1、胡蘿卜愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系的建立和胡蘿卜愈傷組織再分化的誘導(dǎo)1學(xué)會(huì)建立胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的方法和相關(guān)操作。通過胡蘿卜懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)胡蘿卜素的整個(gè)過程，了解利用植物細(xì)胞懸?。ù罅浚┡囵B(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)有用次生代謝物這一個(gè)技術(shù)的主要流程，技術(shù)體系和注意事項(xiàng)。學(xué)會(huì)從愈傷組織誘導(dǎo)細(xì)胞再分化的原理和方法。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?胡蘿卜愈傷組織經(jīng)過多次繼代，在細(xì)胞分裂，細(xì)胞形態(tài)和分化方面會(huì)產(chǎn)生各種變化，合理調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中激素的種類和濃度配比，可以誘導(dǎo)疏松性愈傷組織的產(chǎn)生。利用愈傷組織獲得單細(xì)胞或者小細(xì)胞團(tuán)塊，可以建議細(xì)胞懸?。ù罅浚┡囵B(yǎng)的初代培養(yǎng)體系，并在此基礎(chǔ)之上進(jìn)行培養(yǎng)物的繼代和保持，進(jìn)行有用次生代謝物的生產(chǎn)。 二、

2、實(shí)驗(yàn)原理植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)3由固體培養(yǎng)轉(zhuǎn)向液體培養(yǎng)，對(duì)細(xì)胞而言有什么差別？ 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的目的和所需要的條件？一個(gè)好的培養(yǎng)體系具備什么樣的特征？4愈傷組織再分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2，4-D 0.5mg/L+KT 0.2mg/L 培養(yǎng)條件： ？5三 實(shí)驗(yàn)操作1.懸浮培養(yǎng)體系的建立 愈傷誘導(dǎo)外植體 愈傷繼代單細(xì)胞或細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)塊的獲得液體培養(yǎng)無菌 脫分化細(xì)胞分裂、分化調(diào)節(jié)方法（機(jī)械和酶法）細(xì)胞活力細(xì)胞分裂和生長分化和代謝調(diào)節(jié)培養(yǎng)基：MS+2，4-D 0.5mg/L+KT 0.5mg/L6做今天實(shí)驗(yàn)之前:前面實(shí)驗(yàn)的觀察和數(shù)據(jù)收集-胡蘿卜愈傷組織的誘導(dǎo)和生長反應(yīng)的觀察植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)報(bào)告的撰寫

3、7生長反應(yīng)觀察拍照分析有污染無污染污染源: 細(xì)菌,霉菌?現(xiàn)象?原因: 外植體?環(huán)境?操作?不生長,發(fā)白或死亡愈傷形成不生長,不死亡,也無愈傷形成發(fā)生部位顏色質(zhì)地差異原因?8實(shí)驗(yàn)報(bào)告形式內(nèi)容文字圖片數(shù)據(jù)分析討論綜合性的一篇論文分開的三次實(shí)驗(yàn)報(bào)告不同污染源導(dǎo)致的污染不同生長情況的圖片不同愈傷組織的圖片結(jié)構(gòu)上的完整性術(shù)語的正確使用存活率污染率污染原因的分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析思考和討論9具體操作：8人/組2瓶懸浮培養(yǎng)基/組約1g 細(xì)胞/瓶選擇疏松性愈傷組織稱重,計(jì)算細(xì)胞鮮重的增加(?g )無菌條件下將愈傷組織的細(xì)胞輕輕地剝離和分開接種入已預(yù)先稱重的液體培養(yǎng)基,接種后再次稱重,獲得細(xì)胞的鮮重(1g 左右)單

4、細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)塊懸浮振蕩培養(yǎng)1周或更長收集細(xì)胞,分離-提取-純化胡蘿卜素,并測(cè)定含量1.懸浮培養(yǎng)102. 再分化誘導(dǎo)8人/組2-3瓶/人建立起來的無菌培養(yǎng)物無菌條件下切割分開接種在分化培養(yǎng)基上適當(dāng)條件下培養(yǎng)1-3周培養(yǎng)反應(yīng)的觀察113 胡蘿卜素的分離提取和含量測(cè)定懸浮細(xì)胞的收集甲醇萃取 -胡蘿卜素乙醚純化 -胡蘿卜素-胡蘿卜素含量的測(cè)定12懸浮細(xì)胞的收集用紗布/濾紙過濾培養(yǎng)液收集細(xì)胞待溶液完全過濾后稱紗布/濾紙和細(xì)胞的重量將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入圓底燒瓶后再次稱紗布/濾紙重量計(jì)算細(xì)胞鮮重13甲醇萃取 -胡蘿卜素每克試樣加10ml含10%KOH的甲醇溶液水浴上加熱(64.8度以上)避光回流30min將收集好的細(xì)胞放入圓底燒瓶中14乙醚純化去除下層甲醇，保留上層乙醚溶液上清液（約10ml）放入分液漏斗加入150ml乙醚振蕩搖勻，靜止分層倒入蒸餾瓶，蒸去乙醚，殘留物用4-5ml己烷溶解15含量的測(cè)定己烷中的-胡蘿卜素在波長452