1、微生物基礎(chǔ)閔紅陜西省食品藥品檢驗(yàn)所2015年8月15日內(nèi)容提要一、 微生物概論二、 原核微生物形態(tài)與結(jié)構(gòu)三、真核微生物形態(tài)與結(jié)構(gòu)四、微生物分類五、微生物鑒定六、 微生物營(yíng)養(yǎng)一、微生物概論1. 微生物概念微生物（microorganism）是對(duì)所有形體微小，單細(xì)胞或結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的多細(xì)胞，甚至無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物的統(tǒng)稱2. 微生物特點(diǎn)體積小，比表面積大吸收多，轉(zhuǎn)化快生長(zhǎng)旺，繁殖快適應(yīng)強(qiáng)，易變異種類多，分布廣3.微生物分類微生物的三大類群原核微生物、真核微生物、非細(xì)胞微生物二、原核微生物形態(tài)和結(jié)構(gòu)古生菌細(xì)菌三菌 放線菌原核微生物藍(lán)細(xì)菌支原體三體 立克次氏體衣原體原核微生物：一類無(wú)真正細(xì)胞核的單個(gè)細(xì)胞

2、或類似于細(xì)胞的簡(jiǎn)單組合結(jié)構(gòu)的微生物。1. 細(xì)菌概念細(xì)菌是一類個(gè)體微小、具有細(xì)胞壁的單細(xì)胞原核微生物。2.細(xì)菌形態(tài)與大小球菌2.細(xì)菌形態(tài)與大小桿菌2.細(xì)菌形態(tài)與大小螺旋菌2.細(xì)菌形態(tài)與大小2.細(xì)菌形態(tài)與大小3.細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)3.細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌與陰性細(xì)菌細(xì)胞壁構(gòu)造圖G+：肽聚糖30-95，立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)磷壁酸（PO43-）G：外壁層；脂多糖磷脂；內(nèi)壁層，肽聚糖5-203.細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu) 莢膜 鞭毛3.細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu) 芽孢某些細(xì)菌在其生長(zhǎng)發(fā)育的后期，細(xì)胞質(zhì)濃縮凝集，可在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)圓形或橢圓形的抗逆性休眠體。4.細(xì)菌菌落特征菌落(colony)：將單一微生物細(xì)胞或一小堆同種微生物細(xì)胞接

3、種到固體培養(yǎng)基表面，當(dāng)它占有一定空間并給予適宜的培養(yǎng)條件，該細(xì)胞就會(huì)迅速生長(zhǎng)繁殖。結(jié)果形成以母細(xì)胞為中心，肉眼可見(jiàn)并有一定形態(tài)構(gòu)造的子細(xì)胞集團(tuán)。菌落表述：大小、形狀、隆起、邊緣、顏色(透明)、質(zhì)地(濕潤(rùn)、光滑、粘稠、易挑起、質(zhì)地均勻)三、真核微生物形態(tài)和結(jié)構(gòu)真核微生物：是細(xì)胞核具有核膜、核仁，能進(jìn)行有絲分裂，細(xì)胞質(zhì)中存在線粒體或同時(shí)存在葉綠體等多種細(xì)胞器的一類微生物。酵母菌（單細(xì)胞真菌）真菌 霉菌（絲狀真菌）蕈菌（大型真菌）真核微生物微藻類原生動(dòng)物1.酵母菌特性個(gè)體一般以單細(xì)胞狀態(tài)存在；多數(shù)為出芽繁殖，也有裂殖；能發(fā)酵糖類產(chǎn)能；細(xì)胞壁常含甘露聚糖；喜在含糖量較高、偏酸性環(huán)境生長(zhǎng)2.酵母菌細(xì)胞形

4、態(tài)出芽生殖芽痕3.酵母菌菌落特征與細(xì)菌相似，較細(xì)菌大而厚，圓形，光滑濕潤(rùn)，粘性，易用針挑起，顏色單調(diào)(多為乳白色、少數(shù)紅色)、常有酒香味4.霉菌特性絲狀真菌的一個(gè)通俗名稱，意即“發(fā)霉的真菌”。霉菌的營(yíng)養(yǎng)體由菌絲構(gòu)成，菌絲無(wú)限生長(zhǎng)并產(chǎn)生分枝，分枝的菌絲相互交錯(cuò)在一起，形成菌絲體。5.霉菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)6.霉菌菌落特征霉菌細(xì)胞呈絲狀，在固體培養(yǎng)基上形成營(yíng)養(yǎng)菌絲和氣生菌絲。霉菌菌落較酵母菌大，質(zhì)地疏松，外觀干燥，不透明，呈現(xiàn)或蛛網(wǎng)狀、絨毛狀或棉絮狀。菌落與培養(yǎng)基連接緊密，不易挑取，常有霉味。四.微生物分類能被觀察的一些表型特征細(xì)菌在進(jìn)化中的關(guān)系人為分類法自然分類法 人為分類(artificial clas

5、sification)，又稱為傳統(tǒng)分類。是選擇一些較為穩(wěn)定的生物學(xué)性狀，如菌體形態(tài)與結(jié)構(gòu)、染色性、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)、抗原性等作為分類的基礎(chǔ)。并借助計(jì)算機(jī)將擬分類的細(xì)菌按其性狀的相似程度進(jìn)行歸類。 自然分類(natural classification)，是根據(jù)組成細(xì)菌的大分子(核酸、蛋白質(zhì)等)同源程度進(jìn)行分類。包括DNA堿基組成、核酸分子雜交和16S rRNA同源性分析，揭示了細(xì)菌進(jìn)化的信息。1.微生物分類單元分類單位與普通生物相同界(Kingdom)門(mén)(Phylum或Division)綱(C1ass)目(Order)科(Family)屬（Genus）種(Species)1.微生物分類單元在

6、主要分類單位之間加入次要分類單位如:亞門(mén)(Subdivision)亞綱(Subclass)亞屬(Subbgenus)亞種(Subspecies)變種(Varieta)有時(shí)還在種屬之間加族(Tribe)1.微生物分類單元種:親緣關(guān)系較近的微生物有機(jī)體之集合，它們?cè)谶M(jìn)化發(fā)育階段上有一定的共同形態(tài)和生理特征。現(xiàn)代分類學(xué)規(guī)定種內(nèi)菌株的DNA同源性自然界在的較小的同種微生物的同類。菌株屬同種源同的的培養(yǎng)物，其單分物的代菌株。2.細(xì)菌分類系統(tǒng)目前國(guó)際上最負(fù)盛名的細(xì)菌分類鑒定系統(tǒng)是伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)（Bergeys manual of DeterminativeBacteriology）并不強(qiáng)調(diào)細(xì)菌在進(jìn)化中

7、的相互關(guān)系，其目的在于提供為細(xì)菌鑒定用的系統(tǒng)。2.細(xì)菌分類系統(tǒng)細(xì)菌鑒定（）營(yíng)養(yǎng)類和進(jìn)行合作將其分為合細(xì)菌門(mén)和合細(xì)菌門(mén)根據(jù)形態(tài)、生理生化、生態(tài)特征、染色有無(wú)將細(xì)菌分為1分科的分形態(tài)為主屬和種的分生理生化為主，結(jié)合生態(tài)特征，細(xì)胞DNAGCmol等。2.細(xì)菌分類系統(tǒng)伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)的檢索表（第八版為例）十九個(gè)部分的檢索表亞目和科的檢索表科內(nèi)（或科）的檢索表屬內(nèi)（或?qū)伲└鞣N的檢索表補(bǔ)遺（屬或種）等Bergeys Manual of Determinative Bacteriology is a departure from past editions thatattempted, usually in

8、adequately, to combine systematic and determinative information.Systematic information will continue to be found in Bergeys Manual of SystematicBacteriology, with the Determinative manual serving as a reference to aid in theidentification of unknown bacteria.The arrangement of the book is strictly p

9、henotypic, with no attempt to offer a naturalhigher classification. The arrangement chosen is utilitarian and is intended to aid in theidentification of bacteria. The bacteria are divided into 35 groups, which arecomparable to the “Parts” in the eighth edition and the “Sections” in the Systematicvol

10、umes. These groups are not meant to be formal taxonomic ranks, but are acontinuation of our tradition of dividing the bacteria into easily recognized phenotypicgroups. We feel this arrangement is most useful for diagnostic purposes.The book was compiled by abstracting the phenotypic information cont

11、ained in the fourvolumes of Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. Introductory materialconcerning identification and a key to the groups were added. The past decade has seenan explosion in the description of new taxa of bacteria. We have attempted to include asmany of them as possible, but, in

12、a manual of this type with its varied productionschedule, not all of the new taxa could be included. For inclusion in this manual, wehad to set a cut-off date of January, 1991, for valid publication. In some cases, we havebeen able to include more recent taxa and have taken their descriptions2.細(xì)菌分類系

13、統(tǒng) “細(xì)菌鑒定”時(shí)為“系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)(Bergeys Manual of SystematicBacteriology )”( Holt et al.，1984-1989)一。 2001 二，2012 5 5 (菌)的，“”二成。2.細(xì)菌分類系統(tǒng) “”二的分類理論基礎(chǔ)為Woese等的生三系統(tǒng)-菌( Archaea )、細(xì)菌( Bacteria ) 和真核生物(Eucarya)，將分類學(xué)在16S rRNA 基系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的基礎(chǔ)上，內(nèi)包括菌和細(xì)菌的分類系統(tǒng)。 “”了菌和細(xì)菌的24 門(mén)，其菌和細(xì)菌的23 門(mén)分發(fā)“”1、2、3、4 ，一門(mén)，菌門(mén)(Actinobacteria)，發(fā)5 ，分為A、B ，Mich

14、ael Goodfellow 等主。3.真菌分類系統(tǒng) 真菌分類系統(tǒng)復(fù)雜和繁亂，曾應(yīng)用過(guò)的真菌分類系統(tǒng)有De Bary 系統(tǒng)(1884 年)、Gaumann 系統(tǒng)(1962 年)、Martin 系統(tǒng)(1950 年)、Whittaker 系統(tǒng)(1969 年)和Ainsworth 系統(tǒng)(1973年) 進(jìn)入分子生物學(xué)時(shí)代后，真菌的分類學(xué)研究異?；钴S，在Ainsworth 系統(tǒng)發(fā)表以后的30多年里，有10多個(gè)重要的分類系統(tǒng)陸續(xù)發(fā)表 目前通用的真菌分類學(xué)詞典為2008年第10 版真菌詞典(Dictionary of the Fungi) ，該書(shū)收錄并描述了大約10萬(wàn)種真菌，而且有文字記錄的真菌名稱多達(dá)40

15、萬(wàn)，其中包括大量的同物異名，此外，還有上百萬(wàn)種真菌有待于鑒定和分類3.真菌分類系統(tǒng) 傳統(tǒng)真菌分類原則：以形態(tài)學(xué)特征為主，生理生化、細(xì)胞化學(xué)和生態(tài)等特征為輔 傳統(tǒng)真菌分類的局限性： 真菌種類繁多、形態(tài)特征復(fù)雜，形態(tài)學(xué)鑒定缺乏統(tǒng)一的描述、統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，具有較大的主觀性； 少數(shù)菌種形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)受多種因素的影響而不穩(wěn)定。3.真菌分類系統(tǒng) 分子生物學(xué)技術(shù)將核酸和蛋白質(zhì)等分子生物學(xué)性狀用來(lái)探索真菌種、屬、科、目、綱、門(mén)等各級(jí)分類單元的進(jìn)化和親緣關(guān)系，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類的不足，使人們對(duì)真菌系統(tǒng)分類的認(rèn)識(shí)更加接近于客觀實(shí)際 分子生物學(xué)技術(shù)：DNA-DNA雜交、DNA堿基比例（G+Cmol%）、限制性內(nèi)切片

16、段圖譜、DNA探針、18S rRNA序列、脂肪酸組分分析、脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)（PFGE）和多位點(diǎn)序列分析（MLST）等五、微生物鑒定微生物鑒定是借助現(xiàn)有的微生物分類系統(tǒng)，通特征定，定的、或發(fā)現(xiàn)的、或分類位的細(xì)菌所應(yīng)歸屬分類的程。1.微生物鑒定依據(jù)-表型特征微生物分類中使用的表型特征特征分類培養(yǎng)物 菌落形態(tài)(菌落顏色、性狀、大小和產(chǎn)色素)細(xì)胞形態(tài)(細(xì)胞大小、細(xì)胞形態(tài)、鞭毛類型、內(nèi)容物、革蘭氏染色、芽孢和抗酸染色、孢子形成模式)形態(tài)學(xué)生理學(xué) 氧氣耐受性、pH范圍、最適溫度和范圍、耐鹽性生化反應(yīng) 碳源利用、碳水化合物的氧化或發(fā)酵、酶的模式抑制性 膽鹽耐受性、抗生素敏感性、染料耐受性血清學(xué)化學(xué)分類 脂

17、肪酸構(gòu)成、微生物毒素、全細(xì)胞組成生態(tài)學(xué) 微生物來(lái)源凝集反應(yīng)、熒光抗體形態(tài)學(xué)形態(tài)特征是細(xì)菌鑒定的重要依據(jù)之一，原因：易于觀察，尤其是具有特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)的細(xì)菌；是多基因表達(dá)，具有相對(duì)的穩(wěn)定性。缺點(diǎn)：形態(tài)學(xué)鑒定一般只能作為微生物的初步鑒定。形態(tài)觀察要選擇培養(yǎng)18-24h的幼齡菌。形態(tài)學(xué)光鏡：細(xì)菌的基本外形（大小、形狀、排列）特殊結(jié)構(gòu)（芽胞、鞭毛、莢膜）繼普通光學(xué)顯微鏡，陸續(xù)出現(xiàn)熒光顯微鏡、相差顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡和視屏顯微鏡電鏡：觀察微生物細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)和亞顯微結(jié)構(gòu)。生理學(xué)特征氧氣耐受性：氧對(duì)細(xì)菌繁殖、生理生化反應(yīng)影響很大，根據(jù)各類細(xì)菌對(duì)氧的要求分為專性好氧、專性厭氧、兼性厭氧和微需氧最適溫度和范

18、圍：不同的微生物有高溫、中溫、低溫類群存在，根據(jù)微生物生長(zhǎng)的最適溫度，可分為低溫型微生物(10-20)、中溫型微生物(20-40)和高溫型微生物(50-60)pH范圍:多數(shù)細(xì)菌喜歡中性或微堿性環(huán)境、真菌喜歡酸性環(huán)境、放線菌喜歡堿性環(huán)境生理學(xué)特征耐鹽性：嗜鹽類群最適生長(zhǎng)鹽(NaCl) 實(shí)例淡水微生物非嗜鹽微生物 0.2mol/L弱嗜鹽微生物 0.2-0.5mol/L 大多數(shù)海洋微生物中等嗜鹽微生物 0.5-2.5mol/L 某些細(xì)菌和藻類極端嗜鹽微生物 2.5-5.2mol/L 鹽桿菌和鹽球菌耐鹽微生物耐受范圍0.2- 金黃色葡萄球菌和其它葡2.5mol/L 萄球菌，耐鹽酵母菌生化反生化反應(yīng)作為

19、細(xì)菌鑒定依據(jù)的原因：生理生化特征與細(xì)菌的酶與蛋白質(zhì)有關(guān)酶與蛋白質(zhì)都是基因產(chǎn)物，測(cè)定細(xì)菌生理生化特征也是間接測(cè)定細(xì)菌的基因容易測(cè)定(與直接分析基因組比)生化反注意：不少生理生化特征是染色體外的遺傳因子編碼 影響生理生化特征表達(dá)的因素比較復(fù)雜 細(xì)菌鑒定時(shí)，需與其他特征，特別是基因型特征綜合分析，否則易導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果生化反糖、醇代謝試驗(yàn)糖、醇發(fā)酵試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（VP試驗(yàn)）、甲基紅試驗(yàn)（MR試驗(yàn)）、-半乳糖苷酶試驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)（O/F試驗(yàn))、石蕊牛奶試驗(yàn)等生化反氨基酸、蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)靛基質(zhì)試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)、苯丙

20、氨酸脫氨酶試驗(yàn)等生化反碳源和氨源利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、丙二酸鹽利用試驗(yàn)、其他有機(jī)酸鹽利用試驗(yàn)等生化反酶類試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn)、細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)、耐熱性脫氧核糖核酸試驗(yàn)、磷酸酶試驗(yàn)、卵磷脂酶試驗(yàn)、卵黃沉淀試驗(yàn)生化反其他試驗(yàn)3%氫氧化鉀試驗(yàn)、氰化鉀試驗(yàn)、綠膿菌素試驗(yàn)、42生長(zhǎng)試驗(yàn)等學(xué) 概念：異體大分子蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，能刺激機(jī)體增生丙球蛋白或致敏細(xì)胞。前者稱抗原，所增生的丙球蛋白稱為抗體?？乖c相應(yīng)的抗體之間能產(chǎn)生的特異性結(jié)合反應(yīng)，因?yàn)榭乖饕嬖谟谘逯?，所以將體外發(fā)生的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)稱為血清學(xué)試驗(yàn)。 如根據(jù)O抗原、H抗

21、原與Vi抗原將沙門(mén)菌屬分為2000個(gè)血清型。學(xué) 凝集試驗(yàn)：細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性抗原或表面覆蓋抗原的顆粒狀物質(zhì)，與相應(yīng)抗體混合后，在電解質(zhì)存在下，抗原和抗體結(jié)合，凝集成肉眼或顯微鏡可觀察到的團(tuán)塊。 熒光抗體試驗(yàn)：以熒光色素標(biāo)志抗體和抗原，使與相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合，并借助熒光顯微鏡觀察產(chǎn)生熒光的抗原抗體反應(yīng)。學(xué)局限性：只是對(duì)細(xì)菌抗原大分子表面構(gòu)型進(jìn)行分析比較，受抗原空間構(gòu)形的限制無(wú)法深入分析主要適用范圍：抗原結(jié)構(gòu)同源性高的微生物種內(nèi)血清型的分類鑒定基本不用于屬以上單位的分類及鑒定化學(xué)分類 細(xì)菌化學(xué)分類法通過(guò)化學(xué)測(cè)定，獲得各細(xì)菌組分的化學(xué)數(shù)據(jù)，依據(jù)得到的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)在種的水平上對(duì)細(xì)菌做出精確鑒

22、定。 屬的分類主要測(cè)定各種氨基酸組分。另外，還有全細(xì)胞水解液糖型分析、脂肪酸分析、磷酸類脂成分分析、枝菌酸分析、醌類分析和光合色素成分分析等，常使用紅外光譜、氣相色譜、高效液相色譜和質(zhì)譜等新技術(shù)。化學(xué)分類法 傅里葉變換紅外光譜法以未損傷細(xì)胞的傅里葉變換紅外光譜的特殊指紋區(qū)為基礎(chǔ) 不同微生物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核含有不同的蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、核酸及其它生物大分子，由于微生物中生物大分子的復(fù)雜性，不同微生物經(jīng)過(guò)FT-IR光譜分析后有其獨(dú)特的指紋圖譜，因此FT-IR法可作為一種進(jìn)行微生物快速鑒定，分類和大范圍篩選的新技術(shù)化學(xué)分類質(zhì)譜法進(jìn)行微生物鑒定具有以下特點(diǎn)： 鑒定速度快：在數(shù)分鐘內(nèi)就可獲

23、得鑒定結(jié)果 準(zhǔn)確率高：比常規(guī)微生物生化鑒定法準(zhǔn)確率高； 操作簡(jiǎn)便：只需要簡(jiǎn)單的操作就可進(jìn)行鑒定 菌庫(kù)大：較生化鑒定可鑒定的微生物種類更多，對(duì)一些用常規(guī)法難鑒定的微生物鑒定效果較好化學(xué)分類 細(xì)菌鑒定的質(zhì)譜技術(shù)包括：氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(GS-MS)技術(shù)、MALDI-TOF MS技術(shù)、基于PCR 產(chǎn)物的ESI-MS 技術(shù)等 在GS-MS 技術(shù)中經(jīng)氣相色譜柱分離后的樣品呈氣態(tài)，流動(dòng)相也是氣體，與質(zhì)譜的進(jìn)樣要求相匹配，容易將這兩種一起聯(lián)用，靈敏度和分辨度較高，可用于檢測(cè)細(xì)菌中的脂肪酸譜或小分子 MALDI-TOF MS 已發(fā)展成為一種成熟的分析方法，生物梅里埃公司和布魯克公司等多家公司的產(chǎn)品已經(jīng)常規(guī)用于

24、臨床細(xì)菌鑒定。研究表明，除細(xì)菌培養(yǎng)之外整個(gè)MALDI-TOFMS 的細(xì)菌鑒定流程可以縮減至10 min2.微生物鑒定依據(jù)-基型微生物分類學(xué)的基因型/系統(tǒng)發(fā)育的特征類別特征DNA-DNA雜交、DNA堿基比例（G+Cmol%）、限制性內(nèi)切片段圖譜、DNA探針基因型系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu) 16S rRNA、18S rRNA序列PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)；PCR經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性、延伸3個(gè)過(guò)程16S rRNA和18S rRNA 原核細(xì)胞70S核糖體中包含5S rRNA，16S rRNA，23S rRNA3種沉降系數(shù)不同的rRNA，真核生物80S核糖體中包含28S、18

25、S、5.8S和5S 4種沉降系數(shù)的rRNA，真核細(xì)胞中18S rRNA除了比16S rRNA稍長(zhǎng)且多一些臂和環(huán)結(jié)構(gòu)外，兩者空間結(jié)構(gòu)十分相似，在核糖體中起到的作用也基本相同。 16S rRNA廣泛存在于原核生物的細(xì)胞中，其基因序列由恒定區(qū)和可變區(qū)組成，恒定區(qū)序列基本保守，可變區(qū)序列因不同細(xì)菌而異，通常利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，結(jié)合PCR技術(shù)，將16S rRNA 序列擴(kuò)增出來(lái)，再利用可變區(qū)序列的差異來(lái)對(duì)不同屬、種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。DNA基例(G+Cmol%)染色體DNA的堿基比例(G+C mol%)，由于不受菌齡的影響，已成為細(xì)菌分類鑒定的重要指標(biāo)。每一種生物的DNA均有特定的G + Cmol%，

26、不同生物各不相同，生物種間親緣關(guān)系較近，則G + C mol% 差別較小，反之亦然。DNA基例(G+Cmol%)對(duì)細(xì)菌種、屬、甚至科的分類鑒定有重要意義：同種不同株：含量差別4%5%同屬不同種：含量差別10%15%不同屬，甚至不同科：差別20%30%內(nèi)圖對(duì)細(xì)菌的特定DNA片段的進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，對(duì)酶切后的電泳圖譜進(jìn)行分析，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌種間及種內(nèi)株間的分型鑒定。此技術(shù)經(jīng)常與PCR 技術(shù)結(jié)合，即PCR-RFLP技術(shù)。缺點(diǎn)：DNA 用量較大，純度要求高。一般適合于對(duì)基因組單拷貝序列進(jìn)行的鑒定。DNA-DNA(Southern ) 原理：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下可按堿基互配原則形

27、成雙鏈。由于核酸分子的高度特異性及檢測(cè)方法的靈敏性，綜合凝膠電泳和核酸內(nèi)切限制酶分析的結(jié)果，便可繪制出DNA分子的限制圖。 Southern雜交技術(shù)包括兩個(gè)主要過(guò)程：一是將待測(cè)定核酸分子通過(guò)一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上；二是固定于膜上的核酸同位素標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強(qiáng)度下退火，按堿基互配原則進(jìn)行分子雜交。DNA-DNA(Southern )DNA-DNA雜交可用于種水平的微生物鑒定同種：雜交同源性在60%以上同屬不同種：同源性在60%20%不同屬：同源性20%以下DNA探針技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)大量的目標(biāo)片段，實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)基因的平行化鑒定，從而適用于多種微

28、生物同時(shí)鑒定。目前DNA探針主要以細(xì)菌核糖體16 rRNA為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)探針。3.微生物鑒定依據(jù)-法 定反（Real-time PCR） Real-time PCR是根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，設(shè)計(jì)相應(yīng)的熒光標(biāo)記核酸探針，通過(guò)PCR反應(yīng)對(duì)靶DNA進(jìn)行定性或定量測(cè)定的技術(shù)。 Real-time PCR較普通PCR準(zhǔn)確度高，特異性好、敏感性高，不受樣品中抗菌藥物或抑菌物質(zhì)的干擾。 MLSA/MLST (點(diǎn)分/分型) 原理：根據(jù)待分型病原菌的基因組序列，針對(duì)數(shù)個(gè)持家基因設(shè)計(jì)引物，測(cè)定多個(gè)管家基因的核苷酸序列來(lái)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌鑒定及分型的方法。 優(yōu)點(diǎn)：利用基因保守基因確定細(xì)菌的分類地位，快速、準(zhǔn)確、分辨率高；操作相

29、對(duì)簡(jiǎn)便、成本低。 缺點(diǎn)：數(shù)據(jù)庫(kù)不全面；所用引物不能在每個(gè)菌種中擴(kuò)增出來(lái)，只能小范圍應(yīng)用于某些種；序列相似度的臨界值從而難以界定，因此該方法更適于分析種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。 PCR法(Rep-PCR) 重復(fù)序列PCR技術(shù)是一種細(xì)菌基因組指紋分析方法。利用細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列為引物的靶序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果的比較分析菌株基因組存在的差異。 研究報(bào)道最多的是基因外重復(fù)回文序列（REP）和腸細(xì)菌基因間共有重復(fù)序列（ERIC）二種重復(fù)序列。因?yàn)樗鼈冊(cè)诩?xì)菌基因組中存在菌株、種、屬水平上分布和拷貝數(shù)的差異，而序列本身在進(jìn)化過(guò)程中又具有較強(qiáng)的保守性，非常適合作為菌種鑒定的方法。

30、優(yōu)點(diǎn)：操作相對(duì)簡(jiǎn)單、成本低、無(wú)需特殊儀器、分辨率高。 （PFGE）脈沖場(chǎng)電泳技術(shù)（PFGE）是一種分離大分子DNA的方法。該技術(shù)借助XBa、Asc和Pst等稀有酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶將細(xì)菌基因組DNA酶切，在脈沖場(chǎng)電泳作用下可以分離20kb-1Mb間的分子片段，根據(jù)不同菌株的基因組DNA被限制性內(nèi)切酶切割后生成的分子片段不同進(jìn)行菌種鑒定和分型。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)細(xì)菌整個(gè)染色體進(jìn)行分析，分辨率高、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定可靠、易于標(biāo)準(zhǔn)化。缺點(diǎn)：操作相對(duì)復(fù)雜、成本高?；?1995年，第一個(gè)流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)基因組發(fā)表以來(lái)，作為人類基因組研究計(jì)劃的內(nèi)容之一，首先發(fā)表了大腸桿菌

31、、釀酒酵母的全基因序列，幾年內(nèi)便完成150多種微生物的全基因測(cè)序，成為生命科學(xué)發(fā)展的前言領(lǐng)域。 微生物全基因組測(cè)序是當(dāng)前國(guó)際生命科學(xué)領(lǐng)域中掌握微生物全部遺傳信息的最佳途徑，對(duì)全面了解一個(gè)物種的分子進(jìn)化，基因組成，基因調(diào)控的等方面有著非常重要的意義。鑒于全基因組測(cè)序的價(jià)格昂貴，技術(shù)落后，所以大受限制，但最近幾年隨著大規(guī)模測(cè)序技術(shù)的突破，價(jià)格直落，效率很高，一天可以搞定一個(gè)基因組，因此關(guān)于這方面的研究進(jìn)展很快，也成為微生物研究的一個(gè)重點(diǎn)。菌分型鑒定噬菌體是侵染微生物的病毒，各種噬菌體對(duì)其裂解的敏感菌具有一定特異性，因此可用于未知菌分屬和分型的鑒定例如：大腸埃希菌O111群可通過(guò)噬菌體分為9個(gè)型，O

32、55群可通過(guò)噬菌體分為8個(gè)型,還可用于沙門(mén)菌屬、霍亂弧菌、鼠疫桿菌等的鑒定、微生物物1.微生物物 水是許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶劑，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞和代謝廢物排出均以水為媒介，水能維持大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和保持酶活性。USPAPPLICATION OF WATER ACTIVITYDETERMINATION TO NONSTERILEPHARMACEUTICAL PRODUCTSReduced water activity (aw) will greatly assist in the preventionof microbial proliferation in pharmaceutical produ

33、cts1.微生物物 革蘭陰性菌包括銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和沙門(mén)菌在產(chǎn)品的水活度低于0.91時(shí)將不增殖； 革蘭陽(yáng)性菌例如金黃色葡萄球菌在產(chǎn)品的水活度低于0.86將不增殖； 黑曲霉在水活度低于0.77不增殖； 最嗜滲酵母與嗜干真菌水活度低于0.60不增殖。Table 1. Water Activities (a ) Required to Support the Growth of Representative MicroorganismswWaterWaterBacteriaActivity (aW)Molds and YeastRhyzopus nigricansActivity (aW)P

34、seudomonas aeruginosa0.970.93Bacillus cereus0.950.95Mucor plumbeus0.920.92Clostridium botulinum, Type ARhodotorula mucilaginosaEscherichia coli0.95Saccharomyces cerevisiae0.90Clostridium perfringensLactobacillus viridescens0.950.95Paecilomyces variotti0.840.83Penicillium chrysogenumSalmonella spp.0.

35、950.94Aspergillus fumigatusPenicillium glabrum0.820.81Enterobacter aerogenesBacillus subtilis0.900.93Aspergillus flavusAspergillus niger0.780.77Micrococcus lysodekticusStaphylococcus aureus0.86Zygosachharomyces rouxii0.62(osmophilic yeast)Halobacterium halobium0.75Xeromyces bisporus0.61(halophilic b

36、acterium)(xerophilic fungi)1.微生物物 提供微生物生命活動(dòng)所需碳元素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 碳源分為無(wú)機(jī)碳源和有機(jī)碳源 自養(yǎng)型微生物能以CO2作為唯一碳源，合成化合物進(jìn)而轉(zhuǎn)化為復(fù)雜的多糖、類脂、蛋白質(zhì)和核酸等細(xì)胞物質(zhì) 化能異養(yǎng)型微生物以有機(jī)碳化合物為碳源，常用的碳源物質(zhì)有糖類（單糖、寡糖和多糖）、醇類、有機(jī)酸、脂類及芳香族化合物等1.微生物物 提供微生物生長(zhǎng)繁殖所需氮素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 根據(jù)微生物對(duì)氮源利用的差異分為3個(gè)類型：1.固氮微生物：能以空氣中分子態(tài)氮作為唯一氮源，通過(guò)固氮酶系統(tǒng)將其還原為NH3，進(jìn)一步合成所需的各種有機(jī)氮化物。2.氨基酸自養(yǎng)型：能以無(wú)機(jī)氮（銨鹽、硝酸鹽和尿

37、素等）為唯一氮源，合成氨基酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)及其它含氮有機(jī)物。3.氨基酸異養(yǎng)型：不能合成某些必需的氨基酸，必需從外源提供這種氨基酸才能生長(zhǎng)。1.微生物物 能為微生物生命活動(dòng)提供最初能源來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或輻射能。有機(jī)物：化能異養(yǎng)微生物的能源(同碳源一致)無(wú)機(jī)物：化能自養(yǎng)微生物的能源(NH S、H 等)化學(xué)物質(zhì)能源3、2光能：光能自養(yǎng)和光能異養(yǎng)微生物的能源1.微生物物 分 構(gòu)成微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)； 酶活性基的組成分和酶的激活劑； 調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、pH值和氧化還原電位； 化能自養(yǎng)菌的能源（S、Fe2+） 根據(jù)微生物對(duì)礦質(zhì)元素的需要量分為：大量元素：P、S、K、Na、Ca、Mg、Fe微量元素：Cu、Zn、

38、Mn、Mo、Co、B1.微生物物 生 微生物生長(zhǎng)必需的微量有機(jī)物質(zhì) 包括維生素、氨基酸和堿基（嘧啶和嘌呤） 生長(zhǎng)因子不提供能量，也不參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成，它們大多為酶的組成分，與微生物代謝有著密切關(guān)系2.微生物類型根據(jù)碳源、能源及電子供體性質(zhì)的不同，可將絕大部分微生物分為光能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型、光能有機(jī)異養(yǎng)型、化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型、化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型四種類型。麥康凱瓊脂胨曙紅亞甲藍(lán)瓊脂胨20.0g10.0g5.0g10.0g牛肉浸出粉 3.0g乳糖乳糖10.0g5.0g牛膽鹽氯化鈉5.0g氯化鈉1%中性紅指示液 3ml曙紅鈉指示液 20ml瓊脂水14.0g亞甲藍(lán)指示液 13-16ml1000ml瓊脂14g酵母浸出粉

39、L-賴氨酸3.0g胨5.0g 5.0g木糖3.5g牛肉浸出粉5.0g乳糖乳糖7.5g10.0g牛膽鹽8.5g蔗糖7.5g枸櫞酸鈉8.5g氯化鈉5.0g枸櫞酸鐵銨脫氧膽酸鈉硫代硫酸鈉枸櫞酸鐵銨2.5g 1.0g6.8g 硫代硫酸鈉8.5g中性紅指示液 3ml0.8g甘露醇氯化鈉瓊脂胨卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基10.0g胨6.0g1.8g30.0g牛肉浸出粉 1.0g牛肉浸出粉氯化鈉甘露醇氯化鈉10.075.0g10%氯化鈉卵黃液 100ml酚磺酞指示液 2.5ml瓊脂水14.0g瓊脂水14.0g1000ml650ml溴化十六烷基三甲銨瓊脂 沙氏葡萄糖瓊脂胨10.0g40g胨10.0g3.0g葡萄糖瓊脂

40、水牛肉浸出粉氯化鈉14.0g1000ml75.0g溴化十六烷基三甲銨0.3g瓊脂水14.0g1000ml大菌(Escherichia coli)細(xì)菌分類：變形菌門(mén)(Proteobacteria)-變形菌門(mén)(Gammaproteobacteria)腸桿菌目(Enterbacteriales)腸桿菌科(Enterbacteriaceae)埃希氏菌屬(Escherichia)大腸埃希菌(Escherichia coli)細(xì)胞形態(tài)大腸埃希菌是兩端鈍圓的短小直桿菌，單個(gè)或成對(duì)，革蘭陰性無(wú)芽孢，多有鞭毛培養(yǎng)特性培養(yǎng)最適溫度為37,可在15-46生長(zhǎng)，最適pH為7.4-7.6兼性厭氧生化反應(yīng)分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇等產(chǎn)酸產(chǎn)氣不分解尿素，靛基質(zhì)陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，VP試驗(yàn)陰性，不利用枸櫞酸鹽、不分解側(cè)金盞花醇、纖維二糖、肌醇，不液化明膠，不分解淀粉與糊精菌(Salmonel