1、雙向電泳技術(shù)手冊(cè)之四:膠蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)(考染和銀染)第四章2-DE膠蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)2-DE膠蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)方法大致有：1)考馬斯亮蘭染色法；2)銀染法；3)負(fù)染法；4)熒光染色 法；5)放射性同位素標(biāo)記法等。這幾種檢測(cè)方法的靈敏度各不相同。目前最常用的是銀染法和考染法。 由于銀染的靈敏度是考染的50倍，故一般用銀染法進(jìn)行分析處理，再用考染法來進(jìn)行樣品微量制備。4.1考馬斯亮蘭染色：4.1.1經(jīng)典的考馬斯亮蘭染色程序：1固定20 % TCA1h2染色0.1% CBB in 40% EtOH/10% acetic acid2h3脫色40% EtOH&10% acetic acid2x 30 min

2、4強(qiáng)化1% acetic acidovernight5清洗deionized H2O30 min局限：靈敏度低(1gg protein/spot)4.1.2 Neuhoff膠體考染法：1固定：12%(w/v)三氯醋酸(TCA) 2h2染色：200ml染色液混合50ml甲醇 16-24h染色液：在490ml含2%(w/v)的H3PO4中加50g (NH4)2SO4直至完全溶解，再加0.5g CBB G-250 (已溶于10mlH2O中)，攪拌混合。無需過濾，使用前搖勻。3漂洗：0.1mol/L Tris-H3PO4 緩沖液(pH 6.5)漂洗兩分鐘;25%(v/v)甲醇漂洗不超過1min4穩(wěn)定：

3、在20%的(NH4)2SO4中穩(wěn)定蛋白質(zhì)一染料復(fù)合物。優(yōu)點(diǎn)：背景低，靈敏度高，可達(dá)到200ng protein/spot.4.1.3熱考馬斯亮蘭染色及二次染色法：1染色(0.025%(w/v)考馬斯亮蘭R350):將1片Phast Gel Blue藥片溶入1.6L 10%醋酸，將染色液加 熱到90C倒入凝膠染色盤，振蕩10min；2脫色：10%醋酸室溫振蕩脫色2h ,期間需多次更換脫色液，脫色液可通過鋪有活性炭的濾紙層過濾回收； 脫色液和染色液可重復(fù)使用。脫色后的凝膠可進(jìn)行掃描分析，選中的點(diǎn)可用Spot Picker自動(dòng)切膠儀挖出，再進(jìn)行后續(xù)的硝酸銀染色 可得到更多的蛋白點(diǎn)。用考馬斯亮蘭預(yù)染過

4、的膠再進(jìn)行銀染靈敏度比單獨(dú)銀染更高，且熱染過程迅速。二次染色待考馬斯亮蘭染色后的背景完全脫除后，可用以下的銀染法進(jìn)行二次染色。因?yàn)榈鞍c(diǎn)已經(jīng) 經(jīng)過固定，可直接從敏化步驟開始染色。4.2硝酸銀染色：銀染的方法種類很多，目前有文獻(xiàn)報(bào)道的就有100多種。但是其準(zhǔn)確的染色機(jī)制還不是特別的清楚。 大致的原理是銀離子在堿性pH環(huán)境下被還原成金屬銀，沉淀在蛋白質(zhì)的表面上而顯色。由于銀染的靈敏度很高，可染出膠上低于1 ng/蛋白質(zhì)點(diǎn)，故廣泛的用在2D凝膠分析上。待找到 自己感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)后，再通過考染富集該目的點(diǎn)，然后做進(jìn)一步的肽段指紋圖譜分析(PMF)或序列 測(cè)定。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，對(duì)銀染后的

5、f mol級(jí)的蛋白質(zhì)點(diǎn)直接測(cè)定已非難事。這里介紹一 種可兼容質(zhì)譜分析的銀染方法，實(shí)驗(yàn)程序如下：StepSolution (250ml per gel)Gel Type1mm unbacked1mm on film or glass support or 1.5 unbacked固定25 ml acetic acid, 100ml methanol， 125ml milli-Q water2x15 min2x60 min敏化75ml methanol, 0.5g Na2S2O3, 17g NaAc, milli-Q water to 250ml30 min60 min漂洗250ml milli-

6、Q water3x5 min5x8 min銀染0.625g AgNO3, milli-Q water to 250ml20 min60 min漂洗250ml milli-Q water2x1 min4x1 min顯色6.25g Na2CO3, 100|il formaldehyde, milli-Q water to 250ml4 min6 min終止3.65g EDTA, milli-Q water to 250 ml10 min40 min漂洗250ml milli-Q water3x5 min2x30 min銀染注意事項(xiàng)：.很多銀染程序都使用了戊二醛(glutardialdehyde)，它能提高銀染的靈敏度和染色結(jié)果的重復(fù)性，但 是因?yàn)槲於?huì)修飾蛋白質(zhì)，從而會(huì)影響對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定和分析；.保證所有的染色器皿絕對(duì)的干凈，可使用玻璃或塑料做染色器皿；.水的純度對(duì)染色結(jié)果好壞