、整合感染：多見于腫瘤病毒4、細胞凋亡5、細胞的增生和轉(zhuǎn)化 二、病毒感染的免疫病理作用 機體水平上致病機理1、體液免疫的病理作用2、細胞免疫的病理作用3、免疫系統(tǒng)的功能被抑制感染的類型向外播散病毒 機體獲得特異性免疫急性感染 持續(xù)性感染 隱性感染顯性感染慢性感染： 病程長 病毒可檢出 如HBV潛伏感染：經(jīng)感染后，病毒基因存在于組織細胞中，可反復(fù)激活，急性發(fā)作病毒只有在急性發(fā)作時才被檢出如 HSV、ZVZ慢發(fā)病毒感染：潛伏期長，發(fā)病后為亞急性進行性直至死亡尋常病毒非尋常病毒 持續(xù)性感染 第五節(jié)噬菌體噬菌體（bacteriophage , phage） 是感染細菌、

25、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的 病毒 具有病毒的特性：個體微小，可以通過細菌濾器，電鏡觀察沒有完整的細胞結(jié)構(gòu)，由蛋白質(zhì)和核酸組成專性細胞內(nèi)寄生的微生物噬菌體噬菌體與宿主菌的關(guān)系 宿主細胞溶解（溶菌反應(yīng)） 兩種結(jié)局 宿主細胞呈溶原狀態(tài)（溶原性反應(yīng)） 毒性噬菌體 溶菌反應(yīng) 兩種噬菌體 溶菌反應(yīng) 溫和噬菌體 溶原性反應(yīng)毒性噬菌體（virulent phage） 概念：能在宿主菌細胞內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生許多子代噬菌體， 并最終裂解細菌的噬菌體。完成溶菌周期復(fù)制周期： 吸附 穿入 生物合成 組裝與釋放 毒性噬菌體復(fù)制周期噬菌現(xiàn)象液體培養(yǎng)基 混濁 澄清固體培養(yǎng)基中，出現(xiàn)噬斑（plaque）溫和噬菌體（temp

26、erate phage） 概念： 噬菌體基因與宿主菌染色體整合，不產(chǎn)生子代 噬菌 體，但噬菌體DNA能隨細菌DNA復(fù)制，并隨細菌的分 裂而傳代。該種狀態(tài)稱溶原狀態(tài)。該噬菌體稱 溫和噬 菌體。 前噬菌體（prophage）：整合在細菌基因組中的噬菌體基因 溶原性細菌（lysogenic bacterium）：帶有前噬菌體基因的 細菌 完成溶原周期, 誘導(dǎo)條件下完成溶菌周期溶原性轉(zhuǎn)換 某些前噬菌體可導(dǎo)致細菌基因型和性狀發(fā)生改變?nèi)茉灾芷诤腿芫灾芷?發(fā)生整合的噬菌體基因可隨細菌基因的噬菌體基因傳給子代細菌，該過程稱之為噬菌體的溶原性周期。在一定條件下，細菌的溶原狀態(tài)可自發(fā)停止，噬菌體進入溶菌周期，

27、產(chǎn)生許多子代噬菌體，導(dǎo)致細菌裂解，稱為溶菌性周期。溫和噬菌體有溶原性周期和溶菌周期 毒性噬菌體則只有一個溶菌性周期溶原性細菌具有的特征 該菌的某些生物學(xué)性狀發(fā)生改變 例： 帶有-棒狀桿菌噬菌體的白喉棒狀桿菌 產(chǎn)生 白喉外毒素 噬菌體的應(yīng)用細菌的鑒定與分型分子生物學(xué)研究的重要工具作為局部感染的輔助治療研究病毒的意義 1.噬菌體可以作為防治某些疾病的特效藥，例如燒傷病人在患處涂抹綠膿桿菌噬菌體稀釋液 2.在細胞工程中，某些病毒可以作為細胞融合的助融劑，例如仙臺病毒 3.在基因工程中，病毒可以作為目的基因的載體，使之被拼接在目標細胞的染色體上 4.在專一的細菌培養(yǎng)基中添加的病毒可以除雜 5病毒可以作

28、為精確制導(dǎo)藥物的載體 6病毒可以作為特效殺蟲劑 7病毒還在生物圈的物質(zhì)循環(huán)和能量交流中起到關(guān)鍵作用 8病毒還可以用來治療疾病，比如癌癥 病毒的細胞培養(yǎng)趙健喬一 基本原理二 細胞培養(yǎng)的基本概念三 主要優(yōu)點四 培養(yǎng)實驗用品的前期處理五 培養(yǎng)細胞的生長方式及類型六 細胞培養(yǎng)的實驗步驟七 病毒的細胞培養(yǎng)一 基本原理通過機械解離或消化等方法將組織或細胞從機體取出，分散成單個細胞，給與必要的生長條件。模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使其在體外能繼續(xù)生長與增值。在長成致密單層細胞后，將病毒接種在細胞上，置于適當環(huán)境中進行培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變（CPE）待75%的細胞出現(xiàn)CPE后收獲細胞，反復(fù)凍融3次，置-70保存?zhèn)溆?。?/p>

29、胞培養(yǎng)的基本概念傳代：細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。原代培養(yǎng)：取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。二 主要優(yōu)點 研究的對象是活的細胞。 研究的條件可以人為的控制。 研究的樣本，可以達到比較均一性。 研究的內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄。 研究的范圍比較廣泛。 研究的費用相對較經(jīng)濟。三 分類原代細胞培養(yǎng)傳代細胞培養(yǎng)原代細胞培養(yǎng)概念：從供體獲取組織細胞后在體外進行的首次培養(yǎng)。優(yōu)點：生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，細胞染色體仍為二倍體，接近和反映體內(nèi)生長特性，適合做藥物測試、細胞分化及病毒學(xué)方面的實驗缺點：傳代次數(shù)較多細胞就會衰亡。傳代細胞培養(yǎng)概念：原

30、代細胞經(jīng)過一系列傳代，產(chǎn)生變異，轉(zhuǎn)化為能夠連續(xù)傳代的細胞。傳代細胞可以直接從腫瘤組織獲得，又可以通過人工馴化獲得。常用的傳代細胞：PK-15、IBRS-2、Vero、Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela 等 四 培養(yǎng)實驗用品的前期處理1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿 (2)塑料器皿2.包裝3.消毒：在組織細胞培養(yǎng)技術(shù)中，務(wù)必保證組織細胞在無微生物的條件下生長。4.細胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基（液）: （1）水：蒸餾水、雙蒸水，可高壓除菌。（2）平衡鹽溶液（PBS)：PH為7.27.4，不含鈣鎂離子 ， 可高壓除菌。（3）消化液 : 胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的濃度為025，pH值7.2

31、左右。需過濾除菌。 EDTA液：常用濃度為 002，配制時采用無Ca2+、Mg2+平衡鹽液溶解，高壓滅菌后即可使用。 (4) 培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析，易發(fā)生支原體污染合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無

32、機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。 人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子激素促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分一般說來含5小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死但支持細胞生長一般需加10血清對于血清支持細胞生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、

33、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56 ，30 分鐘（5）丙酮酸鈉、葡萄糖：是屬碳水化合物的成分，是細胞生命的能量來源。（6）抗生素：最終濃度為青霉素 100 Uml，鏈霉素100Uml（青霉素為80萬U瓶，將其溶解于4ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液中加人0.5ml；鏈霉素為100萬U瓶，將其溶解在5ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液加0.5ml）。（7）凍存液：二甲基亞砜（8）細胞生長液：是用以維持細胞生長增殖的液體。其是配方： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 8090 血清 10% 雙抗 100u/ml （9）細胞維持液：用以維持細

34、胞緩慢生長或不死的培養(yǎng)液。其是配方： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 95 血清 25 雙抗 100u/ml 五 培養(yǎng)細胞的生長方式及類型 貼附生長型細胞 必須貼附于底物才能生長的細胞。從形態(tài)上大體分為上皮細胞型及成纖維細胞型，還有一些難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的細胞。 懸浮生長型細胞 不需要附著于底物而于懸浮狀態(tài)下即可生長。每代貼附生長細胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）貼附生長型細胞細胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板、96孔板懸浮生長型細胞六 細胞培養(yǎng)的實驗步驟1原代細胞的培養(yǎng) 以雞胚成纖維細胞為例 （1）取胚 （2）組織處理 （3）消化 （4）分裝、培養(yǎng)（1）取胚選取9-11日齡SPF雞胚，

35、大頭朝上直立于蛋架上，用碘酒、酒精消毒氣室外殼。用鑷子從氣室端打開蛋殼，撕開殼膜，用無菌鑷子輕輕取出雞胚，放入滅菌平皿中。（2）組織處理用PBS液沖洗胚體2-3次，再將雞胚的頭、爪、內(nèi)臟去除，剩下的胚體在用PBS液沖洗胚體2-3次，然后再放入平皿中，用剪刀將雞胚剪成碎塊。（3）消化用PBS液充分沖洗組織碎塊2-3次，加入3-5倍量的胰蛋白酶消化液，置37消化10分鐘，每隔2-3分鐘輕輕搖動一次。待組織碎塊聚合成團，邊緣毛樣模糊時取出，輕輕吸取上層消化液，加適量DMEM培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打，使細胞分散。（4）分裝、培養(yǎng)將細胞懸液移入細胞培養(yǎng)瓶中，在細胞培養(yǎng)瓶中加入到10ml DMEM，充分混勻

36、，讓細胞呈單個形式存在，最后將其放入恒溫箱中培養(yǎng)。2傳代細胞的培養(yǎng)（1）細胞的復(fù)蘇（2）細胞的傳代（3）細胞的換液（4）細胞生長狀況的觀察（5）細胞的凍存（1）細胞的復(fù)蘇概述 復(fù)蘇細胞與凍存的要求相反，應(yīng)采用快速融化的手段。這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化。避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損害。操作步驟 準備好培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液和離心管等放于超凈工作臺內(nèi)。 從保存液氮或低溫冰箱中凍存管（安瓶）的小袋或凍存盒內(nèi)取出的凍存管（安瓶）應(yīng)直接投入37溫水中，并輕輕搖動令其內(nèi)容盡快融化。 從37水浴中取出凍存管或安瓶，離心1000r1min,用酒精消毒后開啟，用滴管吸出上清

37、液，注入培養(yǎng)液1ml充分混勻，轉(zhuǎn)入刻度離心管制成細胞懸液后低速離心，除去上清液，必要時再重復(fù)用培養(yǎng)液洗一次。 用培養(yǎng)液適當稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)。如果復(fù)蘇時細胞密度較高要及時傳代。細胞復(fù)蘇時細胞數(shù)可以做1020倍稀釋，接種密度以5105 ml為宜。（2）細胞的傳代原理 在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和（細胞增值達到一定密度后），為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。操作步驟

38、 將長滿細胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去。 用1-2ml營養(yǎng)液或PBS緩沖液，清洗培養(yǎng)瓶，倒出 加入1ml含有EDTA的胰酶，清洗五面，倒出 在加入1ml含有EDTA的胰酶，當看到培養(yǎng)瓶上含有一兩個小空斑，也可看到有灰白色渾濁時，將胰酶倒掉 加入培養(yǎng)液，用移液管吹洗貼有細胞的一面，將細胞從培養(yǎng)瓶壁上吹下來 然后進行傳代消化傳代的步驟（3）細胞的換液原理： 當細胞的量很少，未能鋪滿整個生長表面，但細胞培養(yǎng)液的pH值已經(jīng)發(fā)生很大變化；或者是細胞形態(tài)很差等情況時，需要給細胞換液。操作步驟 （1）吸棄或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)的舊培養(yǎng)液 （2）加入PBS溶液清洗細胞瓶五面 （3）加入足量的細胞生長液，放入37、5%

39、CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。（4）細胞生長狀況的觀察原理： 應(yīng)每日或隔日觀察一次細胞，及時了解細胞形態(tài)、數(shù)量及培養(yǎng)液pH值、污染與否等情況，以便采取相應(yīng)的措施處理。 肉眼觀察 顯微鏡觀察（5）細胞的凍存?zhèn)鞔毎麘?yīng)有充足的凍存儲備。一則防止細胞因污染等原因造成細胞系的絕種。二則防止細胞因傳的代次太多，造成細胞衰老或細胞發(fā)生變異。細胞凍存方法（1）選取對數(shù)生長期的細胞，用常規(guī)傳代的方法將細胞制成懸液并計數(shù)，800-1000r/min離心5min，棄上清。（2）用細胞凍存液將沉淀重懸，調(diào)整細胞濃度至106-107個/ml，分裝于凍存管，注明細胞名稱，傳代及凍存日期。（3）冷凍保存：將凍存管于4放置30mi

40、n，然后移入-80超低溫冰箱過夜，再放入液氮罐長期保存。亦可使用程序降溫劑逐漸降溫，凍存速度先為每分鐘下降速度1-2，當溫度達到-25時，可調(diào)整下降速度為每分鐘5-10，溫度降至-100時，再放入液氮罐中長期保存。七 病毒的細胞培養(yǎng)以禽流感感染雞胚成纖維細胞為例。（1）病料的處理（2）病毒分離、繁殖（3）細胞病變的觀察（4）效價測定（5）中和實驗（1）病料的處理 采集疑是感染禽流感禽的心、腦、肺、淋巴結(jié)在含有雙抗的PBS液中研磨，4過夜，3000r/min離心10min，上清通過0.22m抽濾（2）病毒分離、繁殖1 將病毒液稀釋成多個濃度分別接種在雞胚中，雞胚死亡后收集尿囊液。取效價最高的尿囊

41、液接種細胞。2 將長成單層致密的雞胚成纖維細胞液倒掉，用PBS反復(fù)清洗3次，將死亡或脫落的細胞洗掉3 取0.5ml處理好的禽流感病毒液注入細胞瓶內(nèi)，使病毒液充分鋪滿瓶底4 將接種病毒后的細胞瓶置于培養(yǎng)箱中感作45 min，將感作后的細胞瓶補加4.5ml營養(yǎng)液后置于溫箱中培養(yǎng)5 12h后觀察細胞病變，若無明顯病變，則每隔3h觀察一次。當有70%細胞發(fā)生病變后，將細胞液反復(fù)凍融3次，用吸管反復(fù)吹打數(shù)次，使病毒完全從細胞中釋放出來 正常形態(tài)的雞胚成纖維細胞接毒后發(fā)生病變的雞胚成纖維細胞（4）效價測定 某些病毒具有凝集某種哺乳動物紅細胞的特性，利用該特性而進行的試驗稱為病毒的血凝試驗。病毒增殖技術(shù) 動

42、物增殖病毒技術(shù)禽胚增殖病毒技術(shù)細胞增殖病毒技術(shù)一、動物增殖病毒技術(shù) 選擇動物的標準：大動物應(yīng)來源于非疫區(qū)，最好是未接種過相應(yīng)病毒疫苗、青壯年和健康(經(jīng)臨床檢查、檢疫)；對相應(yīng)病毒易感，并十分敏感；經(jīng)隔離飼養(yǎng)和觀察檢查證明健康；家兔、小鼠、大鼠等應(yīng)符合普通級或清潔級實驗動物標準；雞應(yīng)屬非免疫雞或SPF級標準；犬和貓應(yīng)品種明確，并符合普通級實驗動物標準；體重、年齡要基本一致，個體差別不宜過大。 二、禽胚增殖病毒技術(shù)（一）禽胚的選擇 SPF雞胚 據(jù)國家標準，無22種特定病原體 非免疫雞胚 應(yīng)無特定病原的母源抗體， 普通雞胚 可能帶有雞的多種病原體，不適用于疫苗生產(chǎn) 異源性性疫苗：鴨胚和鴿胚（二）禽胚

43、接種途徑與收獲 絨毛尿囊膜接種法 尿囊腔接種法 卵黃囊接種法 羊膜腔接種法 靜脈接種法 腦內(nèi)接種法雞胚絨毛尿囊膜接種法 尿囊腔接種法 尿囊液收獲方法 雞胚卵黃囊接種法1種蛋質(zhì)量病原微生物：垂直傳遞，如白血病、腦脊髓炎、腺病毒、支原體及傳染性貧血因子等。母源抗體：抗生素：立克次氏體和鸚鵡熱衣原體 2孵化技術(shù)溫度：3739.5。傳染性支氣管炎病毒37 濕度：雞胚5357，水禽胚比雞胚高510。通風(fēng)：氧氣，二氧化碳。 翻蛋：（三）影響禽胚增殖病毒的因素3接種技術(shù) 不同病毒的增殖有不同的接種途徑， 同一種病毒接種不同日齡禽胚獲得的病毒量也不同。接種日齡：雞胚1314日齡。鴨胚1516日齡，尿囊液含 量

44、最高，平均約68ml，羊水約12ml。接種部位：不應(yīng)傷及胚體和血管，以免影響其發(fā)育嚴格防止禽胚污染 雞胚接種時嚴格無菌操作； 定期清掃消毒孵化室，保持室內(nèi)空氣新鮮； 種蛋入孵前先用溫水清洗，消毒，涼干。三、細胞增殖病毒技術(shù) 1細胞培養(yǎng)的概念 細胞培養(yǎng)(cell culture)是指利用機械、酶或化學(xué)方法使動物組織或傳代細胞分散成單個乃至24個細胞團懸液進行培養(yǎng)。細胞分類：根據(jù)細胞染色體和繁殖特性 原代細胞(primary cell) 細胞株(cell strain) 傳代細胞（continued cell line） 細胞系(cell line)（1）原代細胞(primary cell) 指由

45、新鮮組織經(jīng)剪碎和胰酶消化制備的細胞，如CEF細胞。（2）細胞株(cell strain) 又稱二倍體細胞 指自繼代培養(yǎng)的細胞中選育出具有特殊生物學(xué)性質(zhì)和標記的細胞。這類細胞且能保持原來的二倍染色體數(shù)目，能連續(xù)傳很多代(50100代)，但為有限生命；沒有腫瘤原。如PKl5、BHK21和Vero （3）傳代細胞（continued cell line） 細胞系(cell line) 能在體外無限傳代，應(yīng)用方便，其染色體數(shù)目及增殖特性均類似于惡性腫瘤細胞，且多來源于癌細胞，如HeLa細胞系 靜置培養(yǎng) 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)(suspension cell culture ) 微載體培養(yǎng)(microcarr

46、ier cell culture) 中空纖維細胞培養(yǎng)(hollow fibre cell culture) 微囊化細胞培養(yǎng)2細胞培養(yǎng)方法懸浮培養(yǎng) 通過振蕩或轉(zhuǎn)動裝置使細胞始終處于分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)方法，主要用于一些在振蕩或攪拌下能生長繁殖的細胞，如生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細胞。 微載體培養(yǎng)微載體直徑應(yīng)為60105nm，無毒性，透明，顆粒密度與培養(yǎng)液密度相近似，略重于液體，低速攪拌即能懸浮，不吸收培養(yǎng)液和化學(xué)反應(yīng)，表面光滑、硬度小、有彈性，易于細胞吸附在表面，如DEAESephadexA-50、Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3等。微載體培養(yǎng)的容器為特制的生物反應(yīng)器，有自動

47、化裝置。細胞產(chǎn)量達106107個/m1，每升培養(yǎng)液可加微載體25g，每克有80009000個珠子，培養(yǎng)面積約為25萬cm2，比常規(guī)培養(yǎng)面積大1025倍。 中空纖維細胞培養(yǎng)(hollow fibre cell culture) 組成:中空纖維生物反應(yīng)器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動泵中空纖維由乙酸纖維、聚氯乙烯丙烯復(fù)合物或多聚碳酸硅等材料制成，外徑50100m，壁厚2575m，壁呈海綿狀，上面有很多微孔。中空纖維的內(nèi)腔表面是一層半透性的超濾膜，允許營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物出入，而對細胞和大分子物質(zhì)（如單克隆抗體）有滯留作用。培養(yǎng)液能有效地分布，細胞培養(yǎng)維持時間可達數(shù)月，保持高度活性，培養(yǎng)的細胞密度大，細胞

48、分泌的蛋白質(zhì)濃度高，純度可達6090；占用空間小，適于各類細胞，但設(shè)備昂貴。 培養(yǎng)液血清細胞接種量pH溫度無菌條件培養(yǎng)器皿清潔度3. 細胞培養(yǎng)要素RPMI-1640、199、DMEM、F12 血清成分：必需氨基酸、促進細胞生長和貼壁的成分。-珠蛋白和白蛋白能促進細胞生長；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、a2-球蛋白和脂蛋白G2能促進細胞貼壁。血清選擇：同種動物優(yōu)于異種動物血清；人和牛血清優(yōu)于馬血清；馬血清優(yōu)于兔血清和雞血清。血清使用：目前國內(nèi)多用犢牛血清，使用前須經(jīng)56滅活30min，并進行細胞毒性試驗。生長液血清含量一般為520。維持液中血清量為0%5。血清替代因子：激素和生長因子（如胰島素、上皮

49、生長因子）、結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)鐵蛋白）、貼壁因子（如魚精蛋白、聚賴氨酸）和微量元素（如硒）四類幾十種，多數(shù)無血清培養(yǎng)液須補加38種血清替代因子。細胞接種量 細胞在生長過程中分泌刺激細胞分裂的物質(zhì)，若細胞量太少，這些物質(zhì)分泌量少，而作用也小。接種細胞數(shù)量越大，細胞生長為單層的速度越快，但細胞過多對細胞生長也不利。雞胚成纖維細胞為100萬m1小鼠或地鼠腎細胞為50萬m1猴腎細胞量為30萬ml傳代細胞為1030萬m1(1) 細菌污染(2) 真菌污染：念珠菌或酵母菌。 培養(yǎng)液中可見黃白色小點狀懸浮物 鏡檢時可見菌絲結(jié)構(gòu)。 (3) 支原體污染：污染率為5060(4) 病毒污染 組織帶毒 培養(yǎng)液帶毒4細胞培養(yǎng)

50、污染問題（1）血清 ：維持液內(nèi)犢牛血清含量一般不超過2。（2）溫度：狂犬病病毒32，犬皰疹病毒36。（3）pH：（4）病毒接種劑量：應(yīng)以TCID50為依據(jù) 一般按維持液的110(VV)量接入。 接種量小，細胞不能完全發(fā)生感染，會影響毒價； 接種量過大，會產(chǎn)生大量無感染性缺陷病毒。 (5) 病毒接種方法：異步接毒和同步接毒。5. 細胞培養(yǎng)病毒要素6. 病毒增殖指標與收獲細胞病變(CPE)：細胞圓縮，如痘病毒和呼腸孤病毒等；細胞聚合，如腺病毒；細胞融合形成合胞體，如副粘病毒和皰疹病毒；輕微病變，如正粘病毒、冠狀病毒等。包涵體和血凝性：也可作為檢查病毒增殖的指標。 有些病毒不產(chǎn)生CPE。病毒收獲：C

51、PE達80時收獲，反復(fù)凍融多次使病毒釋放， 然后離心除去細胞碎片，上清病毒液-20保存。病毒毒價：TCID50、中和試驗、AGP效價、HA疫苗制造工藝流程病毒性細胞疫苗制造工藝流程 病毒性組織疫苗制造工藝流程細菌疫苗和類毒素制造工藝流程 寄生蟲疫苗制備的工藝流程 常見致病病毒（一）呼吸道病毒呼吸道病毒的定義 指侵犯呼吸道，引起呼吸系統(tǒng)和/或呼吸系統(tǒng)外組織器官病變的病毒呼吸道病毒的種類及引起疾病核酸類型 病毒 科別 引起疾病RNA 流感病毒 正粘病毒 流行性感冒 副流感病毒 副粘病毒 感冒、支氣管炎、肺炎 呼吸道合胞病毒 副粘病毒 感冒、支氣管炎、肺炎 麻疹病毒 副粘病毒 麻疹 腮腺炎病毒 副粘

52、病毒 流行性腮腺炎 鼻病毒 副粘病毒 感冒、支氣管炎 風(fēng)疹病毒 披蓋病毒 風(fēng)疹 人冠狀病毒 冠狀病毒 感冒、咽炎DNA 人腺病毒 腺病毒 感冒、支氣管炎、肺炎 結(jié)膜炎、咽炎、扁桃腺炎流行性感冒病毒流感病毒的生物學(xué)特性一、形態(tài)與結(jié)構(gòu)二、培養(yǎng)特性三、抗原結(jié)構(gòu)四、抵抗力五、分型形態(tài)與結(jié)構(gòu)形態(tài)：球形、有包膜、核衣殼螺旋對稱結(jié)構(gòu)：核衣殼：核酸（單負鏈RNA、分節(jié)段） 核蛋白（NP） RNA多聚酶（PA、PB1、PB2）包膜：基質(zhì)蛋白M1、M2 （內(nèi)層） 鑲嵌蛋白HA、NA（外層）甲型流感病毒結(jié)構(gòu)模式HANAM1M2PB2PB1PANPRNAHANA甲型流感病毒(電鏡）甲型流感病毒(新分離株）流感病毒神經(jīng)

53、氨酸酶培養(yǎng)特性1、雞胚接種：羊膜腔、尿囊2、細胞培養(yǎng)：猴腎原代、狗腎傳代 感染細胞無明顯病變，須以紅細胞吸附、凝集 試驗證實抗原結(jié)構(gòu)1、核蛋白：穩(wěn)定、具型特異性2、內(nèi)膜基質(zhì)蛋白：穩(wěn)定、具型特異性3、HA、NA：甲型流感病毒易變異、構(gòu)成亞型 抗原漂移（antigenic drift） 抗原轉(zhuǎn)換（antigenic shift）甲型流感抗原轉(zhuǎn)換與疾病流行流行年代 亞型類別 代表株 1918 Hsw1N1 1947 H1N1（亞甲型） A/FM/1/47 1957 H2N2（亞洲甲型） A/Singapore/1/57 1968 H3N2（香港甲型） A/HongKong/1/68 1977 H1N

54、1（新甲1型） A/USSR/90/77抵抗力1、弱、不耐熱、56 30min殺滅 （-70 長期保存）2、對干燥、紫外線、乙醚、甲醛、 乳酸敏感分型 甲型 乙型 丙型疾病嚴重程度 + + +動物儲毒 + 引起大流行 + 引起傳播 + + 抗原調(diào)變 漂移、轉(zhuǎn)換 漂移 漂移RNA節(jié)段 + + +一、傳播方式二、所致疾病三、致病機制四、免疫性流感病毒的致病性傳播方式侵襲呼吸道上皮細胞增殖引起細胞空泡變性壞死脫落所致疾病飛沫傳播致病機制流感、肺炎、Reyes綜合征免疫性1、細胞免疫：存在廣泛的亞型間交叉反應(yīng)2、體液免疫：同型病毒可形成牢固免疫力 亞型間無交叉反應(yīng)流感病毒感染的診斷與防治一、微生物學(xué)檢

55、查二、防治 標本類型：咽嗽液、鼻咽拭檢測方法：病毒分離：雞胚接種、細胞培養(yǎng) 血清學(xué)診斷：血凝抑制試驗 病毒核酸測定：PCR微生物學(xué)檢查防治疫苗：三價滅活疫苗治療：抗病毒劑、中草藥腸道病毒腸道病毒的分類關(guān)系小RNA病毒科腸道病毒屬鼻病毒屬脊髓灰質(zhì)炎病毒柯薩奇病毒?？刹《拘履c道病毒甲型肝炎病毒腸道病毒的生物學(xué)特性一、形態(tài)與結(jié)構(gòu)二、抵抗力形態(tài)與結(jié)構(gòu)形態(tài)：球形、無包膜、 核衣殼20面體立體對稱結(jié)構(gòu)：核酸單正鏈RNA、不分節(jié)段 多蛋白水解為4個（VP1-VP4） VP1-VP3衣殼蛋白 VP4核蛋白脊髓灰質(zhì)炎病毒結(jié)構(gòu)模式VP1VP2VP3抵抗力1、強、耐酸、耐脂溶劑2、熱、紫外線敏感腸道病毒的分型脊髓灰

56、質(zhì)炎病毒 1、2、3型柯薩奇病毒A組 1-22、24型柯薩奇病毒B組 1-6型?？刹《?1-9、11-27、29-33型新腸道病毒 68、69、70、71、72* 甲型肝炎病毒腸道病毒的致病性疾病 柯薩奇A組病毒 柯薩奇B組病毒 ?？刹《?新腸道病毒類脊髓灰質(zhì)炎 7、9型 2-5型 2、4、6、9、11、30型 71型病毒性腦炎 2、4、7、9、10型 1-5型 4、6、9、11、16、30型 70、71型心肌、心包炎 4、16型 2-5型 2-6、9、11、16、18、25型呼吸道感染 9、16、21、24型 1、3-5型 4、9、11、20、25型 68型消化道感染 1、2型 1-3、6-

57、7、11-12、18-19型流行性結(jié)膜炎 24型 1、5型 7型 70型皰疹性咽峽炎 2、4-6、8、10、16型手足口病 2、6、8、10、16型肝炎病毒肝炎病毒的定義 指以侵犯人類肝細胞為主，只引起肝炎的病毒肝炎病毒的類型病毒 病毒科 核酸類型 傳播方式HAV 小RNA病毒 正單鏈RNA 糞-口HBV 嗜肝DNA病毒 雙鏈DNA 輸血HCV 黃病毒 正單鏈RNA 輸血HDV 負單鏈RNA 輸血HEV 杯狀病毒 正單鏈RNA 糞-口HFV 糞-口HGV 黃病毒 正單鏈RNA 輸血TTV 細小病毒 負單鏈DNA 輸血肝炎病毒的傳播方式1、糞-口：HAV、HEV、HFV（流行性）2、輸血、垂直：

58、HBV、HCV、HDV、 HGV、TTV（散發(fā)性）乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒的生物學(xué)特性一、形態(tài)與結(jié)構(gòu)二、培養(yǎng)特性三、抵抗力四、抗原結(jié)構(gòu)乙型肝炎病毒的三種顆粒小球型顆粒管型顆粒Dane 顆粒乙型肝炎病毒（電鏡）Dane 顆粒三種顆粒形態(tài)與結(jié)構(gòu)1、形態(tài)：大球形顆粒Dane顆粒 小球型顆粒無核酸及DNA多聚酶 管型顆粒同小球型顆粒2、結(jié)構(gòu)：核酸雙鏈DNA、長（負）鏈、短（正）鏈 S區(qū)：編碼preS1、preS2、HBsAg C區(qū)：編碼preC、HBcAg X區(qū)：編碼HBxAg（調(diào)控蛋白） P區(qū)：編碼DNA多聚酶 蛋白：衣殼HBcAg組成 包膜含大分子、中分子、小分子三種蛋白C 區(qū)X 區(qū)S 區(qū)P 區(qū)乙

59、型肝炎病毒基因結(jié)構(gòu)模式正鏈負鏈重復(fù)序列乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)模式大分子膜蛋白中分子膜蛋白小分子膜蛋白培養(yǎng)特性1、動物接種：黑猩猩2、細胞培養(yǎng)：肝癌傳代 抵抗力1、100。C 10min、0.5%過氧乙酸滅活2、耐干燥、紫外線、低溫抗原結(jié)構(gòu)1、HBsAg：共同決定簇a 型特異決定簇 d/y w/r 四種亞型：adr、adw、ayw、ayr2、 HBcAg：衣殼抗原3、 HBeAg： 分e1、e2、e3乙型肝炎病毒的致病性與免疫性一、傳播方式二、所致疾病三、致病機制四、免疫性傳播方式1、輸血傳播2、性接觸傳播3、垂直傳播4、口-口傳播（唾液檢測HBV-DNA）致病機制病毒直接損傷感染后免疫損傷整合感染所

60、致疾病急性肝炎爆發(fā)型肝炎慢性肝炎免疫性1、保護性免疫 抗HBsAg抗體主要中和抗體 針對HBeAg的細胞免疫是清除病毒的主要機制2、免疫損傷 針對HBsAg、 HBcAg、 HBeAg的細胞免疫造成肝細胞損傷 抗HBsAg抗體可致免疫復(fù)合物損傷乙型肝炎病毒感染的診斷與防治一、微生物學(xué)檢查二、防治 標本類型：血清檢測方法：血清學(xué)診斷：“兩對半”測定 病毒核酸測定微生物學(xué)檢查HBV抗原、抗體的形成及意義0 1 2 3 4 5 6 7 8 （月）窗口期HBsAgHBeAgAnti-HBsAnti-HBeAnti-HBc潛伏期急性期恢復(fù)早期恢復(fù)晚期HBV抗原、抗體檢測的臨床意義HBsAg HBeAg